Name: patch clamp recordings in inner ear hair cells isolated from zebrafish
Uploaded: 2012-10-17T13:00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish at JoVE.com

Finansiert av NSF (0.854.551).

1. Pre-eksperimentelle Forberedelser <ol><li> Forbered seks løsninger (se tabell 1 for preparater): (a) 100 ml NZR (normal sebrafisk Ringers), (b) 50 ml NZR + Tricaine (MS222), (c) 10 ml NZR + BSA, (d) 100 ml Locas (lav Ca 2 + oppløsning), (e) 10 ml Locas + papain, (f) 100 ml K +-interne løsninger. Løsninger (a), (b), (d) og (f) kan lagres i opp til en måned ved 4 ° C. Løsninger (c) og (e) bør være forberedt dagen av eksperimentering. Alle løsningene bør være ved romtemperatur før begynnelsen eksperimenter. </li><li> Produsent og fyll fire 35 mm petriskåler omtrent halvveis med løsninger (a), (c), (d) og (e). </li><li> Lage en dissekere rett ved å fylle en 60 mm petriskål med Sylgard (Dow Corning, Midland, MI) og deretter kutte et hulrom i det som vil tillate en fisk til å sitte oppreist uten å velte. </li><li> Forberede minst to celleisolasjon verktøy ved liming hårsekken slutten av en dog hår til slutten av et glassPasteur pipette med superlim, slik at håret å forlenges forbi enden av pipetten med ca 0,5 cm. Hårene fra soft-pels hunder som Labrador retriever og Weimaraners fungere godt. </li></ol> 2. Isolering av Auditiv og Vestibularisnevritt Labyrinth <ol><li> Ofre en voksen sebrafisk ved nedsenkning i et beger med NZR + Tricaine. Visuelt overvåke gjellene til alle opercular bevegelser har opphørt. Vent ytterligere ti minutter før du tar fisk og skylle med friskt NZR. Disse prosedyrene har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité (IACUC) av Pepperdine University, men godkjenning kan skaffes fra din egen institusjon. </li><li> Pin fisken til dissekere parabolen dorsal side opp ved å sette en standard sy rett pin (ca 2,5 cm lang) gjennom hvert øye socket og en tredje pinne gjennom dorsal-ventral aksen om lag en tredjedel til halvparten av avstanden fra hodet til hale som illustrert iFigur 1A. </li><li> Under en zoom (0,62-5x) stereo disseksjonsmikroskop utstyrt med 10x okularer, bruk våren saks (Fine Science Verktøy katalognummer 15000-02) for å avsløre hjernen og en kort segment av ryggmargen ved å fjerne skallen taket fra et punkt ca 0,5 cm Caudal til nivået av gjellene frem til nesen av fisken. Skjær ryggmargen og løft hjernen med fine tang (Fine Science Verktøy katalognummer 11251-30) mens kutte spinal nerver og andre vedlegg, fjern hjernen og kast (figur 1B). </li><li> Ventral halvdelen av skallen kapsel som gjenstår danner en &quot;bolle&quot; som inneholder det indre øret organer. Observere de fremste, hvite, ugjennomsiktige otolitter i lagenas og sacculi ligger symmetrisk på caudal slutten av hver indre øret og sideveis plasserte utricle otolitter mer rostrally (Tall 1C og 4A). </li><li> Fjern bollen av bein ved å kutte alle ventrale og laterale attachments mens forsiktig løfte den ut av hodet med fine tang. Plassere den i petriskål inneholder Locas (Tall 1D og 4B). </li><li> Bruk av to par av fine pinsetter, sprekk hverandre bollen ved midtlinjen sin ved enten gripe sidekanter benet og trekke dem fra hverandre eller alternativt, separering høyre og venstre halvdeler ved å sette punktene pinsettangens i sentrum og nysgjerrige halvdelene hverandre. Fjerne de to labyrinter fra benet ved hjelp av fine pinsetter (figur 2). </li><li> Inspisere labyrintene for å identifisere auditive og vestibulære indre organer: den halvsirkelformede kanaler, utricles, sacculi og lagenas (Figur 4C). De rosa områder under hver otolith er maculae inneholder hårceller. Tilsvarende identifiserer en stripe av rosa inni ampullae av halvsirkelformet kanalene i cupula hvor hårcellene er plassert. </li><li> Fjern forsiktig otolitter fra lagena og utricle med den fine tang ( <strong&gt; Figur 2 og 4C). Det er ikke nødvendig å fjerne otolith fra saccule da dette kan skade saccular hårcellene. </li></ol> 3. Hair Cell Isolation <ol><li> Ved hjelp av en plast overføringspipetten (Fisher Scientific katalognummer 13-711-9 AM), flytte indre organer til parabolen inneholder Locas + papain minimere volumet av væske overføres. </li><li> Inkuber disse strukturene i denne løsningen i tretti minutter ved romtemperatur. </li><li> På slutten av inkubasjonstiden, flytter strukturene til parabolen inneholdende NZR + BSA og inkuberes i denne løsningen i minst tretti minutter. Hårcellene vil forbli sunt i denne løsningen for opptil fire timer, men vil svekkes etter 1-2 timer etter isolasjon (se neste trinn). </li><li> I forberedelsene til celleisolasjon, flytte en av de indre organer til parabolen inneholder NZR. </li><li> For lagenas og utricles, bruk en hund hår til å forsiktig løft av maculae ark av rosa epithelial tissue som inneholder hårcellene (figur 3A). Den maculae kan øses ut (ved hjelp av en hund hår) fra under otolitter av sacculi, og cupulae fra sine steder inne i ampullae av halvsirkelformet kanalene. </li><li> Ved å bruke to celleisolasjon verktøy fremstilt i trinn 1.4, triturate en makula eller cupula å generere en rusk feltet som inneholder hårcellene (figur 3B). La cellene minst fem minutter for å avgjøre på bunnen av fatet før den flyttes. </li><li> Flytte parabolen til scenen av en omvendt mikroskop utstyrt med fasekontrast optikk. Observere celler under 40X forstørrelse og merk mangfoldet i morfologi. Mange celler er avokado-formet, mens andre er lang og tynn. Tilstedeværelsen av apikale hårbunter identifiserer dem som hårceller og fase-lysstyrke sikrer deres helse. Photomicrographs av isolerte hårcellene er vist i Figur 5. </li></ol> 4. Patch Clamping sebrafisk hårcellene <ol><li> I forberedelsene til perfokarakter patch opptak 5,6, forberede amfotericin-holdig intern løsning som følger: sted 5 mg amfotericin B (Sigma A4888) i et 1,5 ml mikrosentrifugerør og fyll med 100 pl DMSO. Umiddelbart vortex denne løsningen i 10-20 sekunder til all amfotericin oppløses. Deretter, pipette 625 pl K +-interne løsninger inn i en andre mikrosentrifugerør. Tilsett 10 pl av den amfotericin løsningen til K +-interne løsninger og virvle som ovenfor. Bestanden amfotericin løsningen vil vare i flere timer, men kastes sluttløsningen etter én time. </li><li> Dikte patch pipetter fra BF 150-86-10 borsilikatglass (Sutter Instruments) ved hjelp av en multi-stage avtrekker (Sutter P-1000). Pipetter burde ha tips diameter på ca 2 mikrometer og vil ha motstand av 1-3 MΩ med løsningene i tabell 1. Innstillingene på avtrekker som fungerer godt er som følger: Heat = rampe minus10, Pull = 0, Velocity = 18, Delay = 1, Pressure = 600. Formentuppen av en god pipette er tydelig fra fotografiet i det innfelte c av Figur 5. Blunt &quot;bullet-formet&quot; pipettene er foretrukket som de tilbyr minst tilgang motstand under elektrofysiologiske opptak. </li><li> Bruk en 28 sporvidde Microfil sprøytenålen (MF28G-5; Verden Precision Instruments) for å fylle et opptak elektrode halvveis med amfotericin-holdige K +-intern løsning. </li><li> Fest elektroden til headstage av en patch clamp forsterker. Påfør -10 mV, 10 ms spenning trinn ved 10 Hz og opprettholde positivt trykk i elektroden som det manøvreres gjennom luft / løsningen grensesnitt og ned til bunnen av opptaket parabolen nær cellene. </li><li> Plasser elektroden ortogonalt til en sunn celle. Når elektroden er nær nok til cellen slik at det begynner å bevege seg bort fra den ut-strømmende løsning, raskt reversere trykket påføre en svak vakuum til elektroden til cellen &quot;hopper&quot; ned i den. Umiddelbart slutte sug på the elektrode og anvende en holder potensialet -70 mV til innsiden av elektroden. Innen et par sekunder en gigaohm segl vil danne. </li><li> Observere kapasitive gjeldende transienter på utbruddet og oppsigelse av spenningen trinnene som vises kort tid etter sel formasjon. Fortsette å overvåke perforasjon av membranen under elektroden ved amfotericin ved å se som transienter vokse i størrelsesorden opp til maksimal størrelse (i omtrent ti minutter). </li><li> For å bekrefte etablering av hel-celle (perforert) konfigurasjon i en frisk celle, lokke fram utover K + strøm ved å bruke hyperpolarizing og depolariserende trinn på spenning. De fleste hårcellene har fremtredende ytre strøm (se figur 6). </li></ol> 5. Representant Resultater Figur 4 viser bilder tatt under de trinn celleisolasjon. I panel A, kan otolitter knyttet til lagenas, saccluli og utricles ses through det tynne laget av bein som ligger over dem. Disse ugjennomsiktige strukturene gir praktiske landemerker til hjelp i sikker fjerning av de indre organer fra dyret under de etterfølgende trinn i disseksjon. Panel B viser &quot;bolle&quot; av bein som inneholder intakte labyrinter og fremtredende otolitter i utricles, lagenas og sacculi. Panel C viser en labyrint som har blitt fjernet fra benet. Legg merke til den store otolith med scalloped kant i lagena, den istapp-formet otolith i saccule og bønne-formet otolith i utricle. Noen av mangfoldet i størrelse og morfologi sett i celler isolert fra lagena er illustrert i Figur 5. En sunn celle er lett identifisert som fase lyse med en skarp omkrets. Celleformer kan grovt deles inn i to klasser: Avokado-formet (AVO) og lang og tynn (thn) selv om størrelsen på cellene i hver gruppe kan variere betydelig (sammenlign for eksempel avo 1 og avo 3). Innfelt en viser en klynge avtre celler som ikke var helt isolert fra hverandre. Den svarte fargen og granulært utseende av cellen i innfelte b identifiserer lett denne cellen som døde. Innsatt c viser spissen av en patch pipette illustrerer form og dimensjoner passende for opptak fra disse cellene. Gjeldende spor vist i Figur 6 ble oppnådd som reaksjon på hyperpolarizing og depolariserende trinnene av potensial som pålegges lagena celle lik avo 2 vist i figur 5. Gjeldende responser i celler i forskjellige størrelser og former kan variere mye foreslå mangfold i komplementet av spenningsstyrte kanaler. Figurene 1-3: Tegneserier illustrerer trinnene i isolering av hårcellene. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig1.jpg" /> Figur 1. Fjerning av skallen capsule inneholder det indre øret labyrinter fra sebrafisk. A. Pin ofret sebrafisk dorsal side opp til dissecting parabolen. B. Åpen skallen og ta bort hjernen. C. Observere otolitter i utricles, lagenas og sacculi. D. Fjern ventral del av skallen kapsel inneholder labyrinter. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig2.jpg" /> Figur 2. Fjerning av labyrinter fra skallen kapsel. A. Sprekk hverandre skull kapsel til midtlinjen sin. B. Fjern labyrinter fra bein. C. Fjerne otolitter fra lagenas og utricles med pinsett. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig3.jpg" /> Figur 3. Isolering av hårceller fra labyrinter. A. Forsiktig løft av maculae med en hund hår. B. Triturate maculae med to hunden hår. C. Bruk isolerte hårcellene for patch clamp. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig4.jpg" /> Figur 4. Images tatt under trinn i isoleringen av individuelle celler. A. Etter fjerning av hjernen, kan otolitter forbundet med to lagenas og sacculi (piler) og utricles (pilhoder) bli visualisert. B. Etter fjerning av ventrale parti av skallen kapsel som inneholder det indre øret organer fra dyret. Tegneserie i høyre halvdel av B identifiserer plasseringen av venstre utricle, lagena og saccule. Den stiplede linje indikerer den omtrentlige posisjonen til venstre labyrinten. C. Høyre labyrint (medial visning) D: Cartoon tegning som illustrerer viktige deler av labyrinten i C. a: anterior semisirkulær kanal, b: horisontal kanal, c: posterior kanalen, d: utricular otolith, e: saccular otolith, f: lagenal otolith. Skala bar i D representerer 1 mm for A og B, 0,5 mm for C og D. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig5.jpg" /> Figur 5 Isolerte, sunne celler fra lagena illustrerer mangfoldet av morfologi, avo:. Avocado formede celler, thn: lange, tynne celler. Inset a: klynge av tre ufullstendig isolerte celler, innfelt b: død celle, innfelt c: tuppen av patch elektrode som brukes i elektrofysiologiske opptak fra sebrafisk hårceller. Målestokk = 20 mikrometer gjelder de viktigste figuren og alle innfellinger. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig6.jpg" /> Figur 6. Currents registrert i en patch festet hår celle. Gjennomsnittlig svar i en celle (tilsvarende to avo 2 i figur 5) for å tre presentasjoner av spenning trinn anvendt i 10 mV trinn fra -140 mV til 70 mV fra en driftsenhet potensial på -70 mV. Legg merke til inaktivere strøm som vises på flere depolariserte potensialer. Voltage trinn magnitudes vises ved siden av noen av sporene.

<ol>
	<li>Lewis, R. S., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+solitary+vertebrate+hair+cells.">Voltage- and ion-dependent conductances in solitary vertebrate hair cells.</a> Nature. 304, 538-5341 (1983).</li><li>Art, J. J., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+membrane+properties+in+hair+cells+isolated+from+the+turtle+cochlea.">Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea.</a> J. Physiol. 385, 207-242 (1987).</li><li>Sugihara, I., Furukawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+aspects+of+two+different+types+of+hair+cells+in+the+goldfish+sacculus.">Morphological and functional aspects of two different types of hair cells in the goldfish sacculus.</a> J. Neurophysiol. 62, 1330-1343 (1989).</li><li>Lee, S., Briklin, O., Hiel, H., Fuchs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+inactivation+of+calcium+channels+in+cochlear+hair+cells+of+the+chicken.">Calcium-dependent inactivation of calcium channels in cochlear hair cells of the chicken.</a> J. Physiol. 583, 909-922 (2007).</li><li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method.">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> J. Gen. Physiol. 92, 145-159 (1988).</li><li>Rae, J. R., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+access+perforated+patch+recordings+using+amphotericin+B.">Low access perforated patch recordings using amphotericin B.</a> J. Neurosci. Meth. 37, 15-26 (1991).</li><li>Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Ca2++entry+through+mechanosensitive+channels+localizes+the+site+of+mechanoelectrical+transduction+in+hair+cells.">Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells.</a> Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 92, 10297-10301 (1995).</li><li>Liang, J., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gross+and+fine+dissection+of+inner+ear+sensory+epithelia+in+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Gross and fine dissection of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish (Danio rerio).</a> J. Vis Exp. 27, e1211 (2009).</li><li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog,+Rana+catesbeiana.">Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 237-274 (1988).</li><li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+electrical+resonance+and+frequency+tuning+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog,+Rana+catesbeiana.">A model for electrical resonance and frequency tuning in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 275-297 (1988).</li><li>Parsons, T. D., Lenzi, D., Almer, W., Roberts, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-triggered+exocytosis+in+an+isolated+presynaptic+cell:+capacitance+measurements+in+saccular+hair+cells.">Calcium-triggered exocytosis in an isolated presynaptic cell: capacitance measurements in saccular hair cells.</a> Neuron. 13, 875-883 (1994).</li><li>Kim, M. -. H., Vickers, E., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+capacitance+measurements+and+Ca2++imaging+at+single+nerve+terminals+in+retinal+slices.">Patch-clamp capacitance measurements and Ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices.</a> J. Vis Exp. 59, e3345 (2012).</li><li>Housley, G. D., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+the+action+of+acetylcholine+on+isolated+outer+hair+cells+of+the+guinea+pig+cochlea.">Direct measurement of the action of acetylcholine on isolated outer hair cells of the guinea pig cochlea.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. 244, 161-167 (1991).</li><li>Nicolson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+hearing+and+balance+in+zebrafish.">The genetics of hearing and balance in zebrafish.</a> Ann. Rev. Genetics. 39, 9-22 (2005).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

Forsiktig disseksjon av slutten organer og skånsom behandling av cellene er avgjørende for vellykket isolering av sunne, intakte og fysiologisk aktive hårceller. Hvis man følger følgende tips vil sikre suksess: <ol><li> Det er lettere å få tak i friske celler fra mindre fisk (2 til 2,5 cm i lengde). Større fisk har mange flere fete dråper som obskure visualisering under disseksjon prosessen. </li><li> Care må tas når du fjerner otolitter, som ligger over hårcellene. Unngå å ta på cellene når gripe otolitter med pinsett. </li><li> Best resultat oppnås når maculae og cupulae løftes bort som ark og cellene gnidd fra epitel. </li><li> Vi finne bruk av en hund hår å triturate celler å være overlegne i forhold til andre metoder, herunder ved hjelp av humane øyevipper 7 som ikke er så avsmalnet og mindre fleksibel. </li><li> Under patch festebraketter, anvendelse av overtrykk til than elektrode som det passerer gjennom luft / løsningen grensesnittet er viktig å holde spissen ren. Frigivelsen av overtrykk å aktivere cellen å &quot;hoppe&quot; på elektroden er også viktig. Denne metoden fjerner et lite volum av amfotericin-holdige løsning bort fra spissen, og dermed øker sannsynligheten for å danne en tetning med gigaohm cellen. I våre eksperimenter bruker vi den perforerte patch opptaksteknikk stedet for den mer tradisjonelle hele-celle konfigurasjon på grunn av skjørhet av cellene. Forsøk på å &quot;gå hele cellen&quot; resulterer ofte i tap av gigaohm segl. </li></ol> Metoden som er beskrevet her, vil gi flere hundre friske hårceller per dyr. Teknikken kan utføres ved romtemperatur og krever ikke noe spesielt utstyr utover et disseksjonsmikroskop. En tidligere rapport i Jove beskriver disseksjon av det indre øret i sebrafisk ved hjelp av en ventral tilnærming 8. Disse forfatterne demonstrere disseDette skjer av hele, paraformaldehyd-faste indre øret organer. Vi oppfordrer leseren til å se denne videoen for sammenligning med våre metoder. En fordel med de metodene som presenteres her er innhenting av levende celler som er nyttige for fysiologiske undersøkelser. Foruten deres bruk i patch clamp eksperimenter for å studere de spenningsstyrte kanaler (som vist her) bruk av disse cellene kan bli utvidet til å studere celle resonans 9,10, overvåke neurotransmitterfrigjørelse ved å gjøre kapasitansmålinger 11,12, undersøke neuromodulation indusert av aktivering av ligand gated kanaler 13 samt benytte seg vell av informasjon som kan være gleaned fra å bruke mutanter som påvirker både hørsel og balanse 14.

<table border="1"><tbody><tr><td> Løsning Navn </td><td> Oppskrift </td></tr><tr><td> (A) NZR (Normal Sebrafisk Ringers) (i mM) </td><td> 116 NaCl, 2 KCl, 2 2 CaCl, 3 glukose, 5 Na +-HEPES, pH 7,35. </td></tr><tr><td> (B) NZR + Tricaine </td><td> NZR + 0,02% 3-aminobenzosyre-etylester metan sulfonat (Sigma A5040). </td></tr><tr><td> (C) NZR + BSA </td><td> NZR + 0,4% Bovine Serum Albumin (Sigma A2153). </td></tr><tr><td> (D) Locas (Lav Ca 2 + Løsning) (i mM) </td><td> 100 NaCl, 2 KCl, 0,05 2 CaCl, 0.05 to MgCl, 3 glukose, 30 Na +-HEPES, pH 7,35. </td></tr><tr><td> (E) Locas + papain </td><td> Locas + 0,05% L-cystein (Sigma C1276) + 0,2% papain (Sigma P3375). </td></tr><tr><td> (F) K +-interne løsninger (i mM) </td><td> 52 K 2 SO 4,38 KCl, 1 K +-EGTA, 5 K +-HEPES, pH 7,3. </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Solutions.

patch clamp recordings in inner ear hair cells isolated from zebrafish

Patch clamp analyser av spenningsstyrte kanaler i sensoriske hårcellene isolert fra en rekke arter har blitt beskrevet tidligere 1-4 men denne videoen representerer den første anvendelsen av disse teknikkene til hår celler fra sebrafisk. Her viser vi en metode for å isolere sunne, uskadde hårcellene fra alle de indre øret indre organer: saccule, lagena, utricle og halvsirkelformet kanaler. Videre viser vi mangfoldet i håret celle størrelse og morfologi og gi et eksempel på hva slags patch clamp opptak som kan skaffes. Fordelen med bruk av denne sebrafisk modellsystem over andre stammer fra tilgjengeligheten av sebrafisk mutanter som påvirker både hørsel og balanse. I kombinasjon med bruk av transgene linjer og andre teknikker som utnytter genetisk analyse og manipulasjon, cellen isolasjon og elektrofysiologiske metoder introdusert her bør rette for større innsikt i roller hårcellene plå i formidling disse sensoriske modaliteter.

Watch this Scientific Journal Video about Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish at JoVE.com

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish (Video) | JoVE

Formålet med denne videoen er å demonstrere prosedyrer for å innhente sunne, intakte hårceller fra det indre øret organer av voksen sebrafisk og deretter bruke dem for patch clamp studier med sikte på å karakterisere biofysiske egenskaper deres spenningsstyrte kanaler.

Patch Clamp Recordings i Indre ørehår celler isolert fra sebrafisk

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation (Video) | JoVE

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish (Video) | JoVE

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse (Video) | JoVE

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry (Video) | JoVE

Isolere LacZ-uttrykke Celler fra Mouse Inner Ear Vev bruker flowcytometrisystemer

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation (Video) | JoVE

Genoverføring til Developing Mouse indre øret ved<em&gt; In Vivo</em&gt; Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents (Video) | JoVE

Isolering av sensoriske nevroner av<em&gt; Aplysia californica</em&gt; For Patch Clamp Recordings i glutamaterg Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells (Video) | JoVE

Patch Clamp Recordings fra embryonale Sebrafisk Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons (Video) | JoVE

Hel-celle Patch-clamp Opptak fra Morphologically- og Neurochemically-identifiserte hippocampus interneuroner

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings (Video) | JoVE

Elektro og Morfologisk Karakterisering av Nevronale kretser i Akutt Brain Slices hjelp Grupperte patch-clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices (Video) | JoVE

Hel-celle Patch-clamp Recordings i hjernen skiver

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...