Name: bacterial detection &amp; identification using electrochemical sensors
Uploaded: 2013-04-23T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors at JoVE.com

Denna studie stöddes av samarbetsavtal Award AI075565 (till DAH) från det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar samt av Wendy och Ken Rubin Fund for Excellence in Pediatric Urology Research. BMC är Judith och Robert Winston Stol i Pediatric Urology.

Ett. Funktionalisering av elektrokemiska sensorer <ol><li> Förbered tiolerade infångningsproben vid en koncentration av 0,05 pM i 300 ^ M 1,6-hexanditiol (HDT), 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA och inkubera i mörker vid rumstemperatur under 10 min . Inkubation av tiolerade infångningsproben med HDT säkerställer att tiolgruppen på infångningsproben reduceras, vilket resulterar i mer konsekventa resultat. </li><li> Applicera en kväveström för att nakna guld 16 sensoruppsättning chip (er) för 5 ...

<ol>
	<li>Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ternary+Surface+Monolayers+for+Ultrasensitive+(Zeptomole)+Amperometric+Detection+of+Nucleic+Acid+Hybridization+without+Signal+Amplification.">Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification.</a> Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).</li><li>Halford, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Antimicrobial+Susceptibility+Testing+by+Sensitive+Detection+of+Precursor+Ribosomal+RNA+Using+a+Novel+Electrochemical+Biosensing+Platform.">Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 56, (2012).</li><li>Campuzano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ternary+monolayers+as+DNA+recognition+interfaces+for+direct+and+sensitive+electrochemical+detection+in+untreated+clinical+samples.">Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples.</a> Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).</li><li>Gau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+molecular+analysis+without+nucleic+acid+amplification.">Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification.</a> Methods. 37, 73-83 (2005).</li><li>Patel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+Specific+Capture+Enhances+Sensitivity+of+Electrochemical+Detection+of+Bacterial+Pathogens.">Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).</li><li>Mastali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+probe+length+and+target+location+for+electrochemical+detection+of+selected+uropathogens+at+ambient+temperature.">Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature.</a> J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).</li><li>Liao, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electrochemical+DNA+biosensors+for+rapid+molecular+identification+of+uropathogens+in+clinical+urine+specimens.">Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).</li><li>Liao, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+advanced+electrochemical+DNA+biosensor+for+bacterial+pathogen+detection.">Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection.</a> J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).</li><li>Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroanalytical+sensors+and+devices+for+multiplexed+detection+of+foodborne+pathogen+microorganisms.">Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms.</a> Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).</li><li>Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+disposable+nucleic+acid+biosensors+for+direct+bioelectronic+detection+in+raw+biological+samples.">Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples.</a> Talanta. 85, 1330-1337 (2011).</li><li>Ecker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibis+T5000:+a+universal+biosensor+approach+for+microbiology.">Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology.</a> Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).</li><li>Casalta, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+LightCycler+SeptiFast+test+in+the+rapid+etiologic+diagnostic+of+infectious+endocarditis.">Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).</li></ol>

Den elektrokemiska sensorn analys som beskrivs här möjliggör snabb upptäckt av nukleinsyramål. Känslighet och specificitet beror delvis på den fria energin för mål-sondhybridisering, vilket i sin tur beror på längden och GC-halten av avskiljning och sonder detektor. Vi utför typiskt hybridiserings stegen vid omgivande temperatur (~ 20 ° C) 5, 6. Däremot kan hybridisering stegen (3.2 och 3.3) även genomföras vid högre temperaturer i en hybridiseringsugn om chipset placeras i en täckt kammare ...

Använda rRNA som en målmolekyl för bakteriell detektion och identifiering har ett antal fördelar. Överflödet av rRNA i bakterieceller föreskrivs en känslighetsgräns så lite som 250 bakterier per milliliter utan behov av målamplifiering 1. Bakteriell rRNA innehåller unika artspecifika sekvenser som är tillgängliga för hybridisering med DNA-sonder. Följaktligen kan en uppsättning av elektrokemiska sensorer användas för att identifiera okända bakterier, där varje sensor är funktionaliserad med en annan artspecifik infångningsprob. Positiva-sensorer bör ingå för en syntetisk oligonukleotid mål som &quot;broar&quot; avskiljning och sonder detektor för att skapa en intern kalibrering signal. Elektrokemiska sensorer har ett brett utbud av bastjänster och translationell forskning tillämpningar. Till exempel beskrivs analysen här har använts för att exakt mäta effekten av E. coli tillväxtfas på rrnA och pre-rRNA kopiera nummer, vilket är av stort intresse för forskare som är intresserade av bakteriell fysiologi 2. Känsligheten hos elektrokemiska sensorn analysen bestäms av signal-brusförhållandet. En mängd olika signalförstärkning och buller metoder minskning har utforskats. Vi finner att förbättra kemi sensorytan är nyckeln till att minska ospecifik bindning av detektorsonden och / eller HRP enzymet. I synnerhet, har en blandad monolager av alkanedithiols och mercaptohexanol befunnits reducera bakgrunden genom att täcka elektroden ytan mer fullständigt bibehållen tillgänglighet infångningsproben för mål hybridisering 3. Dessa ytkemi behandlingar är särskilt viktigt för analyser som inbegriper komplexa biologiska prover.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-mercapto-1-hexanol (MCH)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>451088</td>
 <td>Store at room temperature</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,6-hexanedithiol (HDT)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>H-12005</td>
 <td>Store at room temperature</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thiolated capture probes</td>
 <td>Operon</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Store at 100 &mu;M in 0.1x TE at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescein-modified detector probes</td>
 <td>Operon</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Store at 100 &mu;M in 0.1x TE at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bridging Oligonucleotide</td>
 <td>Operon</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Store at 100 &mu;M in 0.1x TE at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11 426 346 910</td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Helios Chip Reader</td>
 <td>GeneFluidics</td>
 <td>GFR-2009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sensor Chip Mount</td>
 <td>GeneFluidics</td>
 <td>GFR-003</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Film well sticker</td>
 <td>GeneFluidics</td>
 <td></td>
 <td>Shipped with sensor chips</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bare gold 16-sensor array chips </td>
 <td>GeneFluidics</td>
 <td>SC1000-16X-B </td>
 <td>Store in 100% N2 at room temperature</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine Serum Albumin </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A7906 </td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1M Phosphate Buffer, pH 7.2 </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Blocker Casein in PBS </td>
 <td>Pierce</td>
 <td>37528 </td>
 <td>Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 1. Reagents and Equipment.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

bacterial detection &amp; identification using electrochemical sensors

Elektrokemiska sensorer används ofta för snabb och noggrann mätning av blodglukos och kan anpassas för detektion av en mängd olika analyter. Elektrokemiska sensorer fungerar genom att överföra en biologisk erkännande händelse till en användbar elektrisk signal. Signaltransduktion sker genom koppling av aktiviteten av ett redox-enzym till en amperometrisk elektrod. Sensor specificitet är antingen en inneboende egenskap av enzymet, glukosoxidas i fallet med en glukossensor, eller en produkt av bindning mellan enzymet och en antikropp eller prob. Här beskriver vi en elektrokemisk metod sensor analys för att direkt upptäcka och identifiera bakterier. I varje fall de sonder som beskrivs här är DNA-oligonukleotider. Denna metod är baserad på sandwich-hybridisering av avskiljning och detektor sonder med målet ribosom RNA (rRNA). Den infångande sonden är förankrad till sensorytan, medan detektorn sonden är kopplad till horseradish peroxidas (HRP). När ett substrat, såsom 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tetrametylbensidin (TMB) sätts till en elektrod med capture-target-detektor komplexen bundna till dess yta är substratet oxideras av HRP och reduceras av arbetselektroden. Denna redox körcykelresultat i shuttling av elektroner av substratet från elektroden till HRP, producerar strömflöde i elektroden.

Vi beskriver en elektrokemisk analys som är strukturerad på liknande sätt som en sandwich-ELISA. Såsom visas i figur 1, mål-ribosomalt RNA (rRNA) hybridisering med avskiljning och detektor prober är framtagen av ett redox-reaktion katalyserad av HRP konjugerad till anti-fluorescein-antikroppsfragment som binder till 3&#39;-fluorescein länksystem på detektorn sonden. En viktig komponent i analyskänsligheten är ytkemin hos guldelektroden. Vi har funnit att en ternär monoskikt bestående av tiol...

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors at JoVE.com

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Vi beskriver en elektrokemisk metod sensor analys för snabb bakteriell detektion och identifiering. Analysen omfattar en sensor array med funktionella fånga DNA oligonukleotidsonder för ribosom RNA (rRNA) artspecifika sekvenser. Sandwich hybridisering av mål-rRNA med infångningsproben och en pepparrotsperoxidas-länkad DNA oligonukleotid detektorsonden ger en mätbar amperometriskt ström.

Bakteriell Detection &amp; identifiering med elektrokemiska sensorer

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Kännetecknar Bakteriell Flyktiga använda Sekundär elektrospray Spectrometry jonisation (Sesi-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Tillverkning av elektrokemiska-DNA biosensorer för att Reagentless Upptäckt av nukleinsyror, proteiner och små molekyler

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Upptäckt och isolering av cirkulerande melanomceller med photoacoustic Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

Ihåliga mikronål-baserad sensor för Multiplexade Transdermal Elektrokemisk Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

Avkänning av Barrier Tissue Störningar med en organisk Elektro Transistor

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Glutamin Flux Imaging Använda genetiskt kodade sensorer

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

En mikroflödesbaserad Elektro Biochip för Label-fritt DNA hybridisering Analys

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Flying Insect Detection and Classification with Inexpensive Sensors

Flygande insekter Detection och klassificering med billiga sensorer

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Label-fri enda molekyl Detection Använda Microtoroid optiska resonatorer

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multifluorescensdetektion för dropp Mikrofluidik Använda optiska fibrer

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...