Name: bacterial detection &amp; identification using electrochemical sensors
Uploaded: 2013-04-23T12:00:00
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Diese Studie wurde von Cooperative Agreement Auszeichnung AI075565 (bis DAH) von der National Institute of Allergy and Infectious Diseases und durch die Wendy und Ken Rubin Fund for Excellence in Pediatric Urology Forschung gefördert. BMC ist die Judith und Robert Winston Chair in Pediatric Urology.

1. Funktionalisierung von Elektrochemische Sensoren <ol><li> Vorbereiten des thiolierten Fangsonde mit einer Konzentration von 0,05 uM in 300 uM 1,6-Hexandithiol (HDT), 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA und Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur für 10 min . Inkubation der thiolierten Einfangsonde mit HDT sorgt dafür, dass die Thiolgruppe auf der Capture-Sonde reduziert wird, was zu mehr konsistente Ergebnisse. </li><li> Tragen Sie einen Stickstoffstrom auf blankem Gold 16 Sensorarraychips (e) für 5 S...

<ol>
	<li>Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ternary+Surface+Monolayers+for+Ultrasensitive+(Zeptomole)+Amperometric+Detection+of+Nucleic+Acid+Hybridization+without+Signal+Amplification.">Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification.</a> Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).</li><li>Halford, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Antimicrobial+Susceptibility+Testing+by+Sensitive+Detection+of+Precursor+Ribosomal+RNA+Using+a+Novel+Electrochemical+Biosensing+Platform.">Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 56, (2012).</li><li>Campuzano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ternary+monolayers+as+DNA+recognition+interfaces+for+direct+and+sensitive+electrochemical+detection+in+untreated+clinical+samples.">Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples.</a> Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).</li><li>Gau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+molecular+analysis+without+nucleic+acid+amplification.">Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification.</a> Methods. 37, 73-83 (2005).</li><li>Patel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+Specific+Capture+Enhances+Sensitivity+of+Electrochemical+Detection+of+Bacterial+Pathogens.">Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).</li><li>Mastali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+probe+length+and+target+location+for+electrochemical+detection+of+selected+uropathogens+at+ambient+temperature.">Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature.</a> J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).</li><li>Liao, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electrochemical+DNA+biosensors+for+rapid+molecular+identification+of+uropathogens+in+clinical+urine+specimens.">Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).</li><li>Liao, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+advanced+electrochemical+DNA+biosensor+for+bacterial+pathogen+detection.">Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection.</a> J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).</li><li>Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroanalytical+sensors+and+devices+for+multiplexed+detection+of+foodborne+pathogen+microorganisms.">Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms.</a> Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).</li><li>Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+disposable+nucleic+acid+biosensors+for+direct+bioelectronic+detection+in+raw+biological+samples.">Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples.</a> Talanta. 85, 1330-1337 (2011).</li><li>Ecker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibis+T5000:+a+universal+biosensor+approach+for+microbiology.">Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology.</a> Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).</li><li>Casalta, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+LightCycler+SeptiFast+test+in+the+rapid+etiologic+diagnostic+of+infectious+endocarditis.">Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).</li></ol>

Der elektrochemische Sensor beschriebenen Test hier ermöglicht die schnelle Detektion von Nukleinsäure-Targets. Sensitivität und Spezifität hängen teilweise von der freien Energie der Target-Sonden-Hybridisierung, die ihrerseits abhängig von der Länge und GC-Gehalt der Erfassung und der Fühler. Wir üblicherweise die Schritte Hybridisierung bei Raumtemperatur (~ 20 ° C) 5, 6. Jedoch können die Hybridisierung der Schritte (3.2 und 3.3) auch bei höheren Temperaturen in einem Wärmeschrank durchgefüh...

Mit rRNA als Zielmolekül für bakterielle Nachweis und zur Identifizierung hat eine Reihe von Vorteilen. Die Fülle der rRNA in bakteriellen Zellen sorgt für eine Nachweisgrenze von nur 250 Bakterien pro Milliliter, ohne die Notwendigkeit für Zielamplifikation 1. Bakterielle rRNA enthält eindeutige Spezies-spezifischen Sequenzen, die zugänglich Hybridisierung mit DNA-Sonden sind. Folglich kann eine Anordnung von elektrochemischen Sensoren verwendet werden, um unbekannte Bakterien, wobei jeder Sensor mit einer unterschiedlichen Spezies-spezifische Fangsonde funktionalisierte identifizieren. Positive Control-Sensoren sollten für ein synthetisches Oligonukleotid Ziel, dass &quot;Brücken&quot; die Gefangennahme und der Fühler eine interne Kalibrierung zu erzeugen einbezogen werden. Elektrochemische Sensoren haben eine breite Palette von Grundlagenforschung und translationale Forschung. Zum Beispiel beschriebene Test hier wurde verwendet, um präzise die Wirkung von E. coli Wachstumsphase auf RRnA und pre-rRNA Kopie Zahlen, die von großem Interesse für die Forscher in der bakteriellen Physiologie 2 interessiert ist. Die Empfindlichkeit des elektrochemischen Sensors Assay wird durch das Signal-Rausch-Verhältnis bestimmt. Eine Vielzahl von Signalverstärkung und Rauschunterdrückung Methoden erforscht worden. Wir finden, dass die Verbesserung der Chemie der Sensoroberfläche Schlüssel zur Verringerung der unspezifischen Bindung von Detektor-Sonde und / oder HRP-Enzym. Insbesondere wurde eine gemischte Monoschicht Alkandithiolen und Mercaptohexanol erwiesen Hintergrund durch Abdecken der Elektrodenoberfläche vollständiger Beibehaltung Zugänglichkeit der Einfang-Sonde für Zielhybridisierung 3 zu reduzieren. Diese Oberflächenchemie Behandlungen sind besonders wichtig für die Assays, die komplexen biologischen Proben.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-mercapto-1-hexanol (MCH)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>451088</td>
 <td>Store at room temperature</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,6-hexanedithiol (HDT)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>H-12005</td>
 <td>Store at room temperature</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thiolated capture probes</td>
 <td>Operon</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Store at 100 &mu;M in 0.1x TE at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescein-modified detector probes</td>
 <td>Operon</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Store at 100 &mu;M in 0.1x TE at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bridging Oligonucleotide</td>
 <td>Operon</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Store at 100 &mu;M in 0.1x TE at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11 426 346 910</td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Helios Chip Reader</td>
 <td>GeneFluidics</td>
 <td>GFR-2009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sensor Chip Mount</td>
 <td>GeneFluidics</td>
 <td>GFR-003</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Film well sticker</td>
 <td>GeneFluidics</td>
 <td></td>
 <td>Shipped with sensor chips</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bare gold 16-sensor array chips </td>
 <td>GeneFluidics</td>
 <td>SC1000-16X-B </td>
 <td>Store in 100% N2 at room temperature</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine Serum Albumin </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A7906 </td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1M Phosphate Buffer, pH 7.2 </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Blocker Casein in PBS </td>
 <td>Pierce</td>
 <td>37528 </td>
 <td>Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 1. Reagents and Equipment.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

bacterial detection &amp; identification using electrochemical sensors

Elektrochemische Sensoren sind weit verbreitet für die schnelle und genaue Messung des Blutzuckerspiegels verwendet werden und kann für den Nachweis einer Vielzahl von Analyten angepasst werden. Elektrochemische Sensoren arbeiten nach Transduktion einer biologischen Erkennung Veranstaltung in ein nützliches elektrisches Signal um. Die Signalübertragung erfolgt durch Koppeln der Aktivität eines Redox-Enzym zu einer amperometrischen Elektrode. Sensor Spezifität entweder eine inhärente Eigenschaft des Enzyms Glucoseoxidase bei einer Glucose-Sensor, oder ein Produkt der Verknüpfung zwischen dem Enzym und einem Antikörper oder der Sonde. Hier beschreiben wir einen elektrochemischen Sensor Assay-Verfahren direkt zu erfassen und zu identifizieren Bakterien. In jedem Fall sind die hier beschriebenen DNA-Sonden-Oligonukleotide. Diese Methode basiert auf Sandwich-Hybridisierung von capture und der Fühler mit Ziel ribosomalen RNA (rRNA) basiert. Die Fänger-Sonde an den Sensor Oberfläche verankert, während der Detektor-Sonde an h gebunden istorseradish Peroxidase (HRP). Wenn ein Substrat, wie 3,3 &#39;, 5,5&#39;-Tetramethylbenzidin (TMB) mit einer Elektrode mit capture-Ziel-Detektor Komplexe gebunden an dessen Oberfläche zugegeben wird, wird das Substrat durch HRP oxidiert und reduziert durch die Arbeitselektrode. Das Redox-Zyklus führt pendelt der Elektronen durch das Substrat von der Elektrode zum HRP, wodurch Strom in der Elektrode.

Wir beschreiben einen elektrochemischen Assay, ähnlich einer Sandwich-ELISA strukturiert. Wie in 1, Ziel ribosomalen RNA (rRNA) Hybridisierung mit Erfassung und der Fühler durch eine Redox-Reaktion katalysiert HRP konjugiert an Anti-Fluorescein-Antikörper-Fragmente, die an das 3&#39;-Fluorescein-Verknüpfung gebunden auf dem Detektor-Sonde entwickelt gezeigt. Ein wichtiger Bestandteil der Empfindlichkeit des Assays ist die Oberflächenchemie des Goldelektrode. Wir haben gefunden, dass eine ternäre M...

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Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Wir beschreiben einen elektrochemischen Sensor Testverfahren zum schnellen Nachweis von Bakterien und Identifikation. Der Test umfasst eine Sensoranordnung mit DNA-Oligonukleotid-Capture-Sonden für die ribosomale RNA (rRNA) artspezifische Sequenzen funktionalisiert. Sandwich-Hybridisierung der Ziel-rRNA mit dem Capture-Sonde und einem Meerrettichperoxidase-linked DNA-Oligonukleotid Detektorsonde erzeugt eine messbare amperometrischen Strom.

Bakterielle Erkennung und Identifizierung mit elektrochemischen Sensoren

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Charakterisierung Bakterielle Flüchtige mit Secondary Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie (SESI-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

Forschung

Biotechnik

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Herstellung von elektrochemischen DNA Biosensoren für die Reagenzienfreier Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und kleinen Molekülen

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Erkennung und Isolierung von zirkulierenden Melanomzellen mit Photoakustische Flowmetrie

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

Hohle Mikronadel-basierten Sensor für Multiplex Transdermale elektrochemische Nachweis

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

Erkundung der Barrier Gewebestörung mit einem organischen Transistor Elektro

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Glutamin Flux Imaging Verwendung genetisch codierten Sensoren

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Einem mikrofluidischen Biochip-basierte Elektrochemische für Markierungsfreie DNA-Hybridisierungsanalyse

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Flying Insect Detection and Classification with Inexpensive Sensors

Fliegen-Insekt Erkennung und Klassifizierung mit preiswerten Sensoren

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Markierungsfreie Einzelmoleküldetektion Mit Mikrotoroid optischen Resonatoren

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Mehrfarbenfluoreszenzdetektion für Droplet Mikrofluidik Verwendung von Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...