Name: optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes
Uploaded: 2012-12-13T12:00:00
Duration: 22 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes at JoVE.com

作者特别感谢以下人士：布鲁斯·巴格韦尔他们的技术和知识贡献，经过多年的发展，这些方法（Verity的软件公司），NadègeBercovici（IDM），Lizanne布雷斯林（Zynaxis细胞科学和PTI研究的） ，布莱恩·格雷（PTI研究），月费雪（达特茅斯医学院），爱丽丝吉万（达特茅斯医学院），贝齐·奥尔森威廉（SciGro公司），和玛丽·沃（达特茅斯医学院）。他们也想感谢鲍登学院2006级年度课程研究方法与应用流式细胞仪检测，其产生的数据， 如图2所示。 流式细胞术在Roswell Park癌症研究所的流式细胞仪检测实验室，成立于设备补助部分由美国国立卫生研究院的共享仪器程序，并接收从Core资助（5 P30 CA016056-29），从国家的支持Roswell Park癌症研究所癌症研究所，并在Abramson癌症中心的流式细胞仪和细胞分选资源宾夕法尼亚大学的实验室，成立于部分由美国国立卫生研究院的共享仪器程序的设备补助，并接收由美国国立卫生研究院的支持＃2P30 CA016520从美国国家癌症研究所。在图3和图5所示的工作也得到了支持部分由SBIR授予EB00228从国家生物医学成像和生物工程研究院（NIBIB）颁发给，PTI研究公司

1。一般的薄膜标签用PKH26细胞示踪染料（编号25，图1） <ol><li>使用无菌技术的步骤1.1 - 1.9。准备〜10 7人末梢血单核细胞或淋巴细胞（人外周血单个核细胞，hPBL），此外，最后的300 xg离心自旋使用实验室的标准方法，以尽量减少血小板污染。重悬细胞于10 7个/ ml，在HBSS 1％BSA中，置于冰上，保留500μl的等分试样（5×10 6个细胞），在步骤2中使用。 </li><li>地点5×10 6个细胞（500微升）在12×75毫米同轴的聚丙烯管中。用3.5毫升HBSS洗涤一次。小心吸出上清液，留下残留的液体不超过15-25微升，但小心不要删除单元。使用此管准备2倍的细胞悬浮液的步骤1.4。 </li><li>在细胞洗涤在步骤1.2中，加入0.5ml的稀释液的Ç标签车辆（从PKH26GL套件）一个12 x75毫米的圆锥形的聚丙烯管中。使用此管的准备2倍的PKH26解决方案，步骤1.5。 </li><li>洗涤后的细胞沉淀中加入0.5毫升稀释液的的Ç标签车辆从步骤1.2和吸液和分配的3-4倍，得到单细胞悬浮液（2×细胞）。避免泡沫的形成和过度的混合，这可能会降低细胞活力和恢复。 </li><li>后，立即在步骤1.4中制备的2倍的细胞悬浮液中，准备了2倍（4μM）染料溶液中加入2.0微升1.0mM的PKH26染料库存在乙醇（从PKH26GL套件）的稀释液的制备在步骤1.3和旋涡的C管均匀分散。 </li><li>步骤1.5后，立即准备2倍的染料溶液，迅速 ​​移液管的2倍细胞悬浮液从1.4到2倍的染料溶液步骤，并同时吸液和分配的3-4倍，完全分散细胞的染料。 不要加入1.0毫米染料直接细胞;倒到2x染料的2个细胞，或增加2个细胞的2倍，而涡旋式染料。由于染色几乎是即时的，这种方法产生统一强度比推荐的方法（ 图2）。 </li><li> 1分钟后，加入1.0毫升的热灭活血清或HBSS 5％的BSA停止染料吸收到细胞膜。如果使用足够的蛋白质，形成染料聚集体，颗粒细胞在洗涤步骤，导致意想不到的标签与其他细胞的实验中存在的风险。如果与10％热灭活血清（CM）或HBSS 1％BSA的介质是被用来作为停止的试剂，在15毫升锥形聚丙烯管中进行染色，并添加至少为5.0毫升停止试剂，以确保所有的吸附未掺入的染料。 </li><li>标记的细胞离心5分钟@〜400×g下。小心吸出上清液，而不删除单元。洗涤沉淀两次用4毫升CM或HBSS 1％BSA的，分散粒料之前recentrifugation的。为了尽量减少残留的染料吸附在管壁上，最大限度地提高洗涤效率，转移到一个新的聚丙烯管细胞后，网络连接第一个悬浮。注：充分染的细胞会表现出不同的颗粒粉红色的色调。 </li><li>洗过的细胞沉淀重悬在1.0毫升的HBSS 1％BSA。计数细胞，测定细胞恢复，以及调节音量，得到的最终浓度为10 7个/ ml。通过仔细的愿望，电池回收应≥85％。如果细胞恢复&lt;70％时，应查明原因，然后再继续。提款150微升等分试样（1.5×10 6个细胞）和在步骤2中使用的在冰上地方。 </li></ol> 2。制备仪器和实验设置控制（ 表1） <ol><li>等分试样50微升（5×10 5），从保存在步骤1.1的细胞悬浮液到每个五1.8 ​​毫升Eppendorf管中：1，3，4，5，和7的未染色细胞。等分试样50微升（5×10 5），的PKH26 位置细胞到每个三级管从步骤1.9：2，6和8。 </li><li>管1-8，加入10μl的IgG嵌段（100微克/管的IgG;见表试剂）并在环境温度（20-25℃）孵育10分钟。 </li><li>加入饱和量的抗体（们）表示于表1中的管4，5，7，和8，并孵育30分钟，在室温和避光的所有样本（管1-8）。 </li><li>加入1.5毫升的HBSS 1％BSA的所有样品，沉淀细胞通过离心分离（5分钟@ 400 xg离心），并用1.5毫升1％BSA的HBSS洗一次，用小心抽吸，以避免细胞的损失。 </li><li>每个样品重悬在500微升的HBSS 1％BSA的。您的流式细胞仪上进行分析的样品，如果需要转移到一个12×75毫米的圆形底部管。管3，第6，第7和8中加入10μl的100微克/毫升7-AAD每日工作库存（见表试剂），如表1中所示。在冰上孵育30分钟，在使用前，在流式细胞仪安装和染色验证（步骤3）。 </li></ol> 3。流式细胞仪安装和染色验证<ol><li>验证流量cytome后运行正常，使用实验室的日常质量控制程序。验证信号可以很容易地被检测到在要使用的每个光谱窗口，和检测器响应是线性正比于在窗口中的信号强度，用于增殖监测14。 </li><li>收购管1 FSC与SSC数据使用线性显示比例。调整每个检测器的放大的淋巴细胞群，使得落在点图的左下象限，是不是断开规模两个参数中的任何一个中，并且不被中断，由于阈值化。收集所有的样品在步骤3.3 - 3.7非门FSC与SSC数据。 </li><li>采集数据管1，不使用色彩补偿所有4个荧光检测器和对数显示比例。调整各检测器的高电压（HV）放置规模少/无细胞积聚在第一信道的未染色的淋巴细胞的自发荧光。设置每个直方图的分析边界对应于最亮的2％的未染色细胞。 </li><li>不使用色彩补偿和HV设置在3.2和3.3，采集数据，收集管2 FSC，SSC，在所有4个荧光检测器的信号。 PKH26荧光用于监视检测，确认所有的的PKH26 POS细胞出现规模作为一个单一的对称峰在第三 -4 个十年，数/细胞中的最后一个通道。如果有多个峰，或峰形歪斜，重复步骤1，，与盐小心注意尽量减少和混合技术（ 图2）。如果有必要，调整染料的浓度。 </li><li>使用步骤3.3的设置，采集数据，收集管3 FSC，SSC，在所有4个荧光检测器的信号。用于监视7-AAD荧光检测，确认7-AAD的POS细胞下降2％以上步骤3.3（ 即非活细胞得到很好的解决边界建立可行的7-AAD 阴性细胞）。 </li><li>使用步骤3.3的设置，采集数据，收集管4 FSC，SSC，在所有4个荧光检测器的信号。检查未染色的细胞（ 即 ，秋天的FITC检测步骤3.3建立高于2％的边界），CD8的POS细胞得到很好的解决。管5重复和验证未染色细胞（ 即下跌超过2％的边界成立于APC检波器的步骤3.3），CD8的POS细胞得到很好的解决。 </li><li>使用步骤3.3中设置，采集数据，收集管6，第7和第8 FSC，SSC，在所有4个荧光检测器的信号。 </li><li>使用收集管1-5和色彩补偿软件，建立一个重叠矩阵，每个荧光探测器被用来监视其他三个荧光染料的颜色列表模式下的文件。应用此矩阵样品6到列表模式文件，并确认存在PKH26实验室鹅岭不改变的能力来检测7-AAD 位置细胞。 </li><li>应用颜色重叠矩阵，列表模式下的文件，样品7和第3.8步验证是：a）很好地解决亚群（CD3 负的 CD4 负 ，的CD3 POS CD4 neg和的CD3 位置 CD4 POS）可以识别的FITC与APC散点图，和b）的存在下，抗-CD3-FITC和抗-CD4-APC不改变7-AAD 位置细胞的能力来检测。如果存在下，抗-CD3-FITC改变PKH26检测器上收集的数据的高2％的边界，调整所要求的边界。 </li><li>应用的颜色重叠矩阵，从步骤3.8样品8到列表模式文件。如果存在的PKH26标记改变那些使用自体荧光的步骤控制在3.3 FITC 7-AAD或APC探测器的2％的边界，调整边界（IES）需要使用管7 表1，并确认其仍然是能够disting的uish CD3 位置 CD4 POS机 ，的CD3 POS CD4 负 ，和CD3 负的 CD4 阴性细胞使用调整后的边界（IES）。 </li></ol> 4。细胞分裂的监测染料稀释扩散模型选择<ol><li>确定代与代之间的间距，这是依赖于在您的流式细胞仪的数目的信道和对数十年。对于数字仪表，确定这个值，通常为4或5几十年来，在数字信号处理器的数目的箱柜。在模拟仪器，数十年来很少是整数，精确的建模需要的准确数字几十年来用实验方法确定。要做到这一点，从校准与制造商分配的相对强度的荧光珠的混合物获取的数据在相同的检测器在实验中使用的高电压设定。胎圈的峰的位置在int的方面允许的对数刻度的校准每个日志十年的ensity范围。具体而言，这是通过绘制每个胎圈类型对日志的制造商指定的值的信道数目。胎圈的数据值的最佳拟合直线的斜率给出了每个通道的相对强度单位的数目。乘以的信道数，然后将这个值是日志数十年的满刻度，从其中可以计算出到2倍的强度降低的现象（ 即 ，女儿代间距）相对应的数量的信道14的数目。 </li><li>决定是否使用一个固定的几代人之间的间距，或允许浮动的间距。 A 标准 （固定）设置将使用在步骤4.5确定指定的位置，每一代代间距值时通常使用的直方图没有明显的峰值。一个浮动设置允许的直方图的形状来确定每个代峰值位置时，通常使用distinguishablË代峰是显而易见的。 </li><li>决定是否使用一个固定的峰宽各代或浮动宽度。一个固定的宽度使用SD未刺激的对照样品各代建模和计算时，通常选择的样本缺乏区分的代峰。一个浮动的宽度允许程序独立地改变SD每一代都最适合用于区分的代峰。 </li><li>执行程序中的扩散分析模块（ModFit LT版本3.3）。刺激PKH26 位置设置为进行分析（ 例如 ，刺激96小时培养PKH26 位置细胞复染按照在表1中管8）的数据文件从装入。 </li><li>选择的参数进行分析，在这种情况下PKH26（585/42）上可行的门控（7-AAD 负。）CD3的POS淋巴细胞和FSC与SSC排除小碎片和大团聚体（ 图3）。在定义这些地区要小心爆炸通常包括前向散射面积，并注意CD3的表达可能是下调制刺激的培养。 </li><li>使用扩散向导创建一个新的扩散模型。使用打开数据文件 （“开始”选项卡上）中，装入未刺激PKH26的POS控制文件和定义的位置高峰在父母的信道分配相应不可分割的细胞。 </li><li> 分析该文件为刺激时PKH26 位置控制，注意到父母峰的位置和宽度（标准差）的值。如果需要一个固定的峰宽（SD），检查锁定SD。 </li><li>负载：PKH26 负控制（ 例如 ，PKH26 阴性细胞培养96小时的复染的管7 表1）。调整世代数 ​​的通过设置峰值通道的最暗的代以上的PKH26 负控制。这就决定了NUMBER的女儿代模型可以准确地适应，通常是6-9代。 </li><li> 打开刺激的样本（ 例如 ，刺激96小时培养PKH26 位置细胞复染管8在表1中）的数据文件，并确认父母的峰值位置和SD，如在步骤4.7中定义的区域不变。如果需要固定的世代间隔，选择“ 标准”模式的选项，否则选择浮动选项。 </li><li> 分析每一个实验性的文件中的数据集，在步骤4.9中定义的使用相同的模型。父母的峰值位置的一些小的调整可能是必要的视觉和减少的卡方值（RCS）最适合。 </li><li>记录所需的增殖的最佳拟合数据集合中的每一个实验性的文件产生的度量。可能指标的全面描述见参考文献。 22。 </li></ol>

<ol>
	<li>Poon, R. Y., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Bagwell, C. B., Muirhead, K. A., Diamond, R. A., DeMaggio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+PKH+Membrane+Intercalating+Dyes+to+Monitor+Cell+Trafficking+and+Function.">Use of PKH Membrane Intercalating Dyes to Monitor Cell Trafficking and Function.</a> Living Color: Flow Cytometry and Cell Sorting Protocols. , 302-352 (2000).</li><li>Wallace, P. K., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Tracking+2007:+A+Proliferation+of+Probes+and+Applications.">Cell Tracking 2007: A Proliferation of Probes and Applications.</a> Immunol. Invest. 36, 527-562 (2007).</li><li>Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+lymphocyte+proliferation,+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data.">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nat. Protoc. 2, 2057-2067 (2007).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat. Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li><li>Bolton, D. L., Minang, J. T., Trivett, M. T., Song, K., Tuscher, J. J., Li, Y., Piatak, M., O'Connor, D., Lifson, J. D., Roederer, M., Ohlen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking,+Persistence,+and+Activation+State+of+Adoptively+Transferred+Allogeneic+and+Autologous+Simian+Immunodeficiency+Virus-Specific+CD8++T+Cell+Clones+during+Acute+and+Chronic+Infection+of+Rhesus+Macaques.">Trafficking, Persistence, and Activation State of Adoptively Transferred Allogeneic and Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones during Acute and Chronic Infection of Rhesus Macaques.</a> J. Immunol. 184, 303-314 (2010).</li><li>Juopperi, T. A., Sharkis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Quiescent+Murine+Hematopoietic+Stem+Cells+by+Homing+Properties.">Isolation of Quiescent Murine Hematopoietic Stem Cells by Homing Properties.</a> Meth. Mol. Biol. 430, 21-30 (2008).</li><li>Kusumbe, A. P., Bapat, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+aneuploid+populations+within+developing+tumors+are+the+major+determinants+of+tumor+dormancy.">Cancer stem cells and aneuploid populations within developing tumors are the major determinants of tumor dormancy.</a> Cancer Res. 69, 9245-9253 (2009).</li><li>Pece, S., Tosonim, D., Confalonieri, S., Mazzarol, G., Vecchi, M., Ronzoni, S., Bernard, L., Viale, G., Pelicci, P. G., Fiore, P. P. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+Molecular+Heterogeneity+of+Breast+Cancers+Correlates+with+Their+Cancer+Stem+Cell+Content.">Biological and Molecular Heterogeneity of Breast Cancers Correlates with Their Cancer Stem Cell Content.</a> Cell. 140, 62-73 (2010).</li><li>Gertner-Dardenne, J., Poupot, M., Gray, B. D., Fourni&#233;, J. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+fluorochrome+trackers+of+membrane+transfers+between+immune+cells.">Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells.</a> Immunol. Invest. 36, 665-685 (2007).</li><li>Bercovici, N., Givan, A. L., Waugh, M. G., Fisher, J. L., Vernel-Pauillac, F., Ernstoff, M. S., Abastado, J. P., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+precursor+analysis+of+T-cell+responses+to+antigen.">Multiparameter precursor analysis of T-cell responses to antigen.</a> J. Immunol. Methods. 276, 5-17 (2003).</li><li>Givan, A. L., Fisher, J. L., Waugh, M. G., Bercovici, N., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cell-tracking+dyes+to+determine+proliferation+precursor+frequencies+of+antigen-specific+T+cells.">Use of cell-tracking dyes to determine proliferation precursor frequencies of antigen-specific T cells.</a> Methods Mol. Biol. 263, 109-124 (2004).</li><li>Schwaab, T., Tretter, C. P., Gibson, J. J., Cole, B. F., Schned, A. R., Harris, R., Fisher, J. L., Crosby, N., Stempkowski, L. M., Heaney, J. A., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-related+immunity+in+prostate+cancer+patients+treated+with+human+recombinant+granulocyte+monocyte-colony+stimulating+factor+(GM-CSF).">Tumor-related immunity in prostate cancer patients treated with human recombinant granulocyte monocyte-colony stimulating factor (GM-CSF).</a> Prostate. 66 (6), 667-674 (2006).</li><li>Bantly, A. D., Gray, B. D., Breslin, E., Weinstein, E. G., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellVue+Claret,+a+New+Far-Red+Dye,+Facilitates+Polychromatic+Assessment+of+Immune+Cell+Proliferation.">CellVue Claret, a New Far-Red Dye, Facilitates Polychromatic Assessment of Immune Cell Proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 581-605 (2007).</li><li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+assay+for+quantitation+of+rare+antigen-specific+T-cells:+using+cell-tracking+dyes+to+calculate+precursor+frequencies+for+proliferation.">A flow cytometric assay for quantitation of rare antigen-specific T-cells: using cell-tracking dyes to calculate precursor frequencies for proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 563-580 (2007).</li><li>Tario, J. D., Gray, B. D., Wallace, S. S., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lipophilic+tracking+dyes+for+monitoring+cell+proliferation.">Novel lipophilic tracking dyes for monitoring cell proliferation.</a> Immunol Invest. 36, 861-885 (2007).</li><li>Wallace, P. K., Tario, J. D., Fisher, J. L., Wallace, S. S., Ernstoff, M. S., , ., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Antigen-Driven+Responses+by+Flow+Cytometry:+Monitoring+Proliferation+by+Dye+Dilution.">Tracking Antigen-Driven Responses by Flow Cytometry: Monitoring Proliferation by Dye Dilution.</a> Cytometry. 73, 1019-1034 (2008).</li><li>Barth, R. J., Fisher, D. A., Wallace, P. K., Channon, J. Y., Noelle, R. L., Gui, J., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Randomized+Trial+of+Ex+vivo+CD40L+Activation+of+a+Dendritic+Cell+Vaccine+in+Colorectal+Cancer+Patients:+Tumor-Specific+Immune+Responses+Are+Associated+with+Improved+Survival.">A Randomized Trial of Ex vivo CD40L Activation of a Dendritic Cell Vaccine in Colorectal Cancer Patients: Tumor-Specific Immune Responses Are Associated with Improved Survival.</a> Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).</li><li>Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Immune+Cell+Proliferation+and+Cytotoxic+Potential+Using+Flow+Cytometry.">Tracking Immune Cell Proliferation and Cytotoxic Potential Using Flow Cytometry.</a> Meth. Mol. Biol. 699, 119-164 (2011).</li><li>Fuse, S., Underwood, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Analysis+of+In+Vivo+CD8++T+Cell+Cytotoxicity+Against+Multiple+Epitopes+using+Multicolor+Flow+Cytometry.">Simultaneous Analysis of In Vivo CD8+ T Cell Cytotoxicity Against Multiple Epitopes using Multicolor Flow Cytometry.</a> Immunol. Invest. 36, 829-845 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Fleck, M., Mackensen, A., Zoso, A., Halbritter, D., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111, 3546-3552 (2008).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+cellular+proliferation+data:+Avoid+the+panglossian.">Interpretation of cellular proliferation data: Avoid the panglossian.</a> Cytometry. 79A, 95-101 (2011).</li><li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+(CFSE)+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation.">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> J. Vis. Exp. (44), e2259 (2010).</li><li>Houlihan, D. D., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Review+of+Clinical+Trials+of+Bone+Marrow+Stem+Cells+in+Liver+Disease.">Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease.</a> Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).</li><li>Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+In+Vitro+Suppressive+Capacity+of+Regulatory.">Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory.</a> T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).</li></ol>

·汉弗莱，JD Tario，Jr。和PK华莱士已经收到了预商用的细胞跟踪试剂从Life Technologies，Inc。和BD Biosciences公司进行评估。 AD Bantly和JS Moore已收到预商用的细胞追踪试剂的评价从Life Technologies，Inc。和资金从PTI研究，​​公司为预商用表征的各种CellVue细胞示踪染料。 K.缪尔黑德是受雇于公司，提供咨询服务Phanos科技有限公司（所有者的PKH和CellVue染料），并提供Sigma-Aldrich公司和分子靶向技术，备份技术支持（SciGro，这些分销商染料）。 生产和免费使用这篇文章是由Sigma-Aldrich公司。

这里介绍的方法是在我们的联合实验室hPBMC标签用膜染料13,16,18的和T淋巴细胞亚群的表型和增殖跟踪，无论是膜或蛋白染料2,11,13,16，使用最可靠提供最佳的结果， 18。正如图1和图2中示出，明亮的统一的标签是最容易实现的生理盐的存在下，通过限制使用的混合技术，快速，均匀的曝光的所有单元格，以相同浓度的染料中的结果。因为划分的脂质双层膜染料染色时，其他变量，改变染料浓度，还可以影响标签的效率。例如，标签圆底聚苯乙烯管效率较低的盐冲洗稀释Ç的悬浮之前也减少由于染料的吸附在管壁上，特别是游离的染料浓度在染料浓度较低。这两个因素往往会得到更广泛的染色分布时相比，标记操作可以使用圆锥形底部的聚丙烯管中（ 图3，图4和 结果未显示）。样本的年龄和类型也可以影响峰宽，甚至被用来优化的染色过程。例如为的PKH26 位置淋巴细胞分离出新鲜抽血，范围从14-20％（参考图3，13日和未发表的结果），而24小时老血液样本或TRIMA的pheresis过滤器范围内分离出淋巴细胞的简历，个人简历25-30 ％（ 图4和参考文献18）。 染色的均匀性和非活细胞可以从分析中排除既影响染料稀释曲线，这反过来又影响的扩散模型的选择，以适应所观察到的数据（ 图5和图6是显而易见，是否区分的女儿峰的程度</strong&gt;）。这里使用的是，虽然ModFit（真理图软件House，托普瑟姆的。，ME）的软件用于生成等指标的扩散指数和前体频率（ 图3，图5和图6，表3）作为一个例子，其他软件包还包含模块分析增殖的数据。这些：包括FCSExpress（诺和软件，洛杉矶，CA）和FlowJo（树星公司，亚什兰，OR）。所有这些方案都使用一个非线性最小二乘分析，以迭代找到最适合的原始数据通过改变的位置，高度和SD（或宽度）的高斯峰，表示顺序的女儿代。增殖指数（PI）和前驱体频率（PF）是最常用的措施的增殖程度。 PI，定义由ModFit，是在测定过程中的细胞数量增加，类似于“刺激指数&#39;胸苷摄取试验的措施。 PF返回的馏分中的单元格的初始populat离子的刺激增殖。应注意，但是，当阅读文学术语有所不同套装软件之间（ 例如 ，，FlowJo和ModFit使用不同的定义和计算是什么意思“的扩散指数”）22。 用蛋白染料时也遇到了标签和膜染料的扩散分析与这里讨论的关键问题。例如，必须小心注意混合技术也可以观察到，随着排除死/死亡的细胞，为了获得均匀的分布和使用的CFSE的（ 图6）2-4,13,18,24区分女儿峰。选用合适的荧光染料的表型和生存能力评估也是很重要的，以避免过度的频谱重叠，无法识别抗体阳性细胞，特别是与可见光的发光蛋白染料如CFSE 2-4,11,13,16,18 </sup&gt;。减少跟踪染料的浓度降低赔偿的问题，在相邻光谱通道，但也限制了数量的细胞分裂，可监测的前子细胞与自体荧光强度开始重叠。另外，使用新的细胞示踪染料，如远红外发光CellVue干红葡萄酒（Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，MO）或紫色的发光CellTrace紫（Life Technologies公司，大岛，NY）可能会降低赔偿的问题（ 图6）。最后，虽然膜的染料一般倾向于表现出较少的毒性11,26，它是可能的过与任一类的染料标记细胞。于是，它总是必要的验证，跟踪使用的染料的浓度并没有改变的细胞，以进行跟踪的功能（ 图6）3,13,16,18。

<table border="1"><tbody><tr><td> 试剂或设备 </td><td> 公司 </td><td> 目录编号 </td><td> 评论 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 市售的 </td></tr><tr><td> 7 - 氨基放线菌素D </td><td> Sigma-Aldrich公司</td><td> A9400 </td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA） </td><td> Sigma-Aldrich公司</td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td>牛胎儿血清（FBS）的</td><td>亚特兰大生物</td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks平衡盐溶液（HBSS） </td><td> Life Technologies公司</td><td> 14175-079 </td><td>钙和镁的自由，不加酚红</td></tr><tr><td>人IgG Cohn组分II和III球蛋白</td><td> Sigma-Aldrich公司</td><td> G-4386 </td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人CD3-FITC </td><td> BD Biosciences公司</td><td> 349201 </td><td>饱和浓度由实验室滴定</td></tr><tr><td>小鼠抗人CD4-APC </td><td> BD Biosciences公司</td><td> 340672 </td><td>饱和浓度由实验室滴定</td></tr><tr><td>小鼠抗人CD4 PECy7 </td><td> BD Biosciences公司</td><td> 348799 </td><td>饱和浓度由实验室滴定</td></tr><tr><td>小鼠抗人CD8-FITC </td><td> BD Biosciences公司</td><td> 347313 </td><td>饱和浓度由实验室滴定</td></tr><tr><td>小鼠抗人CD8-APC </td><td> CALTAG（Life Technologies公司） </td><td> MHCD0805 </td><td>饱和浓度由实验室滴定</td></tr><tr><td>小鼠抗人CD19-APC </td><td> CALTAG（Life Technologies公司） </td><td> MHCD1905 </td><tD&gt;饱和浓度由实验室滴定</td></tr><tr><td>小鼠抗人CD25-APC </td><td> BD Biosciences公司</td><td> 340938 </td><td>饱和浓度由实验室滴定</td></tr><tr><td>小鼠抗人CD127-PE </td><td> BD Biosciences公司</td><td> 557938 </td><td>饱和浓度由实验室滴定</td></tr><tr><td>小鼠抗人CD3 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0037-85 </td><td> 1.0毫克/毫升;磷酰基叠氮化物的免费</td></tr><tr><td>的小鼠抗人CD28 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0289-85 </td><td> 1.0毫克/毫升;磷酰基叠氮化物的免费</td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco公司</td><td> 21300-058 </td><td></td></tr><tr><td> PKH26红色荧光的细胞连接器套件，包含10-3M PKH26在乙醇和稀释剂Ç </td><td> Sigma-Aldrich公司</td><td> PKH26GL-1KT 或 MINI26-1KT </td><td>第1步中的程序也适用箱PKH67或其他CellVue的染料</td></tr><tr><td>枣红远CellVue红色荧光细胞连接器套件，包含10-3M CellVue的干红葡萄酒在乙醇和稀释剂Ç </td><td> Sigma-Aldrich公司</td><td>的MINCLARET 1KT或MIDCLA​​RET的-1KT </td><td></td></tr><tr><td> 5 - （和6） - 羧基荧光素二乙酸酯，琥珀酰亚胺基酯（CFDA-SE） </td><td> Invitrogen公司（Life Technologies公司） </td><td> C34554 </td><td>非荧光;裂解膜酯酶形成荧光与氨基反应的羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯（CFSE） </td></tr><tr><td> LIVE / DEAD绝不紫</td><td> Invitrogen公司（Life Technologies公司） </td><td> L34955 </td><td></td></tr><tr><td>无菌12×75毫米同轴 聚丙烯管帽</td><td> VWR </td><td> 60818-102 </td><td>提供了更好的膜染色效率（减少染料的吸附，减少细胞损失在上清愿望） </td></tr><tr><td> 12×75毫米的圆钢ð底部 聚苯乙烯管</td><td> Becton Dickinson公司</td><td> 21008-936 </td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td> BD生物科学</td><td> FACSCalibur LSRFortessa </td><td>任何能够检测FITC，PKH26，和7-AAD（例如488纳米;时间520纳米，567纳米和655纳米，分别）和APC前的流式细胞仪。 633-640 nm的时间。 660 nm）的</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td> Beckman Coulter公司</td><td> LSRII青色</td><td>任何能够检测FITC，PKH26，和7-AAD（例如488纳米;时间520纳米，567纳米和655纳米，分别）和APC前的流式细胞仪。 633-640 nm的时间。 660 nm）的</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 实验室制备 </td></tr><tr><td> 7 - 氨基放线菌素D， 集中持股</td><td> NA </td><td> NA </td><td>在PBS中的1毫克/毫升。冻结分装并储存于-20°C。 </td></tr><tr><td> 7 - 氨基放线菌素D， WOR王股票</td><td> NA </td><td> NA </td><td>在PBS的100微克/毫升，准备每天1毫克/毫升冷冻的股票。 </td></tr><tr><td>抗体块</td><td> NA </td><td> NA </td><td> HBSS + 10毫克/毫升人IgG Cohn组分II和III球蛋白+ 10毫克/毫升BSA。 </td></tr></tbody></table>

optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes

荧光细胞跟踪染料，与流量和图像流式细胞仪组合使用，是强大的工具，与不同类型的细胞在体外和体内研究的相互作用和命运1-5虽然使用这种染料的出版物有数千个，一些最常遇到的细胞追踪应用包括监测： <ol><li>干细胞和祖细胞静止，增殖和/或分化6-8 </li><li>抗原驱动的膜转移9和/或前体细胞的增殖3,4,10-18和</li><li>免疫调节和效应细胞的功能1,18-21。 </li></ol>市售的细胞示踪染料有很大的不同，它们的化学性质和荧光性质，但绝大多数落入两班的基础上他们的标记细胞的机制之一。 “膜染料”，以PKH26，高度亲脂性染料吨帽子分区稳定，但非共价结合到细胞膜1,2,11。 “蛋白质染料”，为代表的CFSE的氨基形成稳定的共价键的反应性染料与细胞蛋白4,16,18。每个等级都有其自身的优势和局限性。他们的成功使用的关键，特别是在多色多种染料的研究被用来跟踪不同类型的细胞，因此，实现最佳的使用每类2-4,16,18,24的了解的关键问题。 这里突出的协议包括三种常见的原因的穷人或不同的结果，当细胞示踪染料。这些是： <ol><li> 未能达到明亮，均匀的，可重复的标签 。这是一个必要的任何单元格追踪研究的出发点，但不同的变量时，用膜染料，而不是用蛋白染料或平衡结合，如抗体的试剂时，需要注意。 </li><li> 次优荧光合并ND /或不包括关键的补偿控制。跟踪染料的荧光一般是10 - 10 的3倍亮度比荧光抗体。因此，这是必需的验证，跟踪染料的存在下，不侵入的能力来检测正在使用的其他探针。 </li><li> 没有的峰值建模软件，以获得一个不错的选择 。这种软件可以定量比较不同人群或前体频率或其他指标的基础上刺激的增殖反应。获得一个不错的选择，但是，需要排除的死/死细胞，它可以扭曲染料稀释配置文件和匹配的基本特点，所观察到的染料稀释曲线模型的假设。 </li></ol>这里给出的实施例示出了如何将这些变量可以影响的结果，当使用膜的染料和/或蛋白质，以便监测细胞增殖。

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes at JoVE.com

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

成功地利用监测免疫细胞的功能和增殖的细胞追踪染料涉及的几个关键步骤。我们描述的方法为：1）获得明亮，均匀，重现性好标签的膜染料; 2）选择荧光染料和数据采集条件; 3）选择一个模型来量化细胞增殖的基础上染料稀释。

优化细胞分裂监测细胞示踪染料的染色和扩散建模方法

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

使用CyDye DIGE Fluor公司最小染料的细胞表面蛋白的选择性标签

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

科研

生物学

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

现场剖析果蝇胚胎抗体染色筛选突变体集合的简化方法

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

确定在细胞培养的细胞数量，使用权杖细胞计数

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

使用一种基因编码的钙传感器来监测细胞凋亡过程中线粒体钙水平的动态变化

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

在斑马鱼发育的细胞追踪使用Photoconvertible蛋白

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

在体内病态的人类基因组建模使用斑马鱼

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

组织化学染色<em&gt;拟南芥</em&gt;次生壁元素

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

对于皮肤伤人方法和测定的伤口响应<em&gt;温度。线虫</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

细胞周期进程的时间跟踪使用流式细胞仪，无需同步

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

的三种不同方法对乳腺癌细胞株确定细胞增殖的比较

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...