Name: optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes
Uploaded: 2012-12-13T12:00:00
Duration: 22 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes at JoVE.com

The authors would particularly like to thank the following individuals for their technical and intellectual contributions to the development of these methods through the years: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nad&egrave;ge Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis Cell Science and PTI Research), Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice Givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc.), and Mary Waugh (Dartmouth Medical School). They would also like to thank the Bowdoin class of 2006 from the Annual Courses in Research Methods and Applications of Flow Cytometry, which generated the data shown in Figure 2.
Flow cytometry was performed at Roswell Park Cancer Institute's Flow Cytometry Laboratory, which was established in part by equipment grants from the NIH Shared Instrument Program, and receives support from the Core Grant (5 P30 CA016056-29) from the National Cancer Institute to the Roswell Park Cancer Institute, and at the Abramson Cancer Center Flow Cytometry and Cell Sorting Resource Laboratory of the University of Pennsylvania, which was established in part by equipment grants from the NIH Shared Instrument Program, and receives support from NIH #2P30 CA016520 from the National Cancer Institute. The work shown in Figures 3 and 5 was also supported in part by SBIR grant EB00228 from the National Institutes of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) awarded to PTI Research, Inc.

<ol>
	<li>Poon, R. Y., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Bagwell, C. B., Muirhead, K. A., Diamond, R. A., DeMaggio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+PKH+Membrane+Intercalating+Dyes+to+Monitor+Cell+Trafficking+and+Function.">Use of PKH Membrane Intercalating Dyes to Monitor Cell Trafficking and Function.</a> Living Color: Flow Cytometry and Cell Sorting Protocols. , 302-352 (2000).</li><li>Wallace, P. K., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Tracking+2007:+A+Proliferation+of+Probes+and+Applications.">Cell Tracking 2007: A Proliferation of Probes and Applications.</a> Immunol. Invest. 36, 527-562 (2007).</li><li>Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+lymphocyte+proliferation,+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data.">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nat. Protoc. 2, 2057-2067 (2007).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat. Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li><li>Bolton, D. L., Minang, J. T., Trivett, M. T., Song, K., Tuscher, J. J., Li, Y., Piatak, M., O'Connor, D., Lifson, J. D., Roederer, M., Ohlen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking,+Persistence,+and+Activation+State+of+Adoptively+Transferred+Allogeneic+and+Autologous+Simian+Immunodeficiency+Virus-Specific+CD8++T+Cell+Clones+during+Acute+and+Chronic+Infection+of+Rhesus+Macaques.">Trafficking, Persistence, and Activation State of Adoptively Transferred Allogeneic and Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones during Acute and Chronic Infection of Rhesus Macaques.</a> J. Immunol. 184, 303-314 (2010).</li><li>Juopperi, T. A., Sharkis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Quiescent+Murine+Hematopoietic+Stem+Cells+by+Homing+Properties.">Isolation of Quiescent Murine Hematopoietic Stem Cells by Homing Properties.</a> Meth. Mol. Biol. 430, 21-30 (2008).</li><li>Kusumbe, A. P., Bapat, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+aneuploid+populations+within+developing+tumors+are+the+major+determinants+of+tumor+dormancy.">Cancer stem cells and aneuploid populations within developing tumors are the major determinants of tumor dormancy.</a> Cancer Res. 69, 9245-9253 (2009).</li><li>Pece, S., Tosonim, D., Confalonieri, S., Mazzarol, G., Vecchi, M., Ronzoni, S., Bernard, L., Viale, G., Pelicci, P. G., Fiore, P. P. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+Molecular+Heterogeneity+of+Breast+Cancers+Correlates+with+Their+Cancer+Stem+Cell+Content.">Biological and Molecular Heterogeneity of Breast Cancers Correlates with Their Cancer Stem Cell Content.</a> Cell. 140, 62-73 (2010).</li><li>Gertner-Dardenne, J., Poupot, M., Gray, B. D., Fourni&#233;, J. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+fluorochrome+trackers+of+membrane+transfers+between+immune+cells.">Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells.</a> Immunol. Invest. 36, 665-685 (2007).</li><li>Bercovici, N., Givan, A. L., Waugh, M. G., Fisher, J. L., Vernel-Pauillac, F., Ernstoff, M. S., Abastado, J. P., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+precursor+analysis+of+T-cell+responses+to+antigen.">Multiparameter precursor analysis of T-cell responses to antigen.</a> J. Immunol. Methods. 276, 5-17 (2003).</li><li>Givan, A. L., Fisher, J. L., Waugh, M. G., Bercovici, N., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cell-tracking+dyes+to+determine+proliferation+precursor+frequencies+of+antigen-specific+T+cells.">Use of cell-tracking dyes to determine proliferation precursor frequencies of antigen-specific T cells.</a> Methods Mol. Biol. 263, 109-124 (2004).</li><li>Schwaab, T., Tretter, C. P., Gibson, J. J., Cole, B. F., Schned, A. R., Harris, R., Fisher, J. L., Crosby, N., Stempkowski, L. M., Heaney, J. A., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-related+immunity+in+prostate+cancer+patients+treated+with+human+recombinant+granulocyte+monocyte-colony+stimulating+factor+(GM-CSF).">Tumor-related immunity in prostate cancer patients treated with human recombinant granulocyte monocyte-colony stimulating factor (GM-CSF).</a> Prostate. 66 (6), 667-674 (2006).</li><li>Bantly, A. D., Gray, B. D., Breslin, E., Weinstein, E. G., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellVue+Claret,+a+New+Far-Red+Dye,+Facilitates+Polychromatic+Assessment+of+Immune+Cell+Proliferation.">CellVue Claret, a New Far-Red Dye, Facilitates Polychromatic Assessment of Immune Cell Proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 581-605 (2007).</li><li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+assay+for+quantitation+of+rare+antigen-specific+T-cells:+using+cell-tracking+dyes+to+calculate+precursor+frequencies+for+proliferation.">A flow cytometric assay for quantitation of rare antigen-specific T-cells: using cell-tracking dyes to calculate precursor frequencies for proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 563-580 (2007).</li><li>Tario, J. D., Gray, B. D., Wallace, S. S., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lipophilic+tracking+dyes+for+monitoring+cell+proliferation.">Novel lipophilic tracking dyes for monitoring cell proliferation.</a> Immunol Invest. 36, 861-885 (2007).</li><li>Wallace, P. K., Tario, J. D., Fisher, J. L., Wallace, S. S., Ernstoff, M. S., , ., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Antigen-Driven+Responses+by+Flow+Cytometry:+Monitoring+Proliferation+by+Dye+Dilution.">Tracking Antigen-Driven Responses by Flow Cytometry: Monitoring Proliferation by Dye Dilution.</a> Cytometry. 73, 1019-1034 (2008).</li><li>Barth, R. J., Fisher, D. A., Wallace, P. K., Channon, J. Y., Noelle, R. L., Gui, J., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Randomized+Trial+of+Ex+vivo+CD40L+Activation+of+a+Dendritic+Cell+Vaccine+in+Colorectal+Cancer+Patients:+Tumor-Specific+Immune+Responses+Are+Associated+with+Improved+Survival.">A Randomized Trial of Ex vivo CD40L Activation of a Dendritic Cell Vaccine in Colorectal Cancer Patients: Tumor-Specific Immune Responses Are Associated with Improved Survival.</a> Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).</li><li>Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Immune+Cell+Proliferation+and+Cytotoxic+Potential+Using+Flow+Cytometry.">Tracking Immune Cell Proliferation and Cytotoxic Potential Using Flow Cytometry.</a> Meth. Mol. Biol. 699, 119-164 (2011).</li><li>Fuse, S., Underwood, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Analysis+of+In+Vivo+CD8++T+Cell+Cytotoxicity+Against+Multiple+Epitopes+using+Multicolor+Flow+Cytometry.">Simultaneous Analysis of In Vivo CD8+ T Cell Cytotoxicity Against Multiple Epitopes using Multicolor Flow Cytometry.</a> Immunol. Invest. 36, 829-845 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Fleck, M., Mackensen, A., Zoso, A., Halbritter, D., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111, 3546-3552 (2008).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+cellular+proliferation+data:+Avoid+the+panglossian.">Interpretation of cellular proliferation data: Avoid the panglossian.</a> Cytometry. 79A, 95-101 (2011).</li><li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+(CFSE)+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation.">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> J. Vis. Exp. (44), e2259 (2010).</li><li>Houlihan, D. D., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Review+of+Clinical+Trials+of+Bone+Marrow+Stem+Cells+in+Liver+Disease.">Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease.</a> Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).</li><li>Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+In+Vitro+Suppressive+Capacity+of+Regulatory.">Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory.</a> T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).</li></ol>

وقد تلقى K. همفري، JD Tario الابن، والاس PK الكواشف خلية تتبع التجارية التمهيدية للتقييم من شركة الحياة، والعلوم البيولوجية تقنيات BD. وAD Bantly مور JS تلقت قبل خلية تتبع التجارية الكواشف لتقييم من تقنيات الحياة، وشركة وتمويل من شركة PTI والبحث عن ما قبل التجارية توصيف خلية تتبع مختلف CellVue الأصباغ. يعمل بواسطة K. مويرهيد SciGro، وشركة، والذي يوفر خدمات استشارية لشركة Phanos، تكنولوجيا (صاحب PKH والأصباغ CellVue) وتقدم الدعم التقني للشركة النسخ الاحتياطي، سيغما الدريخ والجزيئية تقنيات الاستهداف (الموزعين من هذه الأصباغ). ويرعى الإنتاج وحرية الوصول إلى هذه المقالة عن طريق سيغما الدريخ.

الأساليب المذكورة هنا هي تلك التي وجدت في مختبراتنا المشتركة لمعظم موثوق تعطي أفضل النتائج لوضع العلامات باستخدام الأصباغ hPBMC غشاء 13،16،18 وphenotyping فرعية تتبع انتشار الخلايا اللمفاوية والغشاء أو باستخدام الأصباغ البروتين 2،11،13،16، 18. كما هو موضح في الشكلين 1 و 2، هو الأكثر بسهولة تحقيق وضع العلامات موحد مشرق عن طريق الحد من وجود الأملاح والفسيولوجية باستخدام تقنية الخلط الذي يؤدي إلى التعرض، متجانسة السريع لجميع الخلايا لنفس التركيز من الصبغة. لأن تلطيخ مع الأصباغ الغشاء يحدث من قبل في تقسيم طبقة ثنائية المادة الدهنية، يمكن أن المتغيرات الأخرى التي تغير تركيز صبغة مجانا يؤثر أيضا وضع العلامات كفاءة. على سبيل المثال، ووضع العلامات في أسفل الجولة البوليسترين أنابيب النتائج في تبييض أقل كفاءة من الأملاح قبل إعادة تعليق في C مخفف وأيضا في خفض تركيز صبغة مجانا نظرا لصبغ الامتزاز على جدران الأنبوب، ولا سيمابتركيزات أقل صباغة. كل العوامل تميل إلى إعطاء توزيعات أوسع من تلطيخ عندما يتم وضع العلامات باستخدام أنابيب البولي بروبلين أسفل المخروطية (أرقام 3 و 4 و غير منشورة النتائج). يمكن العمر ونوع العينة تؤثر أيضا عرض الذروة حتى عندما يتم استخدام إجراءات تلطيخ الأمثل. على سبيل المثال، السير الذاتية لنقاط البيع PKH26 الخلايا الليمفاوية المعزولة من الدم المسحوبة مجموعة طازجة من 14-20٪ (الشكل 3، المرجع 13 و نتائج غير منشورة) في حين السير الذاتية لمفاوية معزولة عن 24 عينة الدم ساعة قديمة أو مجموعة الفلاتر TRIMA فصادة 25-30 ٪ (الشكل 4 والمرجع 18). تلطيخ التوحيد وإلى أي مدى يمكن استبعاد غير قابلة للحياة الخلايا من كلا تحليل ما إذا كانت تؤثر على قمم ابنة مميزة واضحة في تخفيف الصبغة الشخصي، وهذا بدوره يؤثر على اختيار نموذج الانتشار لاحتواء البيانات المرصودة (أرقام 5 و 6 </strong&gt;). على الرغم من أن يستخدم ModFit (فيرتي برمجيات البيت، Topsham، ME) هنا كمثال على البرمجيات المستخدمة لتوليد المقاييس مثل مؤشر الانتشار والتردد السلائف (أرقام 3 و 5 و 6؛ الجدول 3)، وحزم البرمجيات الأخرى تحتوي أيضا على وحدات لتحليل بيانات الانتشار. وتشمل هذه FCSExpress (دي نوفو البرمجيات، لوس أنجلوس، CA) وFlowJo (شجرة نجوم، وشركة، آشلاند، OR). كل هذه البرامج استخدام غير الخطية تحليل المربعات الصغرى للعثور على تكراري الأنسب للبيانات الخام عن طريق تغيير الموقف، وارتفاع SD (أو العرض) من قمم جاوس تمثل أجيال متتابعة ابنة. مؤشر التكاثري (PI) والتردد السلائف (PF) هي التدابير الأكثر استخداما من مدى الانتشار. PI، على النحو المحدد من قبل ModFit، هو مقياس للزيادة في عدد الخلايا على مدى الفحص، قياسا إلى &quot;مؤشر التحفيز&quot; لفحص امتصاص ثيميدين. PF إرجاع جزء من الخلايا الأولية في populatأيون التي ردت على التحفيز المتكاثرة. وينصح الحذر، ومع ذلك، عند قراءة الأدب منذ المصطلحات تختلف إلى حد ما بين حزم البرامج (على سبيل المثال، وFlowJo ModFit استخدام تعاريف مختلفة وحسابات ما هو المقصود ب &quot;مؤشر انتشار&quot;) 22. واجهت أيضا القضايا الحرجة التي تمت مناقشتها هنا لوضع العلامات وتحليل انتشار الأصباغ مع الغشاء عند استخدام الأصباغ البروتين. على سبيل المثال، يجب أيضا الاهتمام الدقيق لتقنية خلط يتعين مراعاتها، جنبا إلى جنب مع استبعاد الخلايا الميتة / الموت، من أجل الحصول على توزيعات موحد وقمم ابنة مميزة عند استخدام CFSE (الشكل 6) 2-4،13،18،24. الاختيار المناسب للfluorochromes لphenotyping وتقييم الجدوى المهم أيضا تجنب التداخل الطيفي المفرط وعدم القدرة على الاعتراف خلايا الجسم المضاد إيجابية، لا سيما فيما مرئية الأصباغ البروتين ينبعث منها مثل CFSE 2-4،11،13،16،18 </sup&gt;. الحد من تركيز صبغة تتبع يقلل المشاكل التعويض في قنوات الطيفية المجاورة ولكن يحد أيضا من عدد من الانقسامات الخلوية التي يمكن رصدها قبل خلية ابنة شدة تبدأ تتداخل مع تألق ذاتي. بدلا من ذلك، استخدام الأصباغ أحدث خلية تتبع مثل كلاريت ينبعث منها CellVue الحمراء بعيدة (سيغما الدريخ، سانت لويس، MO) أو البنفسجي ينبعث منها CellTrace البنفسج (الحياة تكنولوجيز، وغراند ايلاند، نيويورك) قد يقلل المشاكل التعويض (الشكل 6). وأخيرا، على الرغم من الأصباغ الغشاء تميل عموما أقل سمية لعرض 11،26، فمن الممكن أن الإفراط في تسمية الخلايا مع صبغة إما فئة من. ولذلك فمن الضروري دائما للتحقق من أن تركيز صبغة المستخدمة تتبع لم يغير وظائف الخلايا لتعقبها (الشكل 6) 3،13،16،18.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كاشف أو المعدات </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> اشترى تجاريا </td></tr><tr><td> 7-D Aminoactinomycin </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A9400 </td><td></td></tr><tr><td> ألبومين المصل البقري (BSA) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> الجنين المصل البقري (FBS) </td><td> أتلانتا الحيوية </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> هانكس المتوازن محلول ملحي (HBSS) </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 14175-079 </td><td> الكالسيوم والمغنيسيوم مجانا، دون الحمراء الفينول </td></tr><tr><td> الإنسان جزء كوهن مفتش II III والجلوبيولين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> G-4386 </td><td></td></tr><tr><td> الماوس المضادة للCD3-FITC الإنسان </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 349201 </td><td> تركيز على النحو الذي يحدده تشبع المعايرة المعملية </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للبشرية CD4-APC </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 340672 </td><td> تركيز على النحو الذي يحدده تشبع المعايرة المعملية </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للبشرية CD4-PECy7 </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 348799 </td><td> تركيز على النحو الذي يحدده تشبع المعايرة المعملية </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للبشرية CD8-FITC </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 347313 </td><td> تركيز على النحو الذي يحدده تشبع المعايرة المعملية </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للبشرية CD8-APC </td><td> Caltag (لايف تكنولوجيز) </td><td> MHCD0805 </td><td> تركيز على النحو الذي يحدده تشبع المعايرة المعملية </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للCD19-APC الإنسان </td><td> Caltag (لايف تكنولوجيز) </td><td> MHCD1905 </td><tد&gt; تركيز إغراق على النحو الذي يحدده المختبر المعايرة </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للCD25-APC الإنسان </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 340938 </td><td> تركيز على النحو الذي يحدده تشبع المعايرة المعملية </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للبشرية CD127-PE </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 557938 </td><td> تركيز على النحو الذي يحدده تشبع المعايرة المعملية </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للبشرية CD3 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0037-85 </td><td> 1.0 ملغ / مل؛ أزيد مجانا </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للCD28 الإنسان </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0289-85 </td><td> 1.0 ملغ / مل؛ أزيد مجانا </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300-058 </td><td></td></tr><tr><td> PKH26 الحمراء الفلورسنت رابط خلية تحتوي على 10 مجموعة-3M PKH26 في EtOH وC مخفف </td><td> سيغما الدريخ </td><td> PKH26GL-1KT أو MINI26-1KT </td><td> الإجراءات في الخطوة 1 تنطبق أيضالمجموعات تحتوي على الأصباغ أو PKH67 CellVue أخرى </td></tr><tr><td> CellVue كلاريت الحمراء بعيدة رابط الخلية الفلورسنت عدة تحتوي على 10-3M CellVue كلاريت في EtOH وC مخفف </td><td> سيغما الدريخ </td><td> MINCLARET-1KT أو MIDCLARET 1KT- </td><td></td></tr><tr><td> 5 - (و-6)-carboxyfluorescein ثنائي الأسيتات، succinimidyl استر (CFDA-SE) </td><td> إينفيتروجن (لايف تكنولوجيز) </td><td> C34554 </td><td> غير الفلورية؛ المشقوق من الاسترات لتشكيل غشاء الفلورسنت الأمينية التفاعل carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) </td></tr><tr><td> لايف / DEAD البنفسج قابل للتثبيت </td><td> إينفيتروجن (لايف تكنولوجيز) </td><td> L34955 </td><td></td></tr><tr><td> معقمة 12 × 75 مم المخروطية أنابيب البولي بروبلين وقبعات </td><td> VWR </td><td> 60818-102 </td><td> يعطي أفضل تلوين صبغ كفاءة الغشاء (انخفاض امتصاص الصبغة، وأقل خسارة الخلية خلال التطلع طاف) </td></tr><tr><td> 12 × 75 مم rounد القاع البوليسترين أنابيب </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 21008-936 </td><td></td></tr><tr><td> تدفق عداد الكريات </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> FACSCalibur LSRFortessa </td><td> أي عداد الكريات قادرة على الكشف عن FITC، PKH26، و 7 AAD-(مثلا: 488 نانومتر؛ م 520 نانومتر، 567 نانومتر، ونانومتر 655، على التوالي) والسابقين APC. 633-640 نانومتر؛ م. 660 نيوتن متر) </td></tr><tr><td> تدفق عداد الكريات </td><td> بيكمان كولتر </td><td> LSRII سماوي </td><td> أي عداد الكريات قادرة على الكشف عن FITC، PKH26، و 7 AAD-(مثلا: 488 نانومتر؛ م 520 نانومتر، 567 نانومتر، ونانومتر 655، على التوالي) والسابقين APC. 633-640 نانومتر؛ م. 660 نيوتن متر) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> إعداد المختبر </td></tr><tr><td> 7-D Aminoactinomycin، تتركز الأسهم </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 1 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني. تجميد وتخزين في مأخوذة في -20 ° C. </td></tr><tr><td> 7-D Aminoactinomycin، العملك الأسهم </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 100 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني، وإعداد يوميا من الأسهم ملغ / 1 مل المجمدة. </td></tr><tr><td> مفتش كتلة </td><td> NA </td><td> NA </td><td> HBSS + 10 ملغ / مل الإنسان جزء كوهن مفتش الثاني والثالث الجلوبيولين + 10 ملغ / مل BSA. </td></tr></tbody></table>

optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes

الفلورسنت الأصباغ تتبع الخلية، إلى جانب تدفق الخلوي والصورة، هي أدوات قوية لدراسة التفاعلات ومصائر أنواع مختلفة من الخلايا في المختبر والمجراة. 1-5 على الرغم من أن هناك حرفيا الآلاف من المنشورات باستخدام هذه الأصباغ، وبعض تتبع الخلية الأكثر شيوعا التي تواجهها التطبيقات تشمل رصد: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجذعية والسلف السكون الخلية، وانتشار و / أو تمايز 6-8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مستضد غشاء نقل يحركها 9 و / أو السلائف تكاثر الخلايا و3،4،10-18 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وظيفة خلايا المناعة التنظيمية والمستجيب 1،18-21. </li></ol> المتاحة تجاريا خلية تتبع الأصباغ تختلف على نطاق واسع في كيمياء وممتلكاتهم مضان ولكن سقوط الغالبية العظمى في واحدة من فئتين استنادا إلى آلية لوضع العلامات على الخلية. &quot;الأصباغ غشاء&quot; الذي تمثله PKH26، هي دهون بدرجة عالية الأصباغ رقسم قبعة ثابت ولكن غير تساهمي في أغشية الخلايا، 1،2،11. &quot;الأصباغ البروتين&quot; الذي تمثله CFSE، هي الأمينية التفاعل الأصباغ التي تشكل روابط تساهمية ثابتة مع البروتينات الخلوية 4،16،18. كل فئة لها مزايا وقيود من صنعها. المفتاح لنجاح استخدامها، وخاصة في الدراسات متعددة الألوان والأصباغ التي تستخدم فيها عدة لتتبع أنواع مختلفة من الخلايا، وبالتالي لفهم القضايا الحاسمة تمكن من الاستخدام الأمثل لكل فئة 2-4،16،18،24. وشملت البروتوكولات هنا تبرز ثلاثة أسباب مشتركة من النتائج السيئة أو متغير عند استخدام خلية تتبع الأصباغ. وهذه هي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفشل في تحقيق وموحدة مشرق، ووضع العلامات استنساخه. هذه هي نقطة انطلاق ضرورية لدراسة أي خلية تتبع ولكنها تتطلب الانتباه إلى المتغيرات المختلفة عند استخدام الأصباغ غشاء من البروتين عند استخدام الأصباغ أو الكواشف التوازن ملزمة مثل الأجسام المضادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملون تألقي مجموعات دون المستوى الأمثل لالثاني / أو عدم إدراج ضوابط التعويض النقدي. تتبع صبغ مضان عادة 10 فبراير - 10 مارس مرات أكثر إشراقا من مضان الأجسام المضادة. ولهذا من الضروري التحقق من أن وجود صبغة تتبع لا يضر القدرة على الكشف عن تحقيقات أخرى قيد الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدم الحصول على مناسبا مع نماذج البرمجيات الذروة. مثل هذه البرامج تتيح المقارنة الكمية من الردود التكاثري بين مختلف السكان أو المنبهات على أساس تردد السلائف أو المقاييس الأخرى. الحصول على مناسبا، ولكن يتطلب استبعاد القتلى / يموتون الخلايا التي يمكن أن تشوه ملامح تخفيف الأصباغ ومطابقة للنموذج الافتراضات التي تقوم عليها مع خصائص الملف صبغة التخفيف المرصودة. </li></ol> الأمثلة الواردة هنا توضيح كيف يمكن أن تؤثر هذه المتغيرات النتائج عند استخدام الغشاء و / أو الأصباغ البروتين لرصد تكاثر الخلايا.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes at JoVE.com

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

الاستخدام الناجح للخلية تتبع الأصباغ لمراقبة وظيفة خلايا المناعة وانتشار يشمل عدة خطوات حاسمة. وصفنا طرق: 1) الحصول على وموحدة مشرق، استنساخه التسمية جي مع الأصباغ الغشاء؛ 2) اختيار fluorochromes وشروط الحصول على البيانات، و3) اختيار نموذج لقياس انتشار الخلايا يعتمد على التخفيف صباغة.

الأمثل أساليب النمذجة وتلوين لرصد انتشار استخدام الأصباغ انقسام الخلية خلية تتبع

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

انتقائية وسمها بروتينات سطح الخلية باستخدام CyDye DIGE ملونات فلور الحد الأدنى

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

تعيش تشريح ذبابة الفاكهة الأجنة : طرق مبسطة للفحص من قبل مجموعات المسخ تلطيخ جسم

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

تحديد عدد الخلايا خلال زراعة الخلايا باستخدام خلية مكافحة الصولجان

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

رصد التغيرات الدينامية في مستويات الكالسيوم الميتوكوندريا خلال موت الخلايا المبرمج باستخدام جهاز استشعار الكالسيوم مشفرة وراثيا

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

تتبع الخلية عن طريق البروتينات Photoconvertible خلال التنمية اسماك الزرد

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

في النمذجة فيفو من المهووسين الجينوم البشري باستخدام دانيو rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

تلطيخ النسيجية من<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em&gt; الخليوي الثانوية ستريت عناصر

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

طرق للبشرة إصابة وفحوصات لالردود الجرح في<em&gt; C. ايليجانس</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

تتبع الزمني للتقدم دورة الخلية باستخدام التدفق الخلوي دون الحاجة إلى مزامنة

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

مقارنة بين ثلاث طرق مختلفة لتحديد انتشار الخلايا في خطوط خلايا سرطان الثدي

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...