Name: bacterial detection &amp; identification using electrochemical sensors
Uploaded: 2013-04-23T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors at JoVE.com

Denne studien ble støttet av samarbeidsavtale Award AI075565 (til DAH) fra National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer og ved Wendy og Ken Ruby Fund for Excellence in Pediatric Urology Research. BMC er Judith og Robert Winston Chair i Pediatric Urology.

En. Funksjonalisering av elektrokjemiske sensorer <ol><li> Klargjør tiolerte capture probe ved en konsentrasjon på 0,05 mM i 300 mM 1,6-hexanedithiol (HDT), 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0.3 M NaCl, 1 mM EDTA og inkuberes i mørke ved romtemperatur i 10 min . Inkubering av den tiolerte capture probe med HDT sikrer at tiolgruppe på fangst proben reduseres, noe som resulterer i mer konsistente resultater. </li><li> Anvende en nitrogenstrøm for å bart gull 16 sensorgruppe brikken (e) i 5 sekunder for å fjerne fuktighet o...

<ol>
	<li>Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ternary+Surface+Monolayers+for+Ultrasensitive+(Zeptomole)+Amperometric+Detection+of+Nucleic+Acid+Hybridization+without+Signal+Amplification.">Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification.</a> Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).</li><li>Halford, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Antimicrobial+Susceptibility+Testing+by+Sensitive+Detection+of+Precursor+Ribosomal+RNA+Using+a+Novel+Electrochemical+Biosensing+Platform.">Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 56, (2012).</li><li>Campuzano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ternary+monolayers+as+DNA+recognition+interfaces+for+direct+and+sensitive+electrochemical+detection+in+untreated+clinical+samples.">Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples.</a> Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).</li><li>Gau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+molecular+analysis+without+nucleic+acid+amplification.">Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification.</a> Methods. 37, 73-83 (2005).</li><li>Patel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+Specific+Capture+Enhances+Sensitivity+of+Electrochemical+Detection+of+Bacterial+Pathogens.">Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).</li><li>Mastali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+probe+length+and+target+location+for+electrochemical+detection+of+selected+uropathogens+at+ambient+temperature.">Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature.</a> J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).</li><li>Liao, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electrochemical+DNA+biosensors+for+rapid+molecular+identification+of+uropathogens+in+clinical+urine+specimens.">Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).</li><li>Liao, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+advanced+electrochemical+DNA+biosensor+for+bacterial+pathogen+detection.">Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection.</a> J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).</li><li>Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroanalytical+sensors+and+devices+for+multiplexed+detection+of+foodborne+pathogen+microorganisms.">Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms.</a> Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).</li><li>Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+disposable+nucleic+acid+biosensors+for+direct+bioelectronic+detection+in+raw+biological+samples.">Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples.</a> Talanta. 85, 1330-1337 (2011).</li><li>Ecker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibis+T5000:+a+universal+biosensor+approach+for+microbiology.">Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology.</a> Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).</li><li>Casalta, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+LightCycler+SeptiFast+test+in+the+rapid+etiologic+diagnostic+of+infectious+endocarditis.">Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).</li></ol>

Den elektrokjemiske sensoren analysen beskrevet her muliggjør rask deteksjon av nukleinsyre-mål. Sensitivitet og spesifisitet avhenger blant annet av den frie energien av target-probe hybridisering, som igjen avhenger av lengden og GC innholdet på fangst og detektor sonder. Vi utfører vanligvis hybridisering trinn ved romtemperatur (~ 20 ° C) 5, 6. Imidlertid kan hybridiserings-fremgangsmåten (3.2 og 3.3) også utføres ved høyere temperaturer i en hybridiserings-ovn hvis brikken er plassert i en dekke...

Ved hjelp av rRNA som et målmolekyl for bakteriell påvisning og identifikasjon har en rekke fordeler. Utbredelsen av rRNA i bakterieceller gir en følsomhet grense så lav som 250 bakterier per milliliter uten behov for en target amplifikasjon. Bakteriell rRNA inneholder unike artsspesifikke sekvenser som er tilgjengelige for hybridisering med DNA-prober. Følgelig kan en rekke elektrokjemiske sensorer brukes til å identifisere ukjente bakterier, hvor hver sensor funksjonaliseres med et annet artsspesifikk capture probe. Positive kontroll sensorer bør inkluderes for et syntetisk oligonukleotid mål som &quot;broer&quot; Fangst og detektor sonder for å skape en intern kalibrering signal. Elektrokjemiske sensorer har et bredt spekter av grunnleggende og translasjons forskning. For eksempel beskrev analysen her er brukt til å nøyaktig måle effekten av E. coli vekstfase på RRNA og pre-rRNA kopiere numre, som er av stor interesse for forskere interessert i bakteriell fysiologi to. Følsomheten av elektrokjemisk sensor analysen bestemmes av signal til støyforhold. En rekke signal forsterkning og støyreduksjon har vært utprøvd. Vi finner at forbedring av kjemien i sensorflaten er nøkkelen til å redusere ikke-spesifikk binding av proben detektor-og / eller HRP-enzymet. Spesielt har en blandet monolag av alkanedithiols og mercaptohexanol blitt funnet å redusere bakgrunnsstøyen ved å dekke elektrodeoverflaten mer fullstendig og samtidig beholde tilgjengelighet av capture probe til target hybridisering 3.. Disse overflatekjemi behandlingene er spesielt viktig for analyser som involverer komplekse biologiske prøver.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-mercapto-1-hexanol (MCH)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>451088</td>
 <td>Store at room temperature</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,6-hexanedithiol (HDT)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>H-12005</td>
 <td>Store at room temperature</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thiolated capture probes</td>
 <td>Operon</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Store at 100 &mu;M in 0.1x TE at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescein-modified detector probes</td>
 <td>Operon</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Store at 100 &mu;M in 0.1x TE at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bridging Oligonucleotide</td>
 <td>Operon</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Store at 100 &mu;M in 0.1x TE at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11 426 346 910</td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Helios Chip Reader</td>
 <td>GeneFluidics</td>
 <td>GFR-2009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sensor Chip Mount</td>
 <td>GeneFluidics</td>
 <td>GFR-003</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Film well sticker</td>
 <td>GeneFluidics</td>
 <td></td>
 <td>Shipped with sensor chips</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bare gold 16-sensor array chips </td>
 <td>GeneFluidics</td>
 <td>SC1000-16X-B </td>
 <td>Store in 100% N2 at room temperature</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine Serum Albumin </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A7906 </td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1M Phosphate Buffer, pH 7.2 </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Blocker Casein in PBS </td>
 <td>Pierce</td>
 <td>37528 </td>
 <td>Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 1. Reagents and Equipment.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

bacterial detection &amp; identification using electrochemical sensors

Elektrokjemiske følere er mye brukt for hurtig og nøyaktig måling av blodglukose og kan tilpasses for påvisning av en rekke forskjellige analytter. Elektrokjemiske sensorer opererer ved transdusering av en biologisk gjenkjennelse hendelse til en nyttig elektrisk signal. Signaltransduksjon oppstår ved kobling av aktiviteten til et enzym til en redoks-elektrode amperometrisk. Sensor spesifisitet enten er en iboende egenskap av enzymet, glukose oksidase i tilfelle av en glukose-sensor, eller et produkt av sammenheng mellom enzym og et antistoff eller sonde. Her beskriver vi en elektrokjemisk sensor assay metode til direkte å påvise og identifisere bakterier. I hvert fall sondene som er beskrevet her er DNA-oligonukleotider. Denne metoden er basert på brødskiven hybridisering av fangst og detektor prober med target ribosomal RNA (rRNA). Den capture probe er forankret til sensoroverflaten, mens detektoren sonde er knyttet til horseradish peroksidase (HRP). Når et substrat slik som 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tetrametylbenzidin (TMB) tilsettes til en elektrode med fangst-target-påviserkomplekser bundet til sin overflate, er substratet oksidert av HRP og redusert ved arbeidselektroden. Dette redoks syklus resulterer i skytteltrafikk av elektroner i det substrat fra elektroden til HRP, produsere strømgjennomgang i elektroden.

Vi beskriver en elektrokjemisk analyse som er strukturert i likhet med en sandwich ELISA. Som vist i figur 1, target ribosomal RNA (rRNA) hybridisering med fangst-og detektor prober er utviklet av en redoks-reaksjon katalysert av HRP-konjugert anti-fluorescein antistoff-fragmenter som binder til 3&#39;-fluorescein linkage på detektoren probe. En viktig komponent av assay følsomhet er overflatekjemi av gull-elektroden. Vi har funnet at en ternær monolag bestående av tiolert capture sonder, mercaptohe...

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors at JoVE.com

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Vi beskriver en elektrokjemisk sensor assay metode for deteksjon og rask bakteriell identifikasjon. Analysen innebærer en sensor array funksjonaliseres med DNA oligonukleotide fangst prober for ribosomale RNA (rRNA) artsspesifikke sekvenser. Sandwich hybridisering av target rRNA med fangst sonde og en pepperrotperoksidase-linked DNA oligonukleotid detektor probe produserer en målbar amperometrisk strøm.

Bakteriell Detection &amp; Identification hjelp elektrokjemiske sensorer

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Deteksjon og Isolering av Sirkulerende Melanom Cells bruke photoacoustic Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

Hollow microneedle-baserte Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

Sensing of Barrier vevsdesintegrasjon med en organisk Elektrokjemisk Transistor

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Glutamin Flux Imaging Bruke genetisk er kodet Sensorer

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

En microfluidic basert Elektrokjemisk biochip for Label-free DNA Hybridisering Analyse

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Flying Insect Detection and Classification with Inexpensive Sensors

Flying Insect Detection og klassifisering med Inexpensive Sensorer

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Etikett-free enkelt molekyl Detection Bruke Microtoroid Optiske resonatorer

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Bruke optiske fibre

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...