Name: optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes
Uploaded: 2012-12-13T12:00:00
Duration: 22 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes at JoVE.com

הכותבים במיוחד ברצוני להודות לאנשים הבאים לתרומות הטכניות ואינטלקטואליות שלהם לפיתוח השיטות האלה במהלך השנים: ברוס Bagwell (ריטי בית תוכנה), דורוס ברקוביץ (IDM), ליזאן רסלין (Zynaxis הסלולרי מדע ומחקר PTI) , בריאן גריי (PTI מחקר), יאן פישר (Dartmouth ספר לרפואה), אליס Givan (Dartmouth ספר לרפואה), בטסי אוהלסון וילהלם (SciGro, Inc), ומרי וו (Dartmouth ספר לרפואה). הם גם רוצים להודות לבודווין הכיתה של 2006 מהקורסים השנתיים בשיטות מחקר והשימושים של cytometry זרימה, שהניבו את הנתונים שמוצגים באיור 2. cytometry הזרימה בוצע במעבדתו של Roswell Park Cancer Institute תזרים Cytometry, שהוקמה בחלקו על ידי מענקי ציוד מהתכנית המשותפת Instrument-NIH, ומקבל תמיכה מליבת גרנט (5 P30 CA016056-29) מהלאומיסרטן המכון לRoswell Park Cancer Institute, ובמרכז הסרטן Cytometry אברמסון הזרימה ומשאבי המעבדה ניידת מיון של אוניברסיטת פנסילבניה, שהוקמה בחלקו על ידי מענקי ציוד מתכנית הכלי המשותף NIH, ומקבל תמיכה מNIH # 2P30 CA016520 מהמכון הלאומי לסרטן. העבודה מוצגת באיורי 3 ו 5 הייתה גם נתמכת בחלקו על ידי מענק SBIR EB00228 מהמכונים הלאומיים לדימות וBioengineering יו (NIBIB) הוענקו לPTI Research, Inc

1. תיוג ממברנה כללי עם דאי מעקב הסלולרי PKH26 (אסמכתא 25; איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטכניקה סטרילית לצעדים 1.1-1.9. הכן ~ 10 7 תאים אנושיים דם היקפיים mononuclear או לימפוציטים (hPBMC, hPBL) באמצעות שיטה הסטנדרטית של המעבדה בתוספת של ספין XG סופי 300 כדי למזער זיהום טסיות דם. Resuspend תאים ב10 7 / המ&quot;ל בHBSS BSA 1% ומקום על קרח, להזמין aliquot 500 μl (5x10 6 תאים) לשימוש בשלב 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5x10 6 תאי Place (500 μl) בצינור 12 x 75 מ&quot;מ חרוט פוליפרופילן. לשטוף פעם אחת עם 3.5 HBSS מ&quot;ל. בזהירות לשאוב supernatant, לא משאיר יותר מ 15-25 μl של נוזל שיורים, אך נזהר שלא להסיר תאים. השתמש בצינור זה כדי להכין את השעית תא 2x בשלב 1.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך שטיפת התא בשלב 1.2, להוסיף 0.5 מ&quot;ל של רכב תיוג C הממס (מערכת PKH26GL) לצינור 12 x 75 מ&quot;מ חרוט פוליפרופילן. השתמש בצינור זה להכנההם PKH26 פתרון 2x בשלב 1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל של רכב תיוג C הממס לתא הגלולה השטופה מהשלב 1.2 ולשאוב ולוותר על 3-4 פעמים כדי לקבל השעית תא בודדה (2x תאים). הימנע מהיווצרות בועה ומוגזמת ערבוב, אשר עשוי להפחית את כדאיויות תא והתאוששות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר הכנת השעית תא 2x בשלב 1.4, להכין (4 מיקרומטר) פתרון לצבוע 2x ידי הוספת 2.0 μl של מניית 1.0 מ&quot;מ PKH26 לצבוע באתנול (מערכת PKH26GL) לצינור C הממס המוכנים בשלב 1.3 ומערבולת כדי לפזר באופן אחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר הכנת תמיסת הצבע 2x בשלב 1.5, מהירות פיפטה השעית תא 2x משלב 1.4 לפתרון לצבוע 2x ובו זמנית לשאוב ולוותר על 3-4 פעמים לפיזור תאים לחלוטין בצבע אל תעשה:. להוסיף צבע mM 1.0 ישירות תאים; יוצק לתוך תאי 2x 2x צבע, או להוסיף תאים ל2x 2x לצבוע תוך vortexing. משום ההכתמה היא כמעט מיידית, שיטות כאלה תנבנה פחותעוצמות אחידות מאשר השיטה המומלצת (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 1 דקות, להוסיף 1.0 מ&quot;ל של נסיוב המומת חום או +5% BSA HBSS להפסיק ספיגת צבע לתוך קרום תא. שימוש שלא מספיק חלבון סיכוני ההיווצרות של אגרגטים בצבע, אשר יכול גלולה עם תאים במהלך שלבי כביסה ולגרום לתיוג לא מכוון של תאים אחרים מציגים בניסוי. אם בינוני עם 10% חום מומת בסרום (CM) או HBSS 1% BSA הוא לשמש כמגיב התחנה, לבצע את ההכתמה בצינור פוליפרופילן 15 מיליליטר חרוטים ולהוסיף לפחות 5.0 מ&quot;ל של ריאגנט תחנה כדי להבטיח ספיחה של כל מאוגד צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את התאים שכותרתו למשך 5 דקות @ ~ 400 x גרם. בזהירות לשאוב supernatant מבלי להסיר תאים. שטוף את הכדור פעמים עם 4 מ&quot;ל של סנטימטר או 1% BSA HBSS, פיזור הגלולה הרבה לפני recentrifugation. כדי למזער את השפעת הלוואי של הצבע adsorbed על קירות צינור ולמקסם את יעילות כביסה, להעביר את התאים לצינור פוליפרופילן טרי לאחר firesuspension RST. הערה: במידה מספקת תאים מוכתמים יפגינו גוון ורוד מובהק בגלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא הגלול השטופה בBSA 1.0 המ&quot;ל HBSS 1%. ספירת התאים, לקבוע התאוששות תא, ולהתאים את עוצמת קול כדי לתת ריכוז סופי של 10 7 / מ&quot;ל. עם שאיפה זהירה, התאוששות תא צריכה להיות ≥ 85%. אם התאוששות תא היא &lt;70%, לקבוע את הגורם לפני שתמשיך הלאה. לסגת aliquot 150 μl (1.5x10 6 תאים) ומניח על קרח לשימוש בשלב 2. </li></ol> 2. הכנה של פקדי הגדרת כלי וAssay (טבלה 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 μl aliquot (5x10 5) של תאי בתוליים מהשעית התא נשמרת בשלב 1.1 לכל אחד מחמישה צינורות 1.8 מ&quot;ל Eppendorf: 1, 3, 4, 5, ו 7. 50 μl aliquot (5x10 5) של תאי PKH26 pos משלב 1.9 לכל אחת משלושה צינורות: 2, 6 ו 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 IgG בלוק μl (100 מיקרוגרם / שפופרת של IgG; ראה טבלה של ריאגנטים) לצינורות 1-8ודגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת הסביבה (20-25 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כמות להרוות של הנוגדן (IES) שצוינה בטבלת המס &#39;1 לצינורות 4, 5, 7 ו 8 ודגירה כל הדגימות (צינורות 1-8) למשך 30 דקות בטמפרטורת הסביבה ומוגנת מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסיפו 1.5 מ&quot;ל של HBSS BSA 1% לכל הדגימות, גלולת התאים על ידי צנטריפוגה (5 דקות @ 400 XG) ולשטוף פעם אחת עם 1.5 מ&quot;ל של 1% HBSS BSA, עם שאיפה זהירה, כדי למנוע אובדן תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל דגימה ב500 μl של HBSS BSA 1%. אם נדרש לדוגמאות כדי להיות מנותח על cytometer, להעביר לצינור 12 x 75 מ&quot;מ עגול תחתון. הוסף 10 μl של 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל 7-AAD מנייה פועלת ביום (ראה טבלה של ריאגנטים) עד 3 צינורות, 6, 7 ו 8 כפי שמצוין בטבלת 1. לדגור על קרח למשך 30 דקות לפני השימוש בהתקנת cytometer זרימה ואימות מכתימה (שלב 3). </li></ol> 3. התקנת Cytometer זרימה ואימות כתמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שcytome הזרימהter פועל באופן תקין, תוך שימוש בנהלים שנקבעו במעבדה לבקרת איכות יומית. ודא שאותות בקלות יכול להתגלות בכל חלון ספקטרלי לשמש, ושתגובות גלאי הם ליניארי יחסיות לאותת עצמה בחלון שישמש לניטור התפשטות 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש FSC לעומת SSC נתונים עבור 1 Tube באמצעות סולמות תצוגה ליניארית. התאם ההגברה של כל גלאי כזה שאוכלוסיית הלימפוציטים נופלת ברבע השמאלי התחתון של עלילת הנקודה, לא את קנה המידה בשני פרמטרים, ולא יופרע בשל סף. איסוף נתוני FSC לעומת SSC ungated לכל הדגימות בשלבים 3.3-3.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש נתונים עבור 1 תחתי, ללא שימוש בפיצוי צבע וסולמות תצוגת לוגריתמים לכל 4 גלאי הקרינה. התאם מתח הגבוה של כל גלאי (HV) למקום autofluorescence של לימפוציטים בתוליים בקנה מידה עם מעט / אין תאים מצטברים בערוץ הראשון. גדר גבול ניתוח עבור כל היסטוגרמהמקביל ל2% המבריקים של תאי בתוליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש ללא פיצוי צבע ואת הגדרות HV הוקם בצעדי 3.2 ו 3.3, איסוף נתונים לTube 2, איסוף FSC, SSC ואותות בכל 4 גלאי הקרינה. לגלאי משמש לניטור PKH26 פלואורסצנטי, לוודא שכל תאי PKH26 pos מופיעים בקנה המידה כמו שיא סימטרי יחיד בעשור ה -4 -3, עם מעט / לא תאים בערוץ האחרון. אם יש פסגות מרובות או צורת שיא מוטה, חזור על שלב 1 עם תשומת לב קפדנית למזעור המלח וטכניקת ערבוב (איור 2). אם יש צורך, להתאים את ריכוז צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בהגדרות שנקבעו בשלב 3.3, ואיסוף נתונים לTube 3, איסוף FSC, SSC ואותות בכל 4 גלאי הקרינה. לגלאי משמש לניטור פלואורסצנטי 7-AAD, לוודא שתאי 7-AAD pos נופלים מעל גבול 2% הוקם בשלב 3.3 (כלומר, שתאים שאינם בנות קיימא נפתרים גםמתאי קיימא 7-AAD נג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בהגדרות שנקבעו בשלב 3.3, ואיסוף נתונים לTube 4, איסוף FSC, SSC ואותות בכל 4 גלאי הקרינה. ודא שתאי CD8 pos נפתרים גם מתאי בתוליים (כלומר, נפילה מעל גבול 2% הוקם בשלב 3.3 לגלאי FITC). חזור עם Tube 5 ולוודא שתאי CD8 pos נפתרים גם מתאי בתוליים (כלומר נפילה מעל גבול 2% הוקם בשלב 3.3 לגלאי APC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרות באמצעות הוקמו בשלב 3.3, ואיסוף נתונים לצינורות 6, 7 ו 8, איסוף FSC, SSC ואותות בכל 4 גלאי הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במצב של רשימת הקבצים שנאספו לצינורות 1-5 ותוכנת פיצויי צבע כדי לקבוע צבע חפיפת מטריצה ​​עבור כל fluorochrome בגלאים המשמשים לניטור השלושה fluorochromes האחר. החל מטריצה ​​זו לקובץ מצב הרשימה לדוגמה 6 ולוודא שהנוכחות של PKH26 מעבדהeling אינו משנה את היכולת לזהות 7-AAD תאי pos. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחיל את צבע חפיפת מטריצה ​​מהשלב 3.8 לקובץ מצב הרשימה לדוגמה 7 ולוודא ש:) 3 subpopulations נפתר היטב (CD3 CD4 נג נג, CD3 CD4 pos נג וCD3 CD4 pos pos) ניתן לזהות על FITC לעומת עלילת APC נקודה וגם ב) הנוכחות של אנטי CD3-FITC ואנטי CD4-APC אינו משנים את היכולת לזהות 7-AAD תאי pos. אם הנוכחות של-CD3-FITC אנטי משנה את הגבול העליון של 2% בנתונים שנאספו על PKH26 הגלאי, להתאים מחדש את הגבול כפי שנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מטריצת צבע החפיפה משלב 3.8 לקובץ מצב הרשימה לדוגמה 8. אם הנוכחות של PKH26 תיוג משנה את גבול 2% לFITC, 7-AAD או גלאי APC מאלו שנקבעו באמצעות שלט autofluorescence בשלב 3.3, להתאים מחדש את הגבול (ies) לפי צורך באמצעות Tube 7 של הטבלה 1 ולוודא שהוא עדיין אפשר distinguish CD3 CD4 pos pos, CD3 CD4 pos נג, וCD3 CD4 תאי NEG NEG באמצעות הגבול המתואם (IES). </li></ol> 4. בחירה במודל הפצת נשק לניטור חלוקת תאים על ידי דילול דיי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את המרווח בין הדורים, וזה תלוי במספר הערוצים ועשורי לוגריתמים על cytometer. למכשירים דיגיטליים, ערך זה, בדרך כלל 4 או 5 שנים, נקבע במספר הפחים במעבד האותות הדיגיטלי. במכשירים אנלוגיים, שבו מספר העשורים הוא לעתים רחוקות כל מספר, מודלים מדויקים דורשים מספרם המדויק של עשרות שנים שתיקבענה באופן ניסיוני. כדי לעשות זאת, נתונים מתערובת של חרוזי ניאון מכויל עם עוצמות יחסי יצרן הוקצו נרכשים באותן הגדרות המתח גבוהות גלאים המשמשות בניסוי. העמדה של פסגות החרוזים מאפשרת כיול של סולם הלוגריתמים במונחים של intמגוון ensity לעשור יומן. באופן ספציפי, זה נעשה על ידי קשירת קשר מספר הערוץ לכל סוג חרוז נגד היומן של ערך היצרן שהוקצה. שיפועו של קו ישר בהתאמה מיטבית לערכי נתוני החרוזים נותן את מספר יחידות עצמה יחסיות לכל ערוץ. מוכפל במספר הערוצים, ערך זה יהיה אז את מספר עשורי יומן לקנה מידה המלא, שממנו את מספר הערוצים מקבילים לירידה כפולה בעצמה (כלומר, מרווח בין דור בת) ניתן לחשב 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליט אם להשתמש במרווח קבוע בין הדורים או כדי לאפשר את המרווח לצוף. הגדרה סטנדרטית (קבוע) תשתמש בערך המרווח שנקבע בשלב דורי 4.5 להקצות את מיקומו של כל דור, והוא בדרך כלל בשימוש בעת היסטוגרמה חסרת פסגות נבדלות. הגדרת תהלוכה מאפשרת לכל עמדת שיא דורות שתקבע את צורת היסטוגרמה ובדרך כלל בשימוש בעת distinguishablדואר פסגות דורות ניכרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליט אם להשתמש ברוחב שיא קבוע לכל הדורים או ברוחב משתנה. רוחב קבוע משתמש SD מחושב למדגם השליטה unstimulated למודל כל הדורים ובדרך כלל נבחר כאשר הדגימה חסרת פסגות דוריים הנבדלים. רוחב צף מאפשר לתכנית באופן עצמאי להשתנות SD עבור כל דור, והוא טוב ביותר בשימוש עם פסגות דוריים הנבדלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלת תכנית שמכילה מודול ניתוח התפשטות (כאן בגרסת ModFit LT 3.3). טען את קובץ מגורה PKH26 pos מהנתונים שנקבעו כדי להיות מנותחים (למשל, תרבות מגורה 96 שעות של תאי PKH26 pos counterstained כלTube 8 בלוח 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הפרמטרים לניתוח, במקרה זה PKH26 (585/42) המגודר בקיימא (7-AAD נג) CD3 ימפוציטים pos וFSC לעומת SSC להוציא פסולת קטנה ואגרגטים גדולים (איור 3). בהגדרההאזורים אלה להיות זהירים, כדי לכלול את אזור הפיזור קדימה הגבוה שבו נמצאות בדרך כלל תקיעות ולציין כי CD3 ביטוי יכול להיות למטה מווסת בתרבויות מגורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת מודל הפצה חדש באמצעות אשף הפצת הנשק. שימוש בקובץ הנתונים הפתוח (כרטיסייה התחל), טען את הקובץ מלא unstimulated PKH26 pos ולהגדיר את מיקומו של ערוץ השיא בהפצה המקבילה לתאים מחולקים ההורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הקובץ לשליטת unstimulated PKH26 pos, וציין את הערכים עבור מיקום שיא הורי ורוחב (סטיית התקן). אם רוחב שיא קבוע (SD) הוא רצוי, לבדוק הנעילה SD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען PKH26 neg השליטה (למשל, 96 שעות של תרבות PKH26 תאי NEG counterstained כלTube 7 בטבלה 1). התאם את מספר הדורים על ידי קביעת השיא לערוץ דור dimmest לעיל PKH26 neg השליטה. זו קובעת נוmber דורי בת המודל יכול להתאים במדויק והוא בדרך כלל 6-9 דורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ הנתונים למדגם המגורה (למשל, תרבות מגורה 96 שעות של תאי PKH26 pos counterstained כלTube 8 בלוח 1) ומאשר כי האזורים לתפקיד ההורי השיא וSD כהגדרתו בשלב 4.7 יישארו ללא שינוי. אם מרווח בין דורות קבוע הוא רצוי, בחר באפשרות מודל סטנדרטית, אחרת בחר הצפה האופציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח כל קובץ ניסיוני בערכת הנתונים, תוך שימוש באותו המודל שהוגדר בשלב 4.9. התאמות קלות בעמדת שיא ההורים עשויות להיות נחוצות לכושר הטוב ביותר כהגדרתו הן מבחינה ויזואלית ועל ידי ירידת ערך צ&#39;י המרובע (RCS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלט את מדדי ההפצה הרצויה כתוצאה מההתאמה הטובה ביותר עבור כל קובץ ניסוי בערכת הנתונים. לתיאור מקיף של מדדים אפשריים לראות סימוכין. 22. </li></ol>

<ol>
	<li>Poon, R. Y., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Bagwell, C. B., Muirhead, K. A., Diamond, R. A., DeMaggio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+PKH+Membrane+Intercalating+Dyes+to+Monitor+Cell+Trafficking+and+Function.">Use of PKH Membrane Intercalating Dyes to Monitor Cell Trafficking and Function.</a> Living Color: Flow Cytometry and Cell Sorting Protocols. , 302-352 (2000).</li><li>Wallace, P. K., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Tracking+2007:+A+Proliferation+of+Probes+and+Applications.">Cell Tracking 2007: A Proliferation of Probes and Applications.</a> Immunol. Invest. 36, 527-562 (2007).</li><li>Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+lymphocyte+proliferation,+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data.">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nat. Protoc. 2, 2057-2067 (2007).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat. Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li><li>Bolton, D. L., Minang, J. T., Trivett, M. T., Song, K., Tuscher, J. J., Li, Y., Piatak, M., O'Connor, D., Lifson, J. D., Roederer, M., Ohlen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking,+Persistence,+and+Activation+State+of+Adoptively+Transferred+Allogeneic+and+Autologous+Simian+Immunodeficiency+Virus-Specific+CD8++T+Cell+Clones+during+Acute+and+Chronic+Infection+of+Rhesus+Macaques.">Trafficking, Persistence, and Activation State of Adoptively Transferred Allogeneic and Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones during Acute and Chronic Infection of Rhesus Macaques.</a> J. Immunol. 184, 303-314 (2010).</li><li>Juopperi, T. A., Sharkis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Quiescent+Murine+Hematopoietic+Stem+Cells+by+Homing+Properties.">Isolation of Quiescent Murine Hematopoietic Stem Cells by Homing Properties.</a> Meth. Mol. Biol. 430, 21-30 (2008).</li><li>Kusumbe, A. P., Bapat, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+aneuploid+populations+within+developing+tumors+are+the+major+determinants+of+tumor+dormancy.">Cancer stem cells and aneuploid populations within developing tumors are the major determinants of tumor dormancy.</a> Cancer Res. 69, 9245-9253 (2009).</li><li>Pece, S., Tosonim, D., Confalonieri, S., Mazzarol, G., Vecchi, M., Ronzoni, S., Bernard, L., Viale, G., Pelicci, P. G., Fiore, P. P. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+Molecular+Heterogeneity+of+Breast+Cancers+Correlates+with+Their+Cancer+Stem+Cell+Content.">Biological and Molecular Heterogeneity of Breast Cancers Correlates with Their Cancer Stem Cell Content.</a> Cell. 140, 62-73 (2010).</li><li>Gertner-Dardenne, J., Poupot, M., Gray, B. D., Fourni&#233;, J. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+fluorochrome+trackers+of+membrane+transfers+between+immune+cells.">Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells.</a> Immunol. Invest. 36, 665-685 (2007).</li><li>Bercovici, N., Givan, A. L., Waugh, M. G., Fisher, J. L., Vernel-Pauillac, F., Ernstoff, M. S., Abastado, J. P., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+precursor+analysis+of+T-cell+responses+to+antigen.">Multiparameter precursor analysis of T-cell responses to antigen.</a> J. Immunol. Methods. 276, 5-17 (2003).</li><li>Givan, A. L., Fisher, J. L., Waugh, M. G., Bercovici, N., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cell-tracking+dyes+to+determine+proliferation+precursor+frequencies+of+antigen-specific+T+cells.">Use of cell-tracking dyes to determine proliferation precursor frequencies of antigen-specific T cells.</a> Methods Mol. Biol. 263, 109-124 (2004).</li><li>Schwaab, T., Tretter, C. P., Gibson, J. J., Cole, B. F., Schned, A. R., Harris, R., Fisher, J. L., Crosby, N., Stempkowski, L. M., Heaney, J. A., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-related+immunity+in+prostate+cancer+patients+treated+with+human+recombinant+granulocyte+monocyte-colony+stimulating+factor+(GM-CSF).">Tumor-related immunity in prostate cancer patients treated with human recombinant granulocyte monocyte-colony stimulating factor (GM-CSF).</a> Prostate. 66 (6), 667-674 (2006).</li><li>Bantly, A. D., Gray, B. D., Breslin, E., Weinstein, E. G., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellVue+Claret,+a+New+Far-Red+Dye,+Facilitates+Polychromatic+Assessment+of+Immune+Cell+Proliferation.">CellVue Claret, a New Far-Red Dye, Facilitates Polychromatic Assessment of Immune Cell Proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 581-605 (2007).</li><li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+assay+for+quantitation+of+rare+antigen-specific+T-cells:+using+cell-tracking+dyes+to+calculate+precursor+frequencies+for+proliferation.">A flow cytometric assay for quantitation of rare antigen-specific T-cells: using cell-tracking dyes to calculate precursor frequencies for proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 563-580 (2007).</li><li>Tario, J. D., Gray, B. D., Wallace, S. S., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lipophilic+tracking+dyes+for+monitoring+cell+proliferation.">Novel lipophilic tracking dyes for monitoring cell proliferation.</a> Immunol Invest. 36, 861-885 (2007).</li><li>Wallace, P. K., Tario, J. D., Fisher, J. L., Wallace, S. S., Ernstoff, M. S., , ., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Antigen-Driven+Responses+by+Flow+Cytometry:+Monitoring+Proliferation+by+Dye+Dilution.">Tracking Antigen-Driven Responses by Flow Cytometry: Monitoring Proliferation by Dye Dilution.</a> Cytometry. 73, 1019-1034 (2008).</li><li>Barth, R. J., Fisher, D. A., Wallace, P. K., Channon, J. Y., Noelle, R. L., Gui, J., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Randomized+Trial+of+Ex+vivo+CD40L+Activation+of+a+Dendritic+Cell+Vaccine+in+Colorectal+Cancer+Patients:+Tumor-Specific+Immune+Responses+Are+Associated+with+Improved+Survival.">A Randomized Trial of Ex vivo CD40L Activation of a Dendritic Cell Vaccine in Colorectal Cancer Patients: Tumor-Specific Immune Responses Are Associated with Improved Survival.</a> Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).</li><li>Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Immune+Cell+Proliferation+and+Cytotoxic+Potential+Using+Flow+Cytometry.">Tracking Immune Cell Proliferation and Cytotoxic Potential Using Flow Cytometry.</a> Meth. Mol. Biol. 699, 119-164 (2011).</li><li>Fuse, S., Underwood, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Analysis+of+In+Vivo+CD8++T+Cell+Cytotoxicity+Against+Multiple+Epitopes+using+Multicolor+Flow+Cytometry.">Simultaneous Analysis of In Vivo CD8+ T Cell Cytotoxicity Against Multiple Epitopes using Multicolor Flow Cytometry.</a> Immunol. Invest. 36, 829-845 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Fleck, M., Mackensen, A., Zoso, A., Halbritter, D., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111, 3546-3552 (2008).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+cellular+proliferation+data:+Avoid+the+panglossian.">Interpretation of cellular proliferation data: Avoid the panglossian.</a> Cytometry. 79A, 95-101 (2011).</li><li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+(CFSE)+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation.">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> J. Vis. Exp. (44), e2259 (2010).</li><li>Houlihan, D. D., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Review+of+Clinical+Trials+of+Bone+Marrow+Stem+Cells+in+Liver+Disease.">Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease.</a> Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).</li><li>Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+In+Vitro+Suppressive+Capacity+of+Regulatory.">Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory.</a> T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).</li></ol>

ק המפרי, JD Tario, ג&#39;וניור וקי וואלאס קבלו ריאגנטים מעקב סלולרי מראש מסחריים להערכה מחי Technologies, Inc וBD Biosciences. ספירה Bantly וי.ס. מור קבלה תא מראש מסחרי מעקב ריאגנטים להערכה מחיים טכנולוגיים, Inc ומימון מPTI Research, Inc לאפיון מראש מסחרי של תא CellVue השונה מעקב צבעים. ק מיורהד מועסק על ידי SciGro, Inc, המספק שירותי ייעוץ לPhanos Technologies, Inc (בעלים של צבעי CellVue PKH ו) ומספק תמיכה טכנית לגיבוי סיגמא אולדריץ וטכנולוגיות למיקוד של מולקולריות, Inc (מפיצים של אלה צבעים). הייצור והגישה חופשיה למאמר זה הוא בחסות סיגמה אולדריץ.

השיטות שתוארו כאן הן אלה שנמצאו במעבדות בשילוב שלנו באופן מהימן ביותר לתת תוצאות אופטימליות לתיוג hPBMC שימוש בצבעים בממברנה 13,16,18 ולphenotyping הלימפוציטים משנה ומעקב אחר התפשטות שימוש או קרום או צבעי חלבון 2,11,13,16, 18. כפי שמתואר באיורי 1 ו 2, תיוג אחיד הבהיר ביותר מושגת בקלות על ידי הגבלת הנוכחות של מלחים פיסיולוגי ובאמצעות טכניקת ערבוב כי תוצאות בחשיפה מהירה ואחידה של כל התאים לאותו הריכוז של צבע. בגלל צביעה עם צבעי קרום מתרחשת על ידי מחיצות לתוך bilayer השומנים בדם, יתר משתנים שמשנים את ריכוז צבע חופשי יכול גם להשפיע יעילות תיוג. לדוגמה, סימון בתוצאות צינורות קלקר תחתון עגולות בשטיפה פחות יעילה של מלחים לפני resuspension ב-C הממס וגם בריכוז צבע חופשי מופחת בשל ספיחה לצבוע על קירות צינור, בעיקרבריכוזים נמוכים יותר צבע. שני הגורמים נוטים לתת הפצות מכתים רחבות יותר מאשר כאשר התיוג נעשה באמצעות צינורות פוליפרופילן תחתון חרוטים (איורים 3, 4 ו תוצאות לא פורסמו). גיל וסוג הדגימה יכולים להשפיע גם על רוחב שיא גם כאשר נהלי מכתים אופטימיזציה משמשים. לדוגמה, קורות חיים לימפוציטים PKH26 pos בודדו ממגוון נמשך טרי דם 14-20% (3 איור, Ref. 13 ותוצאות שלא פורסמו), ואילו קורות חיים ללימפוציטים שבודדו מ24 דגימות דם או ישנות hr טווח מסנני pheresis TRIMA 25-30 % (איור 4 ומס. 18). הכתמת אחידות והמידה שבה ניתן לשלול תאים שאינם בנות קיימא מהניתוח ששניהם משפיעים אם פסגות בת הבחנה, אינן ניכרו בפרופיל דילול הצבע, אשר בתורו משפיע על בחירה של מודל התפשטות כדי להתאים את הנתונים שנצפו (איורים 5, 6 </strong&gt;). למרות ModFit (ריטי בית תוכנה, Topsham, ME) משמש כאן כדוגמה לתוכנה המשמשת ליצירת מדדים כגון מדד פרוליפרציה ותדר מבשרו (איורי 3, 5 ו 6; לוח 3), חבילות תוכנה אחרות מכילות גם מודולים לניתוח נתוני תפוצה. כולל FCSExpress אלה (דה נובו תוכנה, לוס אנג&#39;לס, קליפורניה) וFlowJo (עץ כוכבים, Inc, אשלנד, או). כל התוכניות הללו להשתמש בניתוח ריבועים לפחות לא ליניארי ערוך את למצוא את ההתאמה הטובה ביותר לנתונים הגולמיים על ידי שינוי המיקום, הגובה וSD (או רוחב) של פסגות גאוסיים מייצגות דורי בת רציפות. מדד שגשוג (PI) ותדר מבשרו (PF) הם האמצעים הנפוצים ביותר של היקף ההתפשטות. PI, כפי שהוגדר על ידי ModFit, הוא מדד לעלייה במספר תאים במהלך הבדיקה, המקביל &quot;אינדקס הגירוי&quot; של assay ספיגת תימידין. PF מחזיר את החלק היחסי של תאים בpopulat הראשונייון שהגיב לגירוי בהצלחה רבה. זהירות מומלצת, עם זאת, בעת קריאת הספרות מאז הטרמינולוגיה משתנית במקצת בין חבילות תוכנה (לדוגמה, FlowJo וModFit להשתמש בהגדרות וחישובים שונים למה הכוונה ב &quot;הפצת המדד&quot;) 22. הנושאים הקריטיים דנו כאן על תיוג וניתוח התפשטות עם צבעי קרום גם הם נתקלו בעת שימוש בצבעי חלבון. לדוגמה, תשומת לב קפדנית לטכניקת ערבוב חייבת להיות גם שנצפתה, יחד עם הרחקה של תאים מתים / גוסס, על מנת לקבל הפצות אחידות ופסגות בת נבדלות בעת שימוש CFSE (איור 6) 2-4,13,18,24. בחירה המתאימה של fluorochromes לphenotyping והערכת כדאיות היא חשובה גם כדי להימנע מחפיפת רפאים מוגזמות וחוסר יכולת לזהות תאי נוגדנים חיוביים, במיוחד עם צבעי חלבון פולט גלויים כגון CFSE 2-4,11,13,16,18 </sup&gt;. הקטנת הריכוז של צבע מעקב מפחיתה בעיות פיצוי בערוצי רפאים סמוכים, אך גם מגבילה את מספר חלוקות תא הניתן לפיקוח לפני עוצמות תא בת להתחיל חפיפה עם autofluorescence. לחלופין, השתמש בצבעי מעקב סלולרי חדשים יותר כגון קלרט אדום רחוק הפולט CellVue (סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי) או פולט סגול CellTrace יולט (טכנולוגיות חיים, גרנד איילנד, ניו יורק) עשוי להפחית את בעיות פיצויים (איור 6). לבסוף, למרות שצבעי קרום בדרך כלל נוטים להפגין פחות רעיל 11,26, ניתן לתאים מעל תווית עם או כיתה של צבע. לכן, תמיד יש צורך לוודא שהריכוז של צבע מעקב בשימוש לא שינה את הפונקציונליות של התאים להיות במעקב (איור 6) 3,13,16,18.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב או ציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> נרכש מסחרי </td></tr><tr><td> 7-D Aminoactinomycin </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> A9400 </td><td></td></tr><tr><td> שור אלבומין (BSA) </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> סרום שור עוברי (FBS) </td><td> אטלנטה ביולוגית </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> תמיסת מלח מאוזנת הנקס (HBSS) </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 14175-079 </td><td> סידן ומגנזיום חופשי, בלי אדום פנול </td></tr><tr><td> נוגדנים אנושיים כהן שבריר השני והשלישי globulins </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> G-4386 </td><td></td></tr><tr><td> עכבר אנטי אנושי CD3-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td> ריכוז להרוות כפי שנקבע על ידי טיטרציה המעבדה </td></tr><tr><td> עכבר אנטי אנושי CD4-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340672 </td><td> ריכוז להרוות כפי שנקבע על ידי טיטרציה המעבדה </td></tr><tr><td> CD4-PECy7 עכבר אנטי אנושי </td><td> BD Biosciences </td><td> 348799 </td><td> ריכוז להרוות כפי שנקבע על ידי טיטרציה המעבדה </td></tr><tr><td> עכבר אנטי אנושי CD8-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 347313 </td><td> ריכוז להרוות כפי שנקבע על ידי טיטרציה המעבדה </td></tr><tr><td> עכבר אנטי אנושי CD8-APC </td><td> Caltag (חיים טכנולוגיים) </td><td> MHCD0805 </td><td> ריכוז להרוות כפי שנקבע על ידי טיטרציה המעבדה </td></tr><tr><td> העכבר אנטי אנושי CD19-APC </td><td> Caltag (חיים טכנולוגיים) </td><td> MHCD1905 </td><tד&gt; ריכוז הרווה כפי שנקבע על ידי טיטרציה המעבדה </td></tr><tr><td> עכבר אנטי אנושי CD25-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340938 </td><td> ריכוז להרוות כפי שנקבע על ידי טיטרציה המעבדה </td></tr><tr><td> עכבר אנטי אנושי CD127-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 557938 </td><td> ריכוז להרוות כפי שנקבע על ידי טיטרציה המעבדה </td></tr><tr><td> CD3 עכבר אנטי אנושי </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0037-85 </td><td> 1.0 מ&quot;ג / מ&quot;ל; תזיד החופשי </td></tr><tr><td> CD28 עכבר אנטי אנושי </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0289-85 </td><td> 1.0 מ&quot;ג / מ&quot;ל; תזיד החופשי </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300-058 </td><td></td></tr><tr><td> ערכת PKH26 אדומה ניאון תא מקשר המכילה 10-3M PKH26 בEtOH והממס C </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> PKH26GL-1KT או MINI26-1KT </td><td> הליכים בשלב 1 חלים גםלערכות המכילות PKH67 או צבע אחר CellVue </td></tr><tr><td> ערכת CellVue קלרט אדום רחוק ניאון תא מקשר המכילה קלרט CellVue 10-3M בEtOH והממס C </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> MINCLARET-1KT או MIDCLARET-1KT </td><td></td></tr><tr><td> 5 - (ו- 6)-carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl אסתר (CFDA-SE) </td><td> Invitrogen (חיים טכנולוגיים) </td><td> C34554 </td><td> ללא ניאון; carboxyfluorescein אמין-reactive בקע ידי esterases ממברנה כדי ליצור succinimidyl אסתר ניאון (CFSE) </td></tr><tr><td> ויולט ניתן לתקן LIVE / DEAD </td><td> Invitrogen (חיים טכנולוגיים) </td><td> L34955 </td><td></td></tr><tr><td> סטרילי x 12 מ&quot;מ 75 חרוטים צינורות פוליפרופילן &amp; כובעים </td><td> VWR </td><td> 60818-102 </td><td> נותן יעילות טובה יותר קרום צבע מכתים (מופחת לצבוע ספיחה; פחות אובדן תא במהלך שאיפת supernatant) </td></tr><tr><td> 12 x 75 המ&quot;מ rounתחתון ד צינורות קלקר </td><td> הקיטון דיקינסון </td><td> 21008-936 </td><td></td></tr><tr><td> cytometer זרימה </td><td> BD Bioscience </td><td> FACSCalibur LSRFortessa </td><td> כל cytometer מסוגל לזהות FITC, PKH26, ו7-AAD (488 ננומטר הדוגמא;. 520 ננומטר, 567 ננומטר, ו655 ננומטר, בהתאמה) וAPC לשעבר. 633-640 ננומטר; EM. 660 ננומטר) </td></tr><tr><td> cytometer זרימה </td><td> Beckman Coulter </td><td> LSRII ציאן </td><td> כל cytometer מסוגל לזהות FITC, PKH26, ו7-AAD (488 ננומטר הדוגמא;. 520 ננומטר, 567 ננומטר, ו655 ננומטר, בהתאמה) וAPC לשעבר. 633-640 ננומטר; EM. 660 ננומטר) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> המעבדה הוכנה </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, מנייה מרוכזת </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב PBS. הקפא בaliquots ולאחסן ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, worמלך המניות </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ב PBS; להכין מדי יום מהמניות 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​קפוא. </td></tr><tr><td> IgG בלוק </td><td> NA </td><td> NA </td><td> HBSS + 10 מ&quot;ג / מיליליטר נוגדנים אנושיים שבריר השני והשלישי כהן globulins + 10 מ&quot;ג / המ&quot;ל BSA. </td></tr></tbody></table>

optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes

צבעי ניאון מעקב סלולרי, בשילוב עם זרימת cytometry ותמונה, הם כלים רבים עצמה שבה ללמוד את יחסי הגומלין וגורלם של תאים מסוגים שונים במבחנת in vivo. 1-5 למרות שיש ממש אלף פרסומים באמצעות צבעים מעין אלה, שהחלק יישומי המעקב הסלולריים נתקלו הנפוץ ביותר כוללים ניטור של: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזע ורגיעה לתא אב, ריבוי ו / או בידול 6-8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת אנטיגן מונע קרום 9 ו / או התפשטות תאים מקדים ו3,4,10-18 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפקוד חיסוני תקין ומפעיל סלולרי 1,18-21. </li></ol> צבעי מעקב סלולרי זמינים מסחרי להשתנות במידה רבה בכימיה שלהם ומאפייני קרינה אבל הרוב הגדול נופלים לאחת משתי כיתות המבוססות על המנגנון של תיוג הנייד שלהם. &quot;צבעי ממברנה&quot;, מאופיינים בPKH26, הם צבעי lipophilic מאוד tמחיצה ביציבות אך אינה קוולנטית לקרומי תאים 1,2,11 כובע. &quot;צבעי חלבון&quot;, מאופיין בCFSE, הם צבעי אמין תגובתי שיוצרים קשרים קוולנטיים יציבים עם חלבוני תא 4,16,18. בכל כיתה יש יתרונות ומגבלות משלה. המפתח לשימוש המוצלח שלהם, במיוחד במחקרים שבו צבעים ססגוניים מרובים נמצאים בשימוש כדי לעקוב אחר תאים מסוגים שונים, ולכן כדי להבין את הבעיות הקריטיות המאפשרות שימוש אופטימלי בכל כיתה 2-4,16,18,24. הפרוטוקולים כללו כאן להדגיש שלוש סיבות שכיחות של תוצאות עניות או משתנים בעת שימוש בצבעי תא מעקב. ואלה הם: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כישלון להשיג תיוג בהיר ואחיד, לשחזור. זוהי נקודת התחלה הכרחית לכל מחקר מעקב תא, אך דורשת תשומת לב למשתנים שונים, כאשר שימוש בצבעים בממברנה מאשר בשימוש בצבעי חלבון או ריאגנטים מחייבים שיווי משקל כגון נוגדנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שילובי fluorochrome תת אופטימלייםnd / או אי הכללת פיצויי בקרות קריטיות. מעקב פלואורסצנטי הצבע הוא בדרך כלל 10 2 - בהיר 10 3 פעמים מפלואורסצנטי הנוגדן. לכן זה חיוני כדי לוודא שהנוכחות של צבע מעקב אינה פוגעת ביכולת לזהות בדיקות אחרות בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כישלון בהשגת כושר טוב עם תוכנת מודלי שיא. תוכנה כזו מאפשרת השוואת כמותית של תגובות פרוליפרטיביות פני אוכלוסיות או גירויים שונים המבוססות על תדר מבשר או מדדים אחרים. קבלה בכושר טוב, לעומת זאת, דורש הרחקה של מתים / למות תאים שיכולים לעוות פרופילי דילול צבע והתאמה של הנחות שבבסיס המודל עם מאפיינים של פרופיל דילול הצבע שיתקבל. </li></ol> דוגמאות מובאות כאן ממחישות כיצד משתנה אלה יכולים להשפיע על תוצאות בעת שימוש בקרום ו / או צבעי חלבון לפקח התפשטות תאים.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes at JoVE.com

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

שימוש מוצלח של צבעי מעקב סלולרי כדי לעקוב אחר תפקוד תא חיסוני והתפשטות כרוכה במספר שלבים קריטיים. אנו מתארים שיטות ל: 1) קבלת תווית-ing הבהיר והאחיד, לשחזור קרום עם צבעים: 2) בחירת תנאי נתוני רכישת fluorochromes ו; ו3) בחירת מודל לכמת התפשטות תאים על בסיס דילול צבע.

אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Labelling סלקטיבי של חלבונים על פני קרום התא באמצעות CyDye DIGE צבעים פלואוריד מינימלי

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Dissection חיים של תסיסנית עוברים: שיטות יעיל עבור הקרנת אוספים Mutant ידי מכתים נוגדן

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

קביעת מספר נייד במהלך תרבית תאים באמצעות מונה Cell שרביט השלטון

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

ניטור שינויים דינמיים רמות הסידן מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

מעקב נייד באמצעות חלבוני Photoconvertible במהלך פיתוח דג זברה

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

בדוגמנות Vivo של הגנום האנושי החולנית באמצעות Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

הכתמה histochemical של<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא המשני בוול אלמנטים

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

שיטות לעור פציעה ומבחנים לתגובות פצע ב<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

מעקב זמני של התקדמות תא מחזור שימוש cytometry הזרימה ללא הצורך בסנכרון

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

השוואה של שלוש שיטות שונות לקביעת שגשוג תאים בשורות תאי סרטן השד

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...