Name: optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes
Uploaded: 2012-12-13T12:00:00
Duration: 22 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes at JoVE.com

Forfatterne vil især gerne takke følgende personer for deres tekniske og intellektuelle bidrag til udviklingen af ​​disse metoder gennem årene: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nadege Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis Cell Science og PTI Research) , Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice Givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc.), og Mary Waugh (Dartmouth Medical School). De vil også gerne takke Bowdoin klassen af 2006 fra de årlige Kurser i Research Methods and Applications af flowcytometri, som har frembragt de data, der er vist i figur 2. Flowcytometri blev udført ved Roswell Park Cancer Institute Flowcytometri Laboratory, som blev etableret delvist af udstyr tilskud fra NIH Shared Instrument Program, og modtager støtte fra Core Grant (5 P30 CA016056-29) fra NationalCancer Institute til Roswell Park Cancer Institute, og på Abramson Cancer Center Flowcytometri og Celle Sortering Resource Laboratory ved University of Pennsylvania, som blev etableret delvist af udstyr tilskud fra NIH Shared Instrument Program, og modtager støtte fra NIH # 2P30 CA016520 fra National Cancer Institute. Arbejdet er vist i figur 3 og 5 blev også delvist understøttet af SBIR tilskud EB00228 fra National Institutes of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) udstedt til PTI Research, Inc.

1. Generelt Membran Mærkning med PKH26 Cell Tracking Dye (ref. 25, figur 1) <ol><li> Brug steril teknik for trin fra 1,1 til 1,9. Forbered ~ 10 7 humane perifere mononukleære blodceller eller lymfocytter (hPBMC, HPBL) ved hjælp af laboratoriets standardmetoden med tilsætning af en endelig 300 xg centrifugering for at minimere blodplade-kontaminering. Resuspender cellerne ved 10 7 / ml i HBSS + 1% BSA og anbring på is, reservere en 500 pi portion (5x10 6 celler) til anvendelse i trin 2. </li><li> Place 5x10 6 celler (500 ul) i en 12 x 75 mm konisk polypropylenrør. Vask en gang med 3,5 ml HBSS. Forsigtigt sug supernatanten, så ikke mere end 15-25 ul residualvæske, men pas på ikke at fjerne celler. Brug dette rør til fremstilling af en 2x cellesuspension i trin 1.4. </li><li> I cellen vask i trin 1.2, tilsættes 0,5 ml Diluent C mærkning køretøj (fra PKH26GL kit) til et 12 x 75 mm konisk polypropylenrør. Brug dette rør til preper en 2x PKH26 opløsning i trin 1.5. </li><li> Tilsæt 0,5 ml Diluent C mærkning køretøj til den vaskede cellepellet fra trin 1.2 og opsuge og udlevere 3-4 gange til opnåelse af en enkelt cellesuspension (2x celler). Undgå dannelse af luftbobler og overdreven blanding, som kan reducere cellelevedygtigheden og nyttiggørelse. </li><li> Umiddelbart efter fremstilling af 2x cellesuspension i trin 1.4, udarbejde et 2x (4 uM) farveopløsning ved tilsætning af 2,0 pi 1,0 mM PKH26 dye stamopløsning i ethanol (fra PKH26GL kit) til Diluent C røret fremstillet i trin 1.3 og vortex til spredes jævnt. </li><li> Umiddelbart efter fremstilling af 2x farveopløsning i trin 1,5, pipetteres hurtigt 2x cellesuspension fra trin 1,4 til 2x farveopløsning og samtidig Sug og dispensere 3-4 gange for helt at sprede celler i farvestof må ikke:. Tilføje 1,0 mM farvestof direkte til celler, hæld 2x celler i 2x farvestof, eller tilføje 2x celler til 2x farvestof medens der blev hvirvelbehandlet. Idet farvningen er næsten øjeblikkelig, sådanne metoder giver mindreensartede intensiteter end den anbefalede metode (figur 2). </li><li> Efter 1 min, tilsæt 1,0 ml af varmeinaktiveret serum eller HBSS + 5% BSA til at stoppe farvestofoptagelse i cellemembraner. Hvis der ikke anvendes tilstrækkeligt protein risikerer dannelse af farvestof-aggregater, der kan pellet med celler under vasketrinene og forårsage utilsigtet mærkning af andre celler til stede i et eksperiment. Hvis medium med 10% varmeinaktiveret serum (CM) eller HBSS +1% BSA skal anvendes som stopreagens, foretager farvning i et 15 ml konisk polypropylenrør, og der tilsættes mindst 5,0 ml stopreagens for at sikre adsorption af alle ikke-inkorporeret farvestof. </li><li> Centrifuger de mærkede celler i 5 min @ ~ 400 x g. Forsigtigt sug supernatanten uden at fjerne celler. Vask pelleten to gange med 4 ml CM eller HBSS + 1% BSA, dispergering pelleten længe før recentrifugering. For at minimere overførsel af farvestof adsorberes på rørvæggene og maksimere vaskeeffektiviteten, overfører cellerne til et frisk polypropylenrør efter first resuspension. Bemærk: tilstrækkeligt farvede celler vil udvise en udpræget rosa skær i pelleten. </li><li> Resuspendere det vaskede cellepellet i 1,0 ml HBSS + 1% BSA. Tæl cellerne, bestemme celleindvinding, og justere volumen til opnåelse af en slutkoncentration på 10 7 / ml. Med omhyggelig aspiration, bør celleindvinding være ≥ 85%. Hvis celle opsving er &lt;70%, fastslå årsagen før du går videre. Træk en 150 gl alikvot (1.5x10 6 celler) og sted på is til brug i trin 2. </li></ol> 2. Udarbejdelse af Instrument-og Assay Setup Controls (tabel 1) <ol><li> Portion 50 gl (5x10 5) af ufarvede celler fra cellesuspensionen gemt i trin 1,1 i hver af fem 1,8 ml Eppendorf-rør: 1, 3, 4, 5 og 7. Portion 50 gl (5x10 5) af PKH26 pos celler fra trin 1,9 i hvert af tre rør: 2, 6 og 8. </li><li> Tilsæt 10 gl IgG blok (100 ug / rør af IgG, jf. tabel af reagenser) til rør 1-8og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur (20-25 ° C). </li><li> Tilføj en mættende mængde af antistoffet (e) angivet i tabel 1 til rørene 4, 5, 7 og 8 og inkuberes alle prøver (Rør 1-8) i 30 min ved omgivelsestemperatur og beskyttet mod lys. </li><li> Tilsættes 1,5 ml HBSS + 1% BSA til alle prøver, pelletering af cellerne ved centrifugering (5 min @ 400 x g) og vaskes én gang med 1,5 ml HBSS + 1% BSA, med omhyggelig aspiration at undgå celletab. </li><li> Resuspender hver prøve i 500 ul HBSS +1% BSA. Hvis det er nødvendigt, at prøver skal analyseres på din cytometer, overførsel til en 12 x 75 mm rund bund rør. Der tilsættes 10 pi af 100 ug / ml 7-AAD dagligt arbejdslager (se tabel af reagenser) til rør 3, 6, 7 og 8 som angivet i tabel 1. Der inkuberes på is i 30 minutter før anvendelse i flowcytometeret opsætning og farvning verifikation (trin 3). </li></ol> 3. Flow Cytometer Setup og Staining Verifikation <ol><li> Kontroller, at strømmen cytometer fungerer korrekt, ved hjælp af laboratoriets etablerede procedurer for daglig kvalitetskontrol. Kontrollere, at signaler let kan påvises i hver spektral vindue, der skal anvendes, og at detektorresponsene er lineært proportional med signalintensitet i vinduet skal anvendes til proliferation overvågning 14. </li><li> Erhverve FSC vs SSC data for Tube 1 under anvendelse af lineære display skalaer. Justere hver enkelt detektors forstærkning, således at lymfocytpopulationen falder i den nedre venstre kvadrant af dot-plot, ikke uden for skalaen i enten parameter, og er ikke afbrudt på grund af tærskelværdiansættelse. Saml ungated FSC vs SSC data for alle prøver i Steps 3,3 til 3,7. </li><li> Erhverve data for Rør 1 uden brug af farve-kompensation og logaritmiske displayskalaer for alle 4 fluorescens detektorer. Justere hver enkelt detektors højspænding (HV) for at placere autofluorescens af ufarvede lymfocytter i skala med nogle få / ingen celler akkumuleres i den første kanal. Indstil en analyse grænse for hvert histogramsvarende til den lyseste 2% af ufarvede celler. </li><li> Brug ingen farve kompensation og HV-indstillingerne er etableret i trin 3,2 og 3,3, erhverve data for Tube 2, indsamling FSC, SSC og signaler i alle 4 fluorescens detektorer. For detektoren bruges til at overvåge PKH26 fluorescens, kontrollere, at alle PKH26 pos celler vises på skalaen som en enkelt symmetrisk spids i 3 rd -4 th årti med få / ingen celler i den sidste kanal. Hvis der er flere toppe eller topform er skæv, skal du gentage trin 1 med omhyggelig opmærksomhed på salt minimering og blanding teknik (figur 2). Hvis det er nødvendigt, justeres farvestof koncentration. </li><li> Brug af indstillinger, der er etableret i trin 3,3 erhverve data for Tube 3, indsamle FSC, SSC og signaler i alle 4 fluorescens detektorer. For detektoren anvendes til at overvåge 7-AAD fluorescens, kontrollere, 7-AAD pos celler falder over 2% grænsen er etableret i trin 3.3 (dvs., at ikke-levedygtige celler er godt afklaretfra levedygtige 7-AAD neg celler). </li><li> Brug af indstillinger, der er etableret i trin 3,3 erhverve data for Tube 4, indsamle FSC, SSC og signaler i alle 4 fluorescens detektorer. Kontroller, at CD8 pos celler godt løses fra ufarvede celler (dvs. falder over 2% grænsen er etableret i trin 3,3 til FITC detektor). Gentag med Tube 5 og kontrollere, at CD8 pos celler godt løses fra ufarvede celler (dvs. falder over 2% grænsen er etableret i trin 3,3 til APC detektor). </li><li> Brug af indstillinger, der er etableret i trin 3,3 erhverve data for Tubes 6, 7 og 8, indsamling FSC, SSC og signaler i alle 4 fluorescens detektorer. </li><li> Brug listningsmåde filer indsamlet for Tubes 1-5 og din farve kompensation software til at etablere en farve overlapper matrix for hver fluorokrom i detektorerne, der anvendes til at overvåge de tre andre fluorochromer. Anvend denne matrix til listen inodefilen for Prøve 6 og kontroller, at tilstedeværelsen af ​​PKH26 labeling ændrer ikke kan detektere 7-AAD pos celler. </li><li> Påfør farven overlapper matrix fra trin 3,8 til listen inodefilen for prøve 7 og kontrollere, at: a) 3 godt opløste undergrupper (CD3 neg CD4 neg, CD3 pos CD4 neg og CD3 pos CD4 pos) kan identificeres på et FITC vs APC dot plot, og b) tilstedeværelsen af anti-CD3-FITC og anti-CD4-APC ændrer ikke kan detektere 7-AAD pos celler. Hvis tilstedeværelsen af ​​anti-CD3-FITC ændrer den øvre 2% grænse for data indsamlet på PKH26 detektoren, justere grænsen efter behov. </li><li> Påfør farven overlap matrix fra trin 3,8 til listen inodefilen for prøve 8. Hvis tilstedeværelsen af PKH26 mærkning ændrer 2% grænse for FITC, 7-AAD eller APC detektorer fra dem, der ved hjælp af autofluorescens kontrol i trin 3,3, justere grænsen (e) efter behov ved hjælp Tube 7 i tabel 1 og kontroller, at den er stadig muligt at distinguish CD3 pos CD4 pos, CD3 pos CD4 neg, og CD3 neg CD4 neg-celler ved hjælp af justerede grænse (erne). </li></ol> 4. Proliferation Model Selection for celledeling Overvågning af Dye Fortynding <ol><li> Bestemme afstanden mellem generationer, hvilket er afhængig af antallet af kanaler og logaritmiske årtier på din cytometer. For digitale apparater, er denne værdi, typisk 4 eller 5 årtier, bestemmes af antallet af beholdere i den digitale signalprocessor. På analoge instrumenter, hvor antallet af årtiers er sjældent et helt tal præcis modellering kræver det præcise antal årtier, der skal bestemmes eksperimentelt. For at gøre dette, er data fra en blanding af kalibrerede fluorescerende perler med producent-tildelt relative intensiteter erhvervet på samme detektor høj spænding, der bruges i forsøget. Positionen af ​​vulsten toppe tillader kalibrering af logaritmisk skala med hensyn til intensity interval pr log årti. Specifikt gøres dette ved at plotte kanalnummeret for hver perletype mod logaritmen af ​​producenten angivne værdi. Hældningen af ​​den bedst passende rette linie for vulsten dataværdier angiver antallet af relativ intensitet enheder pr kanal. Ganget med antallet af kanaler, vil denne værdi så være antallet af log årtier til fuld skala, hvorfra antallet af kanaler svarer til et to gange fald i intensitet (dvs. datter generation afstand) kan beregnes 14. </li><li> Beslutte, om der skal bruges en fast afstand mellem generationerne eller tillade afstanden til at flyde. En Standard (fast) indstilling vil bruge generationsskiftet afstand værdi, der bestemmes i trin 4,5 til tildele placeringen af hver generation, og bruges typisk, når histogrammet mangler tydelige toppe. En Float indstilling tillader hver generationsskifte spidsposition, der fastsættes af histogrammet form og anvendes typisk, når distinguishable generationerne toppe er indlysende. </li><li> Beslut om du vil bruge en fast topbredde for alle generationer, eller en flydende bredde. En fast bredde bruger SD beregnet for den ustimulerede kontrolprøve at modellere alle generationer og vælges typisk når prøven mangler skelnelige generationsskifte toppe. En flydende bredde giver programmet til selvstændigt variere SD for hver generation og er bedst bruges sammen med skelnelige generationsskifte toppe. </li><li> Kør et program, der indeholder en spredning analyse modul (her ModFit LT Version 3,3). Indlæse den stimulerede PKH26 pos fil fra de datasæt, der skal analyseres (fx en stimuleret 96 timers kultur af PKH26 pos celler modfarvet som for røret 8 i tabel 1). </li><li> Vælge parametrene til analyse, i dette tilfælde PKH26 (585/42) gatet på levedygtige (7-AAD neg) CD3 pos lymfocytter og FSC versus SSC at udelukke mindre affald og store aggregater (figur 3). Ved fastlæggelsendisse regioner være omhyggelig med at medtage den høje forward scatter område, hvor blaster findes typisk og bemærk, at CD3 ekspression kan være ned-moduleret i stimulerede kulturer. </li><li> Opret en ny spredning model ved hjælp af spredning Wizard. Brug af Open Data File (Start fane), indlæse den ustimulerede PKH26 pos kontrol fil og definere placeringen af top kanal i forældrenes fordeling svarende til udelte celler. </li><li> Analysere filen for den ustimulerede PKH26 pos kontrol, konstaterer værdierne for forældrenes peak position og bredde (standardafvigelse). Hvis en fast topbredde (SD) ønskes, tjek Lås SD. </li><li> Indlæse PKH26 neg kontrol (fx en 96 timers kultur af PKH26 neg-celler modfarvet som for røret 7 i tabel 1). Justere antallet af generationer ved at indstille den maksimale kanal for dimmest generation over PKH26 neg kontrol. Det bestemmer Number af datter generationer modellen kan præcist passer og er typisk 6-9 generationer. </li><li> Åbn datafilen for den stimulerede prøve (fx en stimuleret 96 timers kultur af PKH26 pos celler modfarvet som for Tube 8 i tabel 1), og bekræfter, at regionerne for forældrenes spidsposition og SD, som defineret i trin 4,7 forbliver uændrede. Hvis fast generationsskifte afstand ønskes, skal du vælge Standard model option, ellers vælge Floating mulighed. </li><li> Analyser hver eksperimentel fil i datasættet, efter samme model som defineret i trin 4,9. Mindre justeringer af forældrenes spidsposition kan være nødvendig for den allerbedste pasform som defineret både visuelt og ved den reducerede chi kvadrat (RCS) værdi. </li><li> Optag de ønskede spredning målinger som følge af best-fit for hver eksperimentel fil i datasættet. For en omfattende beskrivelse af mulige målinger se ref. 22. </li></ol>

<ol>
	<li>Poon, R. Y., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Bagwell, C. B., Muirhead, K. A., Diamond, R. A., DeMaggio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+PKH+Membrane+Intercalating+Dyes+to+Monitor+Cell+Trafficking+and+Function.">Use of PKH Membrane Intercalating Dyes to Monitor Cell Trafficking and Function.</a> Living Color: Flow Cytometry and Cell Sorting Protocols. , 302-352 (2000).</li><li>Wallace, P. K., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Tracking+2007:+A+Proliferation+of+Probes+and+Applications.">Cell Tracking 2007: A Proliferation of Probes and Applications.</a> Immunol. Invest. 36, 527-562 (2007).</li><li>Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+lymphocyte+proliferation,+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data.">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nat. Protoc. 2, 2057-2067 (2007).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat. Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li><li>Bolton, D. L., Minang, J. T., Trivett, M. T., Song, K., Tuscher, J. J., Li, Y., Piatak, M., O'Connor, D., Lifson, J. D., Roederer, M., Ohlen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking,+Persistence,+and+Activation+State+of+Adoptively+Transferred+Allogeneic+and+Autologous+Simian+Immunodeficiency+Virus-Specific+CD8++T+Cell+Clones+during+Acute+and+Chronic+Infection+of+Rhesus+Macaques.">Trafficking, Persistence, and Activation State of Adoptively Transferred Allogeneic and Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones during Acute and Chronic Infection of Rhesus Macaques.</a> J. Immunol. 184, 303-314 (2010).</li><li>Juopperi, T. A., Sharkis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Quiescent+Murine+Hematopoietic+Stem+Cells+by+Homing+Properties.">Isolation of Quiescent Murine Hematopoietic Stem Cells by Homing Properties.</a> Meth. Mol. Biol. 430, 21-30 (2008).</li><li>Kusumbe, A. P., Bapat, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+aneuploid+populations+within+developing+tumors+are+the+major+determinants+of+tumor+dormancy.">Cancer stem cells and aneuploid populations within developing tumors are the major determinants of tumor dormancy.</a> Cancer Res. 69, 9245-9253 (2009).</li><li>Pece, S., Tosonim, D., Confalonieri, S., Mazzarol, G., Vecchi, M., Ronzoni, S., Bernard, L., Viale, G., Pelicci, P. G., Fiore, P. P. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+Molecular+Heterogeneity+of+Breast+Cancers+Correlates+with+Their+Cancer+Stem+Cell+Content.">Biological and Molecular Heterogeneity of Breast Cancers Correlates with Their Cancer Stem Cell Content.</a> Cell. 140, 62-73 (2010).</li><li>Gertner-Dardenne, J., Poupot, M., Gray, B. D., Fourni&#233;, J. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+fluorochrome+trackers+of+membrane+transfers+between+immune+cells.">Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells.</a> Immunol. Invest. 36, 665-685 (2007).</li><li>Bercovici, N., Givan, A. L., Waugh, M. G., Fisher, J. L., Vernel-Pauillac, F., Ernstoff, M. S., Abastado, J. P., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+precursor+analysis+of+T-cell+responses+to+antigen.">Multiparameter precursor analysis of T-cell responses to antigen.</a> J. Immunol. Methods. 276, 5-17 (2003).</li><li>Givan, A. L., Fisher, J. L., Waugh, M. G., Bercovici, N., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cell-tracking+dyes+to+determine+proliferation+precursor+frequencies+of+antigen-specific+T+cells.">Use of cell-tracking dyes to determine proliferation precursor frequencies of antigen-specific T cells.</a> Methods Mol. Biol. 263, 109-124 (2004).</li><li>Schwaab, T., Tretter, C. P., Gibson, J. J., Cole, B. F., Schned, A. R., Harris, R., Fisher, J. L., Crosby, N., Stempkowski, L. M., Heaney, J. A., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-related+immunity+in+prostate+cancer+patients+treated+with+human+recombinant+granulocyte+monocyte-colony+stimulating+factor+(GM-CSF).">Tumor-related immunity in prostate cancer patients treated with human recombinant granulocyte monocyte-colony stimulating factor (GM-CSF).</a> Prostate. 66 (6), 667-674 (2006).</li><li>Bantly, A. D., Gray, B. D., Breslin, E., Weinstein, E. G., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellVue+Claret,+a+New+Far-Red+Dye,+Facilitates+Polychromatic+Assessment+of+Immune+Cell+Proliferation.">CellVue Claret, a New Far-Red Dye, Facilitates Polychromatic Assessment of Immune Cell Proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 581-605 (2007).</li><li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+assay+for+quantitation+of+rare+antigen-specific+T-cells:+using+cell-tracking+dyes+to+calculate+precursor+frequencies+for+proliferation.">A flow cytometric assay for quantitation of rare antigen-specific T-cells: using cell-tracking dyes to calculate precursor frequencies for proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 563-580 (2007).</li><li>Tario, J. D., Gray, B. D., Wallace, S. S., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lipophilic+tracking+dyes+for+monitoring+cell+proliferation.">Novel lipophilic tracking dyes for monitoring cell proliferation.</a> Immunol Invest. 36, 861-885 (2007).</li><li>Wallace, P. K., Tario, J. D., Fisher, J. L., Wallace, S. S., Ernstoff, M. S., , ., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Antigen-Driven+Responses+by+Flow+Cytometry:+Monitoring+Proliferation+by+Dye+Dilution.">Tracking Antigen-Driven Responses by Flow Cytometry: Monitoring Proliferation by Dye Dilution.</a> Cytometry. 73, 1019-1034 (2008).</li><li>Barth, R. J., Fisher, D. A., Wallace, P. K., Channon, J. Y., Noelle, R. L., Gui, J., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Randomized+Trial+of+Ex+vivo+CD40L+Activation+of+a+Dendritic+Cell+Vaccine+in+Colorectal+Cancer+Patients:+Tumor-Specific+Immune+Responses+Are+Associated+with+Improved+Survival.">A Randomized Trial of Ex vivo CD40L Activation of a Dendritic Cell Vaccine in Colorectal Cancer Patients: Tumor-Specific Immune Responses Are Associated with Improved Survival.</a> Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).</li><li>Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Immune+Cell+Proliferation+and+Cytotoxic+Potential+Using+Flow+Cytometry.">Tracking Immune Cell Proliferation and Cytotoxic Potential Using Flow Cytometry.</a> Meth. Mol. Biol. 699, 119-164 (2011).</li><li>Fuse, S., Underwood, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Analysis+of+In+Vivo+CD8++T+Cell+Cytotoxicity+Against+Multiple+Epitopes+using+Multicolor+Flow+Cytometry.">Simultaneous Analysis of In Vivo CD8+ T Cell Cytotoxicity Against Multiple Epitopes using Multicolor Flow Cytometry.</a> Immunol. Invest. 36, 829-845 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Fleck, M., Mackensen, A., Zoso, A., Halbritter, D., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111, 3546-3552 (2008).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+cellular+proliferation+data:+Avoid+the+panglossian.">Interpretation of cellular proliferation data: Avoid the panglossian.</a> Cytometry. 79A, 95-101 (2011).</li><li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+(CFSE)+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation.">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> J. Vis. Exp. (44), e2259 (2010).</li><li>Houlihan, D. D., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Review+of+Clinical+Trials+of+Bone+Marrow+Stem+Cells+in+Liver+Disease.">Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease.</a> Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).</li><li>Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+In+Vitro+Suppressive+Capacity+of+Regulatory.">Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory.</a> T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).</li></ol>

K. Humphrey, JD Tario, Jr. og PK Wallace har modtaget prækommercielle cellesporing reagenser til evaluering fra Life Technologies, Inc. og BD Biosciences. AD Bantly og JS Moore har modtaget prækommercielle celle sporing reagenser til evaluering fra Life Technologies, Inc. og finansiering fra PTI Research, Inc. for prækommercielle karakterisering af forskellige CellVue celle sporing farvestoffer. K. Muirhead er ansat i SciGro, Inc., som leverer konsulentydelser til Phanos Technologies, Inc. (ejeren af ​​PKH og CellVue farvestoffer) og yder backup teknisk support til Sigma-Aldrich og Molekylær Targeting Technologies, Inc. (forhandlere af disse farvestoffer). Produktion og fri adgang til denne artikel er sponsoreret af Sigma-Aldrich.

De metoder, der er beskrevet her, er dem, der findes i vores kombinerede laboratorier til mest pålideligt at give optimale resultater for hPBMC mærkning ved hjælp af membran farvestoffer 13,16,18 og for lymfocytdelmængde fænotypebestemmelse og spredning sporing ved hjælp af enten membran eller protein farvestoffer 2,11,13,16, 18. Som vist i figur 1 og 2, er lyse ensartet mærkning lettest opnås ved at begrænse tilstedeværelsen af fysiologiske salte og anvendelse af et blandings teknik, som resulterer i hurtig, ensartet eksponering af alle celler i den samme koncentration af farvestof. Fordi farvning med membran farvestoffer sker ved opdeling i lipiddobbeltlaget, kan andre variabler, som ændrer frit farvestof koncentration også påvirke mærkningseffekt. For eksempel mærkning i rundbundede polystyrenrør resulterer i mindre effektiv udvaskning af salte forud for resuspendering i Diluent C og også i reduceret frit farvestof koncentration på grund af farvning af adsorption på rørvæggene, isærved lavere farvestofkoncentrationer. Begge faktorer tendens til at give bredere farvning fordelinger end når mærkning udføres under anvendelse konisk bund polypropylenrør (figur 3, 4 og upublicerede resultater). Prøve alder og type kan også påvirke topbredde selv når optimerede farvningsprocedurer anvendes. For eksempel CV&#39;er for PKH26 pos lymfocytter isoleret fra frisktappet blod spænder fra 14-20% (figur 3, ref. 13 og upublicerede resultater), mens CV&#39;er for lymfocytter isoleret fra 24 hr gamle blodprøver eller TRIMA pheresis filtre spænder fra 25 til 30 % (figur 4 og ref. 18). Farvning ensartethed og i hvilket omfang ikke-levedygtige celler kan udelukkes fra analysen både indflydelse på, om skelnelige afledte toppe tydelige i farvestoffet fortynding profil, som igen påvirker valget af en spredning model til at passe de observerede data (figur 5 og 6 </strong&gt;). Selvom ModFit (Verity Software House, Topsham, ME) bruges her som et eksempel på software, der bruges til at generere parametre såsom spredning Index og Precursor frekvens (figur 3, 5 og 6, Tabel 3), andre software pakker indeholder også moduler til at analysere spredning data. Disse omfatter FCSExpress (De Novo Software, Los Angeles, CA) og FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR). Alle disse programmer bruger en ikke-lineær mindste kvadraters analyse til iterativt finde den bedst egnede til de rå data ved at ændre position, højde og SD (eller bredde) af gaussiske toppe, der repræsenterer sekventielle datter generationer. Proliferativ Index (PI) og Precursor Frequency (PF) er de mest almindeligt anvendte foranstaltninger omfang af spredning. PI, som defineret af ModFit, er et mål for stigningen i celleantallet i løbet af assayet, analogt med &quot;stimulation index&quot; af en thymidinoptagelsesassay. PF returnerer fraktion af celler i den oprindelige population, der reagerede på stimulus ved breder sig. Der bør udvises forsigtighed, men når man læser litteratur siden terminologi varierer noget blandt softwarepakker (f.eks FlowJo og ModFit bruger forskellige definitioner og beregninger for, hvad der menes med &quot;spredning Index&quot;) 22. De kritiske spørgsmål, der drøftes her for mærkning og spredning analyse med membran farvestoffer er også stødt på, når du bruger protein farvestoffer. For eksempel skal omhyggelig med blandeteknik også observeres sammen med udelukkelse af døde / døende celler, for at opnå ensartede fordelinger og skelnelige afledte toppe ved brug CFSE (fig. 6) 2-4,13,18,24. Passende valg af fluorochromer til fænotypebestemmelse og rentabilitetsvurderingen er også vigtigt at undgå for store spektral overlapning og manglende evne til at genkende antistof-positive celler, især med synlige emitterende protein farvestoffer, såsom CFSE 2-4,11,13,16,18 </sup&gt;. Reduktion af koncentrationen af ​​sporing farvestof nedsætter erstatning problemer i tilstødende spektrale kanaler, men også begrænser antallet af celledelinger, som kan overvåges før datter celle intensiteter begynder at overlappe med autofluorescens. Alternativt kan du bruge af nyere cellesporing farvestoffer, såsom den langt rød emitterende CellVue Claret (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) eller violet udsender CellTrace Violet (Life Technologies, Grand Island, NY) kan nedsætte erstatningen problemer (figur 6). Endelig, selv membran farvestoffer generelt tendens til at udvise mindre toksicitet 11,26, er det muligt at over-mærkning af celler med enten klasse af farvestof. Det er derfor altid nødvendigt at kontrollere, at koncentrationen af sporing anvendte farvestof ikke har ændret funktionaliteten af cellerne, der skal spores (fig. 6) 3,13,16,18.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens eller udstyr </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Kommercielt Købt </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9400 </td><td></td></tr><tr><td> Bovint serumalbumin (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> Føtalt bovint serum (FBS) </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) </td><td> Life Technologies </td><td> 14175-079 </td><td> Calcium-og magnesiumfri, uden phenolrødt </td></tr><tr><td> Humant IgG Cohn fraktion II og III globuliner </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-4386 </td><td></td></tr><tr><td> Muse anti-human CD3-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 349.201 </td><td> Mætningskoncentration som bestemt ved laboratorie-titrering </td></tr><tr><td> Muse-anti-humant CD4-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340.672 </td><td> Mætningskoncentration som bestemt ved laboratorie-titrering </td></tr><tr><td> Muse-anti-humant CD4-PECy7 </td><td> BD Biosciences </td><td> 348.799 </td><td> Mætningskoncentration som bestemt ved laboratorie-titrering </td></tr><tr><td> Muse anti-human CD8-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 347.313 </td><td> Mætningskoncentration som bestemt ved laboratorie-titrering </td></tr><tr><td> Muse anti-human CD8-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD0805 </td><td> Mætningskoncentration som bestemt ved laboratorie-titrering </td></tr><tr><td> Muse anti-human CD19-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD1905 </td><td&gt; mætningskoncentration som bestemt ved laboratorie-titrering </td></tr><tr><td> Muse-anti-humant CD25-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340.938 </td><td> Mætningskoncentration som bestemt ved laboratorie-titrering </td></tr><tr><td> Muse anti-human CD127-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 557.938 </td><td> Mætningskoncentration som bestemt ved laboratorie-titrering </td></tr><tr><td> Muse anti-human CD3 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0037-85 </td><td> 1,0 mg / ml; azid free </td></tr><tr><td> Muse anti-human CD28 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0289-85 </td><td> 1,0 mg / ml; azid free </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300-058 </td><td></td></tr><tr><td> PKH26 red fluorescent cell linker kit indeholdende 10-3M PKH26 i EtOH og Diluent C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> PKH26GL-1KT eller MINI26-1KT </td><td> Procedurer i Trin 1 også anvendelsekits indeholdende PKH67 eller andre CellVue farvestoffer </td></tr><tr><td> CellVue Claret langt rødt fluorescerende celle linker kit indeholdende 10-3M CellVue Claret i EtOH og Diluent C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MINCLARET-1KT eller MIDCLARET-1KT </td><td></td></tr><tr><td> 5 - (og-6)-carboxyfluorescein-diacetat, succinimidylester (CFDA-SE) </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> C34554 </td><td> Ikke-fluorescerende, spaltes af esteraser membran til dannelse af fluorescerende amino-reaktiv carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) </td></tr><tr><td> LIVE / DEAD Fixable Violet </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> L34955 </td><td></td></tr><tr><td> Sterile 12 x 75 mm konisk polypropylenglas &amp; kasketter </td><td> VWR </td><td> 60818-102 </td><td> Giver bedre membran farvestof farvning effektivitet (reduceret farvestof adsorption, mindre celletab under supernatant aspiration) </td></tr><tr><td> 12 x 75 mm round bund polystyrenrør </td><td> Becton Dickinson </td><td> 21008-936 </td><td></td></tr><tr><td> Flowcytometer </td><td> BD Bioscience </td><td> FACSCalibur LSRFortessa </td><td> Enhver cytometer stand til at detektere FITC, PKH26, og 7-AAD (ex. 488 nm. Em 520 nm, 567 nm og 655 nm, henholdsvis) og APC ex. 633-640 nm; EM. 660 nm) </td></tr><tr><td> Flowcytometer </td><td> Beckman Coulter </td><td> LSRII CYAN </td><td> Enhver cytometer stand til at detektere FITC, PKH26, og 7-AAD (ex. 488 nm. Em 520 nm, 567 nm og 655 nm, henholdsvis) og APC ex. 633-640 nm; EM. 660 nm) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Laboratory Udarbejdet </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, koncentreret lager </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 1 mg / ml i PBS. Frys i alikvoter og opbevares ved -20 ° C. </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, working lager </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 100 ug / ml i PBS, forberede dagligt fra 1 mg / ml frossen lager. </td></tr><tr><td> IgG blok </td><td> NA </td><td> NA </td><td> HBSS + 10 mg / ml Human IgG Cohn fraktion II og III globuliner + 10 mg / ml BSA. </td></tr></tbody></table>

optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes

Fluorescerende cellesporing farvestoffer, i kombination med flow og image cytometri, er stærke redskaber til at undersøge samspillet og skæbne af forskellige celletyper in vitro og in vivo. 1-5 Selv om der er bogstaveligt talt tusindvis af publikationer ved hjælp af sådanne farvestoffer, hvoraf nogle de hyppigst forekommende celle tracking applikationer omfatter overvågning af: <ol><li> stamceller og progenitorceller ubevægelighed, proliferation og / eller differentiering 6-8 </li><li> antigen-driven membran transfer 9 og / eller precursor celleproliferation 3,4,10-18 og </li><li> immunregulatoriske og effektorcelle-funktion 1,18-21. </li></ol> Kommercielt tilgængelige cellesporing farvestoffer varierer meget i deres kemiske og fluorescensegenskaber, men størstedelen falder i en af ​​to klasser baseret på deres den celle-mærkning. &quot;Membrane farvestoffer&quot;, typisk kendetegnet ved PKH26, er yderst lipofile farvestoffer that partition stabilt, men ikke-covalent til cellemembraner 1,2,11. &quot;Protein farvestoffer&quot;, typisk kendetegnet ved CFSE, er amino-reaktive farvestoffer, der danner stabile covalente bindinger med celleproteiner 4,16,18. Hver klasse har sine egne fordele og begrænsninger. Nøglen til deres succesfulde anvendelse, især i flerfarvet undersøgelser, hvor flere farvestoffer anvendes til at spore forskellige celletyper, er derfor at forstå de kritiske spørgsmål muliggør optimal udnyttelse af hver klasse 2-4,16,18,24. De protokoller, der er medtaget her fremhæve tre almindelige årsager til dårlig eller varierende resultater, når du bruger celle-tracking farvestoffer. Disse er: <ol><li> Manglende opnåelse af lys, ensartet og reproducerbar mærkning. Dette er et nødvendigt udgangspunkt for enhver cellesporing undersøgelse, men kræver opmærksomhed på forskellige variabler ved brug membran farvestoffer end ved anvendelse af protein farvestoffer eller ligevægtsbinding reagenser, såsom antistoffer. </li><li> Suboptimal fluorochrom kombinationer ennd / eller manglende omfatte kritiske kompensation kontrol. Sporing farvestoffluorescens er typisk 10 februar - 10 marts gange lysere end antistof fluorescens. Det er derfor vigtigt at verificere, at tilstedeværelsen af ​​sporing farvestof ikke forringer evnen til at påvise andre prober, der anvendes. </li><li> Manglende opnåelse af god pasning med peak modeling software. Sådan software giver mulighed for kvantitativ sammenligning af proliferative reaktioner på tværs af forskellige populationer eller stimuli baseret på precursor frekvens eller andre målinger. Opnåelse af en god pasform, kræver imidlertid udelukkelse af døde / døende celler, der kan forvride farvestof fortynding profiler og matchning af de antagelser modellen med karakteristika observerede farvestof fortynding profil. </li></ol> Eksemplerne her illustrerer, hvordan disse variabler kan påvirke resultaterne ved brug membran og / eller protein farvestoffer til overvågning af celleproliferation.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes at JoVE.com

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Succesfuld brug af cellesporing farvestoffer til at overvåge immun celle funktion og proliferation involverer flere kritiske trin. Vi beskriver metoder til: 1) opnåelse af lys, ensartet og reproducerbar etiket-ning med membran farvestoffer, 2) udvælgelse af fluorokromer og dataopsamling betingelser, og 3) at vælge en model til at kvantificere celleproliferation baseret på farvestof fortynding.

Optimeret farvning og spredning modelleringsmetoder for celledeling Overvågning ved hjælp cellesporing Farvestoffer

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Cellesporing hjælp Photoconvertible proteiner under zebrafisk Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

In Vivo modellering af Morbid Human Genome hjælp Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Histokemisk farvning af<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sekundært Cell vægelementer

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Metoder til Hud sårbarhed og Analyser for Wound Svar i<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Temporal Sporing af cellecyklusprogression anvendelse af flowcytometri uden behov for synkronisering

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Sammenligning af tre forskellige metoder til bestemmelse celleproliferation i brystcancercellelinier

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...