Name: optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes
Uploaded: 2012-12-13T12:00:00
Duration: 22 min 49 s
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The authors would particularly like to thank the following individuals for their technical and intellectual contributions to the development of these methods through the years: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nad&egrave;ge Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis Cell Science and PTI Research), Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice Givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc.), and Mary Waugh (Dartmouth Medical School). They would also like to thank the Bowdoin class of 2006 from the Annual Courses in Research Methods and Applications of Flow Cytometry, which generated the data shown in Figure 2.
Flow cytometry was performed at Roswell Park Cancer Institute's Flow Cytometry Laboratory, which was established in part by equipment grants from the NIH Shared Instrument Program, and receives support from the Core Grant (5 P30 CA016056-29) from the National Cancer Institute to the Roswell Park Cancer Institute, and at the Abramson Cancer Center Flow Cytometry and Cell Sorting Resource Laboratory of the University of Pennsylvania, which was established in part by equipment grants from the NIH Shared Instrument Program, and receives support from NIH #2P30 CA016520 from the National Cancer Institute. The work shown in Figures 3 and 5 was also supported in part by SBIR grant EB00228 from the National Institutes of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) awarded to PTI Research, Inc.

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	<li>Poon, R. Y., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Bagwell, C. B., Muirhead, K. A., Diamond, R. A., DeMaggio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+PKH+Membrane+Intercalating+Dyes+to+Monitor+Cell+Trafficking+and+Function.">Use of PKH Membrane Intercalating Dyes to Monitor Cell Trafficking and Function.</a> Living Color: Flow Cytometry and Cell Sorting Protocols. , 302-352 (2000).</li><li>Wallace, P. K., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Tracking+2007:+A+Proliferation+of+Probes+and+Applications.">Cell Tracking 2007: A Proliferation of Probes and Applications.</a> Immunol. Invest. 36, 527-562 (2007).</li><li>Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+lymphocyte+proliferation,+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data.">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nat. Protoc. 2, 2057-2067 (2007).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat. Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li><li>Bolton, D. L., Minang, J. T., Trivett, M. T., Song, K., Tuscher, J. J., Li, Y., Piatak, M., O'Connor, D., Lifson, J. D., Roederer, M., Ohlen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking,+Persistence,+and+Activation+State+of+Adoptively+Transferred+Allogeneic+and+Autologous+Simian+Immunodeficiency+Virus-Specific+CD8++T+Cell+Clones+during+Acute+and+Chronic+Infection+of+Rhesus+Macaques.">Trafficking, Persistence, and Activation State of Adoptively Transferred Allogeneic and Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones during Acute and Chronic Infection of Rhesus Macaques.</a> J. Immunol. 184, 303-314 (2010).</li><li>Juopperi, T. A., Sharkis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Quiescent+Murine+Hematopoietic+Stem+Cells+by+Homing+Properties.">Isolation of Quiescent Murine Hematopoietic Stem Cells by Homing Properties.</a> Meth. Mol. Biol. 430, 21-30 (2008).</li><li>Kusumbe, A. P., Bapat, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+aneuploid+populations+within+developing+tumors+are+the+major+determinants+of+tumor+dormancy.">Cancer stem cells and aneuploid populations within developing tumors are the major determinants of tumor dormancy.</a> Cancer Res. 69, 9245-9253 (2009).</li><li>Pece, S., Tosonim, D., Confalonieri, S., Mazzarol, G., Vecchi, M., Ronzoni, S., Bernard, L., Viale, G., Pelicci, P. G., Fiore, P. P. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+Molecular+Heterogeneity+of+Breast+Cancers+Correlates+with+Their+Cancer+Stem+Cell+Content.">Biological and Molecular Heterogeneity of Breast Cancers Correlates with Their Cancer Stem Cell Content.</a> Cell. 140, 62-73 (2010).</li><li>Gertner-Dardenne, J., Poupot, M., Gray, B. D., Fourni&#233;, J. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+fluorochrome+trackers+of+membrane+transfers+between+immune+cells.">Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells.</a> Immunol. Invest. 36, 665-685 (2007).</li><li>Bercovici, N., Givan, A. L., Waugh, M. G., Fisher, J. L., Vernel-Pauillac, F., Ernstoff, M. S., Abastado, J. P., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+precursor+analysis+of+T-cell+responses+to+antigen.">Multiparameter precursor analysis of T-cell responses to antigen.</a> J. Immunol. Methods. 276, 5-17 (2003).</li><li>Givan, A. L., Fisher, J. L., Waugh, M. G., Bercovici, N., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cell-tracking+dyes+to+determine+proliferation+precursor+frequencies+of+antigen-specific+T+cells.">Use of cell-tracking dyes to determine proliferation precursor frequencies of antigen-specific T cells.</a> Methods Mol. Biol. 263, 109-124 (2004).</li><li>Schwaab, T., Tretter, C. P., Gibson, J. J., Cole, B. F., Schned, A. R., Harris, R., Fisher, J. L., Crosby, N., Stempkowski, L. M., Heaney, J. A., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-related+immunity+in+prostate+cancer+patients+treated+with+human+recombinant+granulocyte+monocyte-colony+stimulating+factor+(GM-CSF).">Tumor-related immunity in prostate cancer patients treated with human recombinant granulocyte monocyte-colony stimulating factor (GM-CSF).</a> Prostate. 66 (6), 667-674 (2006).</li><li>Bantly, A. D., Gray, B. D., Breslin, E., Weinstein, E. G., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellVue+Claret,+a+New+Far-Red+Dye,+Facilitates+Polychromatic+Assessment+of+Immune+Cell+Proliferation.">CellVue Claret, a New Far-Red Dye, Facilitates Polychromatic Assessment of Immune Cell Proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 581-605 (2007).</li><li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+assay+for+quantitation+of+rare+antigen-specific+T-cells:+using+cell-tracking+dyes+to+calculate+precursor+frequencies+for+proliferation.">A flow cytometric assay for quantitation of rare antigen-specific T-cells: using cell-tracking dyes to calculate precursor frequencies for proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 563-580 (2007).</li><li>Tario, J. D., Gray, B. D., Wallace, S. S., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lipophilic+tracking+dyes+for+monitoring+cell+proliferation.">Novel lipophilic tracking dyes for monitoring cell proliferation.</a> Immunol Invest. 36, 861-885 (2007).</li><li>Wallace, P. K., Tario, J. D., Fisher, J. L., Wallace, S. S., Ernstoff, M. S., , ., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Antigen-Driven+Responses+by+Flow+Cytometry:+Monitoring+Proliferation+by+Dye+Dilution.">Tracking Antigen-Driven Responses by Flow Cytometry: Monitoring Proliferation by Dye Dilution.</a> Cytometry. 73, 1019-1034 (2008).</li><li>Barth, R. J., Fisher, D. A., Wallace, P. K., Channon, J. Y., Noelle, R. L., Gui, J., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Randomized+Trial+of+Ex+vivo+CD40L+Activation+of+a+Dendritic+Cell+Vaccine+in+Colorectal+Cancer+Patients:+Tumor-Specific+Immune+Responses+Are+Associated+with+Improved+Survival.">A Randomized Trial of Ex vivo CD40L Activation of a Dendritic Cell Vaccine in Colorectal Cancer Patients: Tumor-Specific Immune Responses Are Associated with Improved Survival.</a> Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).</li><li>Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Immune+Cell+Proliferation+and+Cytotoxic+Potential+Using+Flow+Cytometry.">Tracking Immune Cell Proliferation and Cytotoxic Potential Using Flow Cytometry.</a> Meth. Mol. Biol. 699, 119-164 (2011).</li><li>Fuse, S., Underwood, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Analysis+of+In+Vivo+CD8++T+Cell+Cytotoxicity+Against+Multiple+Epitopes+using+Multicolor+Flow+Cytometry.">Simultaneous Analysis of In Vivo CD8+ T Cell Cytotoxicity Against Multiple Epitopes using Multicolor Flow Cytometry.</a> Immunol. Invest. 36, 829-845 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Fleck, M., Mackensen, A., Zoso, A., Halbritter, D., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111, 3546-3552 (2008).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+cellular+proliferation+data:+Avoid+the+panglossian.">Interpretation of cellular proliferation data: Avoid the panglossian.</a> Cytometry. 79A, 95-101 (2011).</li><li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+(CFSE)+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation.">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> J. Vis. Exp. (44), e2259 (2010).</li><li>Houlihan, D. D., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Review+of+Clinical+Trials+of+Bone+Marrow+Stem+Cells+in+Liver+Disease.">Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease.</a> Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).</li><li>Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+In+Vitro+Suppressive+Capacity+of+Regulatory.">Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory.</a> T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).</li></ol>

लालकृष्ण Humphrey, जद Tario जूनियर, और पी.के. वालेस जीवन टेक्नोलॉजीज इंक, और बी.डी. बायोसाइंसेज से मूल्यांकन के लिए पूर्व वाणिज्यिक ट्रैकिंग सेल अभिकर्मकों प्राप्त हुआ है. ई. Bantly और जे एस मूर पूर्व वाणिज्यिक मूल्यांकन के लिए अभिकर्मकों ट्रैकिंग सेल जीवन टेक्नोलॉजीज इंक, और धन विभिन्न CellVue रंजक ट्रैकिंग सेल के पूर्व वाणिज्यिक लक्षण वर्णन के लिए पीटीआई अनुसंधान इंक, से प्राप्त हुआ है. लालकृष्ण Muirhead SciGro, इंक, जो PHANOS टेक्नोलॉजीज इंक, परामर्श सेवाएं प्रदान करता है (PKH और CellVue रंजक के मालिक) और सिग्मा Aldrich और आण्विक लक्ष्य टेक्नोलॉजीज, इंक के लिए बैकअप तकनीकी सहायता प्रदान करता है (द्वारा नियोजित है इनमें से वितरकों ) रंजक. उत्पादन और इस लेख के लिए नि: शुल्क प्रवेश सिग्मा Aldrich द्वारा प्रायोजित है.

यहाँ वर्णित तरीकों हमारे संयुक्त प्रयोगशालाओं में पाया गया सबसे hPBMC 13,16,18 झिल्ली रंगों का उपयोग कर लेबलिंग के लिए और लिम्फोसाइट सबसेट phenotyping और प्रसार ट्रैकिंग या झिल्ली या प्रोटीन 2,11,13,16 रंगों का उपयोग करने के लिए मज़बूती से इष्टतम परिणाम दे रहे हैं, 18. आंकड़े 1 और 2 में सचित्र, उज्ज्वल वर्दी लेबलिंग सबसे आसानी से लवण की शारीरिक उपस्थिति सीमित है और एक मिश्रण तकनीक का उपयोग कर से प्राप्त है कि तेजी से, सभी कोशिकाओं के सजातीय डाई उसी की एकाग्रता के लिए जोखिम में परिणाम. क्योंकि झिल्ली रंगों के साथ धुंधला लिपिड bilayer में विभाजन होता है, तो अन्य चर है कि मुक्त डाई एकाग्रता में परिवर्तन भी लेबलिंग दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, लवण की कम कुशल वार्शआउट में तनुकारक (वस्तु) सी में resuspension पहले दौर नीचे polystyrene ट्यूबों परिणामों में लेबलिंग और भी कम मुक्त डाई ट्यूब दीवारों पर सोखना डाई करने के लिए, विशेष रूप से की वजह से एकाग्रता मेंकम डाई सांद्रता में. दोनों कारकों के लिए व्यापक जब लेबलिंग किया जाता है से धुंधला हो जाना वितरण शंक्वाकार नीचे polypropylene ट्यूब (3 आंकड़े, 4 और का उपयोग कर दे देते हैं अप्रकाशित परिणाम). नमूना उम्र और प्रकार भी शिखर चौड़ाई को प्रभावित कर सकते हैं जब भी अनुकूलित धुंधला हो जाना प्रक्रियाओं का इस्तेमाल किया जाता है. उदाहरण के लिए, हौसले से तैयार की 14-20% से रक्त जबकि 24 घंटे पुराने रक्त नमूनों या TRIMA pheresis फिल्टर रेंज से अलग लिम्फोसाइटों के लिए सीवी (3 चित्रा, रेफरी 13. और अप्रकाशित परिणाम) सीमा से अलग PKH26 स्थिति लिम्फोसाइटों के लिए सीवी 25-30 से % (4 चित्रा और रेफरी 18.). एकरूपता और हद तक जो अलाभकारी कोशिकाओं विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है दोनों को प्रभावित कि वर्गो में विभाजनीय बेटी चोटियों डाई कमजोर पड़ने प्रोफाइल, जो बारी में एक प्रसार मॉडल की पसंद को प्रभावित करने के लिए मनाया डेटा (5 और 6 आंकड़े फिट में स्पष्ट कर रहे हैं धुंधला </strong&gt;). हालांकि ModFit (सत्य सॉफ्टवेयर हाउस, Topsham, इ) यहाँ प्रसार सूचकांक और अग्रदूत आवृत्ति (आंकड़े 3, 5 और 6, 3 टेबल) जैसी मीट्रिक उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर के एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है, अन्य सॉफ्टवेयर संकुल भी मॉड्यूल का विश्लेषण करने के लिए होते हैं प्रसार डेटा. ये शामिल FCSExpress (डी नोवो सॉफ्टवेयर, लॉस एंजिल्स, CA) और FlowJo (ट्री स्टार, इंक, Ashland, या). इन कार्यक्रमों के सभी एक गैर रेखीय कम से कम वर्ग विश्लेषण का उपयोग करने iteratively स्थिति, ऊंचाई और गाऊसी अनुक्रमिक बेटी पीढ़ियों का प्रतिनिधित्व चोटियों की एसडी (या चौड़ाई) को बदलने से कच्चे डेटा के लिए सबसे अच्छा फिट खोजने. Proliferative (पीआई) सूचकांक और अग्रदूत आवृत्ति (पीएफ) के प्रसार की हद तक का सबसे अधिक इस्तेमाल किया उपाय कर रहे हैं. PI, रूप में ModFit द्वारा परिभाषित किया गया है, परख के दौरान सेल की संख्या में वृद्धि, एक thymidine तेज परख &#39;उत्तेजना सूचकांक&#39; अनुरूप का एक उपाय है. पीएफ रिटर्न प्रारंभिक populat में कोशिकाओं के अंशआयन है कि proliferating द्वारा प्रोत्साहन के लिए प्रतिक्रिया व्यक्त की. सावधानी की सलाह दी है, लेकिन, जब साहित्य पढ़ने के बाद से शब्दावली कुछ सॉफ्टवेयर (जैसे, FlowJo और ModFit द्वारा &quot;प्रसार सूचकांक&quot; क्या मतलब है के लिए अलग परिभाषाओं और गणना का उपयोग) संकुल के बीच 22 से भिन्न होता है. झिल्ली रंगों के साथ प्रसार विश्लेषण और लेबलिंग के लिए महत्वपूर्ण मुद्दों पर चर्चा भी जब प्रोटीन रंगों का उपयोग कर सामना कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, मिश्रण तकनीक के लिए सावधान ध्यान भी मृत / मर कोशिकाओं का बहिष्कार के साथ मनाया जाना चाहिए, क्रम में वर्दी वितरण और वर्गो में विभाजनीय बेटी चोटियों को प्राप्त करने के लिए जब (6 चित्रा) CFSE 2-4,13,18,24 का उपयोग कर. Phenotyping और व्यवहार्यता के मूल्यांकन के लिए fluorochromes का उपयुक्त विकल्प भी महत्वपूर्ण है अत्यधिक वर्णक्रमीय ओवरलैप और एंटीबॉडी पॉजिटिव कोशिकाओं की पहचान करने में असमर्थता से बचने दिखाई उत्सर्जन प्रोटीन ऐसे 2-4,11,13,16,18 CFSE के रूप में रंगों के साथ विशेष रूप से, </sup&gt;. ट्रैकिंग डाई की एकाग्रता को कम आसन्न वर्णक्रमीय चैनलों में मुआवजे की समस्याओं को कम हो जाती है, लेकिन यह भी नजर रखी जा सकता है कि सेल डिवीजनों की संख्या की सीमा से पहले बेटी सेल तीव्रता autofluorescence साथ ओवरलैप शुरू. वैकल्पिक रूप से उपयोग करते हैं, दूर लाल उत्सर्जन CellVue (सिग्मा Aldrich, सेंट लुइस, MO) क्लैरट या बैंगनी उत्सर्जक CellTrace वायलेट (जीवन टेक्नोलॉजीज, ग्रांड द्वीप, NY) के रूप में इस तरह के नए सेल ट्रैकिंग रंगों के मुआवजे की समस्याओं को कम कर सकते हैं (चित्रा 6). अंत में, हालांकि झिल्ली रंजक आम तौर पर कम 11,26 विषाक्तता का प्रदर्शन करते हैं, यह डाई के दोनों वर्ग के साथ लेबल की कोशिकाओं के लिए संभव है. इसलिए यह हमेशा सत्यापित करने के लिए आवश्यक है कि ट्रैकिंग डाई का इस्तेमाल किया एकाग्रता कोशिकाओं की कार्यक्षमता का पता लगाया जा (6 चित्रा) 3,13,16,18 नहीं बदल दिया गया है.

<table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक या उपकरण </td><td> कंपनी </td><td> सूचीपत्र संख्या </td><td> टिप्पणियां </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> व्यावसायिक तौर पर खरीदा </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin डी </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> A9400 </td><td></td></tr><tr><td> गोजातीय सीरम albumin (BSA) </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) </td><td> अटलांटा बायोलॉजिकल </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> हैंक्स संतुलित नमक समाधान (HbSS) </td><td> जीवन टेक्नोलॉजीज </td><td> 14175-079 </td><td> मुक्त phenol लाल के बिना कैल्शियम और मैग्नीशियम, </td></tr><tr><td> मानव आईजीजी Cohn अंश द्वितीय और तृतीय globulins </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> G-4386 </td><td></td></tr><tr><td> माउस विरोधी मानव CD3 FITC </td><td> बी.डी. बायोसाइंसेज </td><td> 349201 </td><td> Saturating एकाग्रता के रूप में प्रयोगशाला अनुमापन द्वारा निर्धारित </td></tr><tr><td> माउस विरोधी मानव CD4 APC </td><td> बी.डी. बायोसाइंसेज </td><td> 340672 </td><td> Saturating एकाग्रता के रूप में प्रयोगशाला अनुमापन द्वारा निर्धारित </td></tr><tr><td> माउस विरोधी मानव CD4 PECy7 </td><td> बी.डी. बायोसाइंसेज </td><td> 348799 </td><td> Saturating एकाग्रता के रूप में प्रयोगशाला अनुमापन द्वारा निर्धारित </td></tr><tr><td> माउस विरोधी मानव CD8 FITC </td><td> बी.डी. बायोसाइंसेज </td><td> 347313 </td><td> Saturating एकाग्रता के रूप में प्रयोगशाला अनुमापन द्वारा निर्धारित </td></tr><tr><td> माउस विरोधी मानव CD8 - APC </td><td> Caltag (जीवन टेक्नोलॉजीज) </td><td> MHCD0805 </td><td> Saturating एकाग्रता के रूप में प्रयोगशाला अनुमापन द्वारा निर्धारित </td></tr><tr><td> माउस विरोधी मानव CD19-APC </td><td> Caltag (जीवन टेक्नोलॉजीज) </td><td> MHCD1905 </td><td&gt; saturating एकाग्रता रूप में प्रयोगशाला अनुमापन द्वारा निर्धारित </td></tr><tr><td> माउस मानव विरोधी CD25-APC </td><td> बी.डी. बायोसाइंसेज </td><td> 340938 </td><td> Saturating एकाग्रता के रूप में प्रयोगशाला अनुमापन द्वारा निर्धारित </td></tr><tr><td> माउस मानव विरोधी CD127 पीई </td><td> बी.डी. बायोसाइंसेज </td><td> 557938 </td><td> Saturating एकाग्रता के रूप में प्रयोगशाला अनुमापन द्वारा निर्धारित </td></tr><tr><td> माउस विरोधी मानव CD3 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0037-85 </td><td> 1.0 मिलीग्राम / एमएल, azide मुक्त </td></tr><tr><td> माउस विरोधी मानव CD28 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0289-85 </td><td> 1.0 मिलीग्राम / एमएल, azide मुक्त </td></tr><tr><td> पीबीएस </td><td> Gibco </td><td> 21300-058 </td><td></td></tr><tr><td> PKH26 लाल फ्लोरोसेंट सेल linker EtOH में PKH26 10-3M तनुकारक (वस्तु) और सी युक्त किट </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> PKH26GL - 1KT या MINI26 - 1KT </td><td> चरण 1 में प्रक्रिया भी लागू होते हैंकिट PKH67 युक्त या अन्य CellVue रंजक </td></tr><tr><td> क्लैरट CellVue दूर लाल फ्लोरोसेंट सेल linker EtOH तनुकारक (वस्तु) और सी में 10-3M CellVue क्लैरट युक्त किट </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> MINCLARET 1KT या MIDCLARET - 1KT </td><td></td></tr><tr><td> 5 - (और 6) carboxyfluorescein Diacetate, succinimidyl एस्टर (CFDA-एसई) </td><td> Invitrogen (जीवन टेक्नोलॉजीज) </td><td> C34554 </td><td> गैर फ्लोरोसेंट, झिल्ली esterases द्वारा cleaved फ्लोरोसेंट के लिए फार्म एमिनो प्रतिक्रियाशील carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) </td></tr><tr><td> LIVE / DEAD fixable वायलेट </td><td> Invitrogen (जीवन टेक्नोलॉजीज) </td><td> L34955 </td><td></td></tr><tr><td> बाँझ 12 x 75 शंक्वाकार मिमी polypropylene ट्यूब और टोपियां </td><td> VWR </td><td> 60818-102 </td><td> बेहतर झिल्ली डाई धुंधला हो जाना (दक्षता, कम तैरनेवाला आकांक्षा के दौरान सेल नुकसान कम डाई सोखना) देता है </td></tr><tr><td> 12 x 75 मिमी rounघ नीचे polystyrene ट्यूबों </td><td> Becton Dickinson </td><td> 21008-936 </td><td></td></tr><tr><td> प्रवाह cytometer </td><td> बायोसाइंस BD </td><td> FACSCalibur LSRFortessa </td><td> और APC पूर्व, कोई cytometer FITC, PKH26, और 7-AAD (520 एनएम, 567 एनएम और 655 एनएम, क्रमशः उन्हें उदा. 488 एनएम) का पता लगाने में सक्षम है. उन्हें, 633-640 एनएम. 660 एनएम) </td></tr><tr><td> प्रवाह cytometer </td><td> Beckman कल्टर </td><td> LSRII सियान </td><td> और APC पूर्व, कोई cytometer FITC, PKH26, और 7-AAD (520 एनएम, 567 एनएम और 655 एनएम, क्रमशः उन्हें उदा. 488 एनएम) का पता लगाने में सक्षम है. उन्हें, 633-640 एनएम. 660 एनएम) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> प्रयोगशाला तैयार </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin डी, केंद्रित स्टॉक </td><td> NA </td><td> NA </td><td> पीबीएस में 1 मिलीग्राम / मिलीलीटर. -20 डिग्री सेल्सियस और aliquots दुकान में रुक </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin डी, worराजा स्टॉक </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 100 ग्राम / पीबीएस में मिलीग्राम, 1 मिलीग्राम / एमएल जमे हुए स्टॉक से दैनिक तैयार करते हैं. </td></tr><tr><td> आईजीजी ब्लॉक </td><td> NA </td><td> NA </td><td> HbSS + 10 मिग्रा / मिली मानव आईजीजी Cohn अंश द्वितीय और तृतीय 10 + मिलीग्राम / एमएल BSA globulins. </td></tr></tbody></table>

optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

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Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

सेल ट्रैकिंग रंगों के सफल उपयोग करने के लिए प्रतिरक्षा सेल समारोह और प्रसार पर नजर रखने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम शामिल है. हम के लिए विधियों का वर्णन: 1) उज्ज्वल, वर्दी, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य झिल्ली रंगों के साथ लेबल आईएनजी प्राप्त करने, 2) fluorochromes और डाटा अधिग्रहण शर्तों का चयन, और 3) के लिए सेल डाई कमजोर पड़ने के आधार पर प्रसार यों के लिए एक मॉडल का चयन.

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