Name: optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes
Uploaded: 2012-12-13T12:00:00
Duration: 22 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes at JoVE.com

Forfatterne ønsker spesielt å takke følgende personer for deres tekniske og intellektuelle bidrag til utviklingen av disse metodene gjennom årene: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nadège Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis Cell Science and PTI Research) , Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc.), og Mary Waugh (Dartmouth Medical School). De vil også gjerne takke Bowdoin klassen av 2006 fra den årlige kurs i forskningsmetode og anvendelser av flowcytometri, som genererte data vist i figur 2. Flowcytometri ble utført ved Roswell Park Cancer Institute flowcytometri Laboratory, som ble etablert i en del av utstyr tilskudd fra NIH Delt Instrument Program, og får støtte fra Core Grant (5 P30 CA016056-29) fra NationalCancer Institute til Roswell Park Cancer Institute, og på Abramson Cancer Center flowcytometri og Cell Sortering Resource Laboratory ved University of Pennsylvania, som ble etablert i en del av utstyr tilskudd fra NIH Delt Instrument Program, og får støtte fra NIH # 2P30 CA016520 fra National Cancer Institute. Arbeidet er vist i figur 3 og 5 ble også støttet delvis av SBIR stipend EB00228 fra National Institutes of Biomedical Imaging og bioteknologi (NIBIB) tildelt PTI Research, Inc.

1. Generell Membran Merking med PKH26 Cell Tracking Dye (Ref. 25, Figur 1) <ol><li> Bruk steril teknikk for trinn 1.1 til 1.9. Forbered ~ 10 7 humane perifere mononukleære blodceller eller leukocytter (hPBMC, hPBL) ved hjelp av laboratoriets standard metode med tillegg av en endelig 300 xg spin å minimere blodplater forurensning. Resuspender cellene ved 10 7 / ml i HBSS en% BSA og sted på is, reservere en 500 pl alikvot (5x10 6 celler) for bruk i trinn 2. </li><li> Plass 5x10 6 celler (500 ul) i en 12 x 75 mm konisk polypropylenrør. Vask en gang med 3,5 ml HBSS. Nøye suge supernatant, uten å etterlate mer enn 15-25 ul restvæsken, men tar seg ikke å fjerne celler. Bruk dette røret for å forberede en 2x cellesuspensjon i trinn 1.4. </li><li> Under cellen vaske i trinn 1.2, tilsett 0,5 ml fortynning C merking kjøretøy (fra PKH26GL kit) til en 12 x 75 mm konisk polypropylenrør. Bruk dette røret til preper en 2x PKH26 løsning i trinn 1.5. </li><li> Tilsett 0,5 ml fortynning C merking kjøretøy til den vaskede cellepelleten fra trinn 1.2 og aspireres og dispensere 3-4 ganger for å oppnå en enkel cellesuspensjon (2x celler). Unngå bobledannelse og overdreven miksing, noe som kan redusere celleviabilitet og utvinning. </li><li> Umiddelbart etter å forberede 2x cellesuspensjon i trinn 1.4, utarbeide en 2x (4 mikrometer) dye løsning ved å legge 2,0 ul på 1,0 mM PKH26 fargestoff lager i etanol (fra PKH26GL kit) til Diluent C tube utarbeidet i trinn 1.3 og vortex til spre jevnt. </li><li> Umiddelbart etter å forberede 2x fargeløsning i trinn 1.5, raskt Pipetter 2x cellesuspensjon fra trinn 1,4 til 2x fargeløsning og samtidig aspirer og dispensere 3-4 ganger helt spre celler i fargestoff Ikke:. Legg 1,0 mM fargestoff direkte til celler, hell 2x celler i 2x fargestoff, eller legge 2x celler til 2x fargestoff mens virvle. Fordi farging er nesten momentant, slike metoder gi mindreensartede intensiteter enn den anbefalte metoden (figur 2). </li><li> Etter 1 min, tilsett 1,0 ml varmeinaktivert serum eller HBSS 5% BSA for å stoppe fargestoff opptak i cellemembraner. Unnlatelse av å bruke nok protein risikerer dannelsen av fargestoff aggregater, som kan pellet med cellene under vasketrinnene og forårsake utilsiktede merking av andre celler i et eksperiment. Hvis medium med 10% varme-inaktivert serum (CM) eller HBSS en% BSA er å bli brukt til stopp reagens, utføre flekker i et 15 ml konisk polypropylenrør og legge til minst 5,0 ml av stop reagens å sikre adsorpsjon av alt unincorporated fargestoff. </li><li> Sentrifuger merkede celler for 5 min @ ~ 400 x g.. Nøye suge supernatanten uten å fjerne celler. Vask pelleten to ganger med 4 ml av CM eller HBSS en% BSA, dispergere pelleten godt før recentrifugation. Å minimalisere overføringen av fargestoff adsorbert på rørvegger og maksimere vaskeeffektiviteten, overføre cellene til en frisk polypropylenrør etter first resuspendering. Merk: tilstrekkelig fargede celler vil oppvise en tydelig rosa skjær i pelleten. </li><li> Resuspender vaskede cellepelleten i 1,0 ml HBSS +1% BSA. Tell cellene, bestemme celle utvinning, og justere volumet til å gi en endelig konsentrasjon på 10 7 / ml. Med forsiktig aspirasjon, bør celle utvinning være ≥ 85%. Hvis celle utvinning er &lt;70%, finne årsaken før du fortsetter. Trekke en 150 pl delmengde (1.5x10 6 celler) og plass på isen for bruk i trinn 2. </li></ol> 2. Utarbeidelse av Instrument og Assay Oppsett Controls (tabell 1) <ol><li> Aliquot 50 ul (5x10 5) av unstained celler fra cellesuspensjonen lagret i trinn 1,1 i hver av fem 1,8 ml Eppendorf-rør: 1, 3, 4, 5 og 7. Aliquot 50 ul (5x10 5) av PKH26 pos celler fra trinn 1,9 i hver av tre rør: 2, 6 og 8. </li><li> Tilsett 10 pl IgG blokk (100 ug / tube av IgG, se tabell av reagenser) til rør 1-8og inkuber i 10 minutter ved omgivelsestemperatur (20-25 ° C). </li><li> Legge en mette mengde av antistoff (ies) angitt i tabell 1-4 Rør, 5, 7, og 8 og inkuber alle prøvene (Tubes 1-8) i 30 minutter ved omgivelsestemperatur og beskyttet mot lys. </li><li> Tilsett 1,5 ml HBSS en% BSA til alle prøver, pellet cellene ved sentrifugering (5 min @ 400 xg) og vask en gang med 1,5 ml HBSS en% BSA, med forsiktig aspirasjon å unngå celletap. </li><li> Resuspender hver prøve i 500 ul HBSS +1% BSA. Hvis nødvendig for prøver som skal analyseres på cytometer din, overføre til en 12 x 75 mm rundbunnet rør. Tilsett 10 pl av 100 ug / ml 7-AAD daglig arbeider lager (se tabell av reagenser) til 3 rør, 6, 7 og 8 som angitt i tabell 1. Inkuber på is i 30 min før bruk i strømningscytometer oppsett og farging verifikasjon (trinn 3). </li></ol> 3. Flowcytometer Oppsett og Staining Verifisering <ol><li> Kontroller at strømmen cytometer fungerer som den skal, ved hjelp av laboratoriets etablerte prosedyrer for daglig kontroll. Kontroller at signaler kan lett påvises i hver spektral vinduet skal brukes, og at detektor-responser er lineært proporsjonal med signalintensiteten i vinduet som skal brukes for spredning overvåking 14. </li><li> Erverve FSC vs SSC data for Rør 1 bruker lineære skjerm skalaer. Juster hver enkelt detektor forsterkning slik at lymfocytt befolkningen faller i nedre venstre kvadrant av prikkplott, er ikke off-skala i en av parametrene, og ikke blir avbrutt på grunn av thresholding. Samle ungated FSC vs SSC data for alle prøvene i trinn 3.3 til 3.7. </li><li> Samle inn data for Tube 1, med ingen farge kompensasjon og logaritmiske skjerm skalaer for alle 4 fluorescens detektorer. Juster hver enkelt detektor høy spenning (HV) for å plassere autofluorescens av unstained lymfocytter på skalaen med få / ingen celler akkumuleres i første kanal. Angi en analyse grense for hvert histogramtilsvarende til de lyseste 2% av unstained celler. </li><li> Bruker ingen fargekompensasjon og HV innstillinger etablert i trinn 3.2 og 3.3, skaffe data for Tube 2, samle FSC, SSC og signaler i alle 4 fluorescens detektorer. For detektoren brukes til å overvåke PKH26 fluorescens, kontrollere at alle PKH26 pos celler vises på skalaen som en enkelt symmetrisk topp i 3. -4 th tiåret, med få / ingen celler i den siste kanalen. Hvis det er flere topper eller topp form er skjev, gjenta trinn 1 med omsorgen for salt minimalisering og miksing teknikk (figur 2). Juster om nødvendig dye konsentrasjon. </li><li> Med innstillinger etablert i trinn 3.3, samle inn data for Tube 3, samle FSC, SSC og signaler i alle 4 fluorescens detektorer. For detektoren brukes til å overvåke 7-AAD fluorescens, må du kontrollere at 7-AAD pos celler faller over 2% grenseavtalen i trinn 3.3 (dvs. at ikke-levedyktige celler er godt løstfra levedyktige 7-AAD neg celler). </li><li> Med innstillinger etablert i trinn 3.3, samle inn data for Tube 4, samle FSC, SSC og signaler i alle 4 fluorescens detektorer. Kontroller at CD8 pos celler er godt løst fra unstained celler (dvs. fall over 2% grenseavtalen i trinn 3.3 for FITC detektor). Gjenta med Tube 5 og kontrollere at CD8 pos celler er godt løst fra unstained celler (dvs. fall over 2% grenseavtalen i trinn 3.3 for APC detektor). </li><li> Bruke innstillinger etablert i trinn 3.3, samle inn data for 6 Tubes, 7 og 8, samle FSC, SSC og signaler i alle 4 fluorescens detektorer. </li><li> Bruk listen modusfiler samlet for Tubes 1-5 og din farge kompensasjon programvare for å etablere en farge overlapper matrise for hver fluorokrom i detektorene blir brukt til å overvåke de tre andre fluorokromer. Påfør denne matrisen til listen modus filen for Prøve 6 og verifisere at tilstedeværelsen av PKH26 labEling endrer ikke muligheten til å oppdage 7-AAD pos celler. </li><li> Påfør fargen overlapper matrisen fra trinn 3,8 til listen modus filen for Prøve 7 og verifisere at: a) 3 godt løst subpopulasjoner (CD3 neg CD4 neg, CD3 pos CD4 neg og CD3 pos CD4 pos) kan identifiseres på en FITC vs APC prikkplott, og b) tilstedeværelse av anti-CD3-FITC og anti-CD4-APC endrer ikke evnen til å oppdage 7-AAD pos celler. Dersom tilstedeværelsen av anti-CD3-FITC endrer øvre 2% grense for data innsamlet på PKH26 detektoren, juster grensen som kreves. </li><li> Påfør fargen overlapp matrise fra trinn 3,8 til listen modus filen for Prøve 8. Om tilstedeværelsen av PKH26 merking endrer 2% grensen for FITC, 7-AAD eller APC detektorer fra de som er angitt autofluorescens kontroll i trinn 3.3, justere grensen (e) etter behov ved hjelp Tube 7 av tabell 1 og kontroller at den er fortsatt mulig å distinguish CD3 pos CD4 pos, CD3 pos CD4 neg, og CD3 neg CD4 neg celler ved hjelp av den justerte grensen (e). </li></ol> 4. Spredning Model Selection for Celledeling Overvåking av Dye Fortynning <ol><li> Bestem avstanden mellom generasjoner, som er avhengig av antall kanaler og logaritmiske tiår cytometer din. For digitale instrumenter, er denne verdien, vanligvis 4 eller 5 tiår, bestemmes av antall hyller i digital signalprosessor. På analoge instrumenter, der antall tiår er sjelden et helt tall, krever nøyaktig modellering nøyaktig antall tiår å bli eksperimentelt bestemt. For å gjøre dette, er data fra en blanding av kalibrert fluorescerende perler med produsent-tildelt relative intensiteter kjøpt til den samme detektoren høyspenning innstillingene som brukes i forsøket. Posisjonen til de bead toppene tillater kalibrering av den logaritmiske skala i form av intensity området per log tiår. Konkret gjøres dette ved å plotte kanalnummer for hver perle typen mot stokken av produsenten tilskrives verdi. Stigningstallet en best rett linje som passer for bead dataverdiene gir antall relative intensitet enheter per kanal. Multiplisert med antall kanaler, vil denne verdien deretter være antall log tiår for full skala, hvorfra antallet kanaler som tilsvarer en to-fold reduksjon i intensitet (dvs. datter generasjon linjeavstand) kan beregnes 14. </li><li> Bestem om å bruke en fast avstand mellom generasjoner eller å tillate avstandsstykket å flyte. A Standard (fast), vil bruke generasjonsskifte avstand verdi fastsatt i trinn 4,5 til tildele plasseringen av hver generasjon, og brukes vanligvis når histogrammet mangler tydelige topper. En Float innstillingen gjør hver generasjonsskifte topp plassering som fastsettes av histogrammet form og brukes vanligvis når distinguishable generasjonsskifte topper er tydelig. </li><li> Bestem om du vil bruke en fast toppbredden for alle generasjoner eller en flytende bredde. Et fast bredde bruker SD beregnet for unstimulated kontrollutvalget å modellere alle generasjoner og er vanligvis valgt når prøven mangler skjelnes generasjonsskifte topper. En flytende bredde gjør at programmet kan uavhengig variere SD for hver generasjon og er best brukt med skjelnes generasjonsskifte topper. </li><li> Kjør et program som inneholder en spredning analyse modul (her ModFit LT versjon 3.3). Laste stimulert PKH26 pos fil fra datasettet som skal analyseres (for eksempel en stimulert 96 timer kultur PKH26 pos celler kontrafarget som for Tube 8 i tabell 1). </li><li> Velg parameterne for analyse, i dette tilfellet PKH26 (585/42) innkoplet levedyktig (7-AAD neg) CD3 pos lymfocytter og FSC vs SSC å utelukke små rusk og store aggregater (figur 3). I å defineredisse regionene være forsiktig med å inkludere den høye fremover scatter område der blasts er vanligvis funnet og merk at CD3 uttrykk kan være nede-modulert i stimulerte kulturer. </li><li> Opprett en ny spredning modell med spredning Wizard. Hjelp av Open datafil (Start tab), legger unstimulated PKH26 pos kontroll fil og definere plasseringen av topp kanal i foreldrenes fordeling tilsvarende udelt celler. </li><li> Analysere fil for unstimulated PKH26 pos kontroll, og bemerker verdiene for foreldrenes topp posisjon og bredde (standardavvik). Hvis en fast toppbredden (SD) er ønskelig, sjekk Lås SD. </li><li> Laste PKH26 neg kontroll (for eksempel en 96 timers kultur av PKH26 neg celler kontrafarget som for Tube 7 i tabell 1). Juster antall generasjoner ved å innstille peak kanal for dimmest generasjonen ovenfor PKH26 neg kontrollen. Dette bestemmer number av datter generasjoner modellen kan nøyaktig passform og er vanligvis 6-9 generasjoner. </li><li> Åpne datafil for stimulert prøve (for eksempel en stimulert 96 timer kultur PKH26 pos celler kontrafarget som for Tube 8 i tabell 1) og kontroller at regionene for foreldrepenger topp plassering og SD som definert i trinn 4.7 uendret. Hvis fast generasjonsskifte avstand er ønskelig, velg Standard modell alternativet, ellers velger Floating alternativet. </li><li> Analysere hver eksperimentell fil i datasettet, etter samme modell som er definert i trinn 4.9. Mindre justeringer av foreldrenes topp plassering kan være nødvendig for de aller beste passform som definert både visuelt og ved redusert chi square (RCS) verdi. </li><li> Registrere de ønskede spredning beregninger som følge av den best passer for hver eksperimentelle fil i datasettet. For en omfattende beskrivelse av mulige beregninger se Ref. 22. </li></ol>

<ol>
	<li>Poon, R. Y., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Bagwell, C. B., Muirhead, K. A., Diamond, R. A., DeMaggio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+PKH+Membrane+Intercalating+Dyes+to+Monitor+Cell+Trafficking+and+Function.">Use of PKH Membrane Intercalating Dyes to Monitor Cell Trafficking and Function.</a> Living Color: Flow Cytometry and Cell Sorting Protocols. , 302-352 (2000).</li><li>Wallace, P. K., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Tracking+2007:+A+Proliferation+of+Probes+and+Applications.">Cell Tracking 2007: A Proliferation of Probes and Applications.</a> Immunol. Invest. 36, 527-562 (2007).</li><li>Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+lymphocyte+proliferation,+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data.">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nat. Protoc. 2, 2057-2067 (2007).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat. Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li><li>Bolton, D. L., Minang, J. T., Trivett, M. T., Song, K., Tuscher, J. J., Li, Y., Piatak, M., O'Connor, D., Lifson, J. D., Roederer, M., Ohlen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking,+Persistence,+and+Activation+State+of+Adoptively+Transferred+Allogeneic+and+Autologous+Simian+Immunodeficiency+Virus-Specific+CD8++T+Cell+Clones+during+Acute+and+Chronic+Infection+of+Rhesus+Macaques.">Trafficking, Persistence, and Activation State of Adoptively Transferred Allogeneic and Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones during Acute and Chronic Infection of Rhesus Macaques.</a> J. Immunol. 184, 303-314 (2010).</li><li>Juopperi, T. A., Sharkis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Quiescent+Murine+Hematopoietic+Stem+Cells+by+Homing+Properties.">Isolation of Quiescent Murine Hematopoietic Stem Cells by Homing Properties.</a> Meth. Mol. Biol. 430, 21-30 (2008).</li><li>Kusumbe, A. P., Bapat, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+aneuploid+populations+within+developing+tumors+are+the+major+determinants+of+tumor+dormancy.">Cancer stem cells and aneuploid populations within developing tumors are the major determinants of tumor dormancy.</a> Cancer Res. 69, 9245-9253 (2009).</li><li>Pece, S., Tosonim, D., Confalonieri, S., Mazzarol, G., Vecchi, M., Ronzoni, S., Bernard, L., Viale, G., Pelicci, P. G., Fiore, P. P. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+Molecular+Heterogeneity+of+Breast+Cancers+Correlates+with+Their+Cancer+Stem+Cell+Content.">Biological and Molecular Heterogeneity of Breast Cancers Correlates with Their Cancer Stem Cell Content.</a> Cell. 140, 62-73 (2010).</li><li>Gertner-Dardenne, J., Poupot, M., Gray, B. D., Fourni&#233;, J. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+fluorochrome+trackers+of+membrane+transfers+between+immune+cells.">Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells.</a> Immunol. Invest. 36, 665-685 (2007).</li><li>Bercovici, N., Givan, A. L., Waugh, M. G., Fisher, J. L., Vernel-Pauillac, F., Ernstoff, M. S., Abastado, J. P., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+precursor+analysis+of+T-cell+responses+to+antigen.">Multiparameter precursor analysis of T-cell responses to antigen.</a> J. Immunol. Methods. 276, 5-17 (2003).</li><li>Givan, A. L., Fisher, J. L., Waugh, M. G., Bercovici, N., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cell-tracking+dyes+to+determine+proliferation+precursor+frequencies+of+antigen-specific+T+cells.">Use of cell-tracking dyes to determine proliferation precursor frequencies of antigen-specific T cells.</a> Methods Mol. Biol. 263, 109-124 (2004).</li><li>Schwaab, T., Tretter, C. P., Gibson, J. J., Cole, B. F., Schned, A. R., Harris, R., Fisher, J. L., Crosby, N., Stempkowski, L. M., Heaney, J. A., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-related+immunity+in+prostate+cancer+patients+treated+with+human+recombinant+granulocyte+monocyte-colony+stimulating+factor+(GM-CSF).">Tumor-related immunity in prostate cancer patients treated with human recombinant granulocyte monocyte-colony stimulating factor (GM-CSF).</a> Prostate. 66 (6), 667-674 (2006).</li><li>Bantly, A. D., Gray, B. D., Breslin, E., Weinstein, E. G., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellVue+Claret,+a+New+Far-Red+Dye,+Facilitates+Polychromatic+Assessment+of+Immune+Cell+Proliferation.">CellVue Claret, a New Far-Red Dye, Facilitates Polychromatic Assessment of Immune Cell Proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 581-605 (2007).</li><li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+assay+for+quantitation+of+rare+antigen-specific+T-cells:+using+cell-tracking+dyes+to+calculate+precursor+frequencies+for+proliferation.">A flow cytometric assay for quantitation of rare antigen-specific T-cells: using cell-tracking dyes to calculate precursor frequencies for proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 563-580 (2007).</li><li>Tario, J. D., Gray, B. D., Wallace, S. S., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lipophilic+tracking+dyes+for+monitoring+cell+proliferation.">Novel lipophilic tracking dyes for monitoring cell proliferation.</a> Immunol Invest. 36, 861-885 (2007).</li><li>Wallace, P. K., Tario, J. D., Fisher, J. L., Wallace, S. S., Ernstoff, M. S., , ., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Antigen-Driven+Responses+by+Flow+Cytometry:+Monitoring+Proliferation+by+Dye+Dilution.">Tracking Antigen-Driven Responses by Flow Cytometry: Monitoring Proliferation by Dye Dilution.</a> Cytometry. 73, 1019-1034 (2008).</li><li>Barth, R. J., Fisher, D. A., Wallace, P. K., Channon, J. Y., Noelle, R. L., Gui, J., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Randomized+Trial+of+Ex+vivo+CD40L+Activation+of+a+Dendritic+Cell+Vaccine+in+Colorectal+Cancer+Patients:+Tumor-Specific+Immune+Responses+Are+Associated+with+Improved+Survival.">A Randomized Trial of Ex vivo CD40L Activation of a Dendritic Cell Vaccine in Colorectal Cancer Patients: Tumor-Specific Immune Responses Are Associated with Improved Survival.</a> Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).</li><li>Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Immune+Cell+Proliferation+and+Cytotoxic+Potential+Using+Flow+Cytometry.">Tracking Immune Cell Proliferation and Cytotoxic Potential Using Flow Cytometry.</a> Meth. Mol. Biol. 699, 119-164 (2011).</li><li>Fuse, S., Underwood, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Analysis+of+In+Vivo+CD8++T+Cell+Cytotoxicity+Against+Multiple+Epitopes+using+Multicolor+Flow+Cytometry.">Simultaneous Analysis of In Vivo CD8+ T Cell Cytotoxicity Against Multiple Epitopes using Multicolor Flow Cytometry.</a> Immunol. Invest. 36, 829-845 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Fleck, M., Mackensen, A., Zoso, A., Halbritter, D., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111, 3546-3552 (2008).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+cellular+proliferation+data:+Avoid+the+panglossian.">Interpretation of cellular proliferation data: Avoid the panglossian.</a> Cytometry. 79A, 95-101 (2011).</li><li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+(CFSE)+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation.">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> J. Vis. Exp. (44), e2259 (2010).</li><li>Houlihan, D. D., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Review+of+Clinical+Trials+of+Bone+Marrow+Stem+Cells+in+Liver+Disease.">Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease.</a> Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).</li><li>Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+In+Vitro+Suppressive+Capacity+of+Regulatory.">Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory.</a> T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).</li></ol>

K. Humphrey, JD Tario, Jr og PK Wallace har fått pre-kommersielle celle sporing reagenser for evaluering fra Life Technologies, Inc. og BD Biosciences. AD Bantly og JS Moore har fått pre-kommersielle celle sporing reagenser for evaluering fra Life Technologies, Inc. og finansiering fra PTI Research, Inc. for pre-kommersiell karakterisering av ulike CellVue celle sporing fargestoffer. K. Muirhead er ansatt SciGro, Inc., som tilbyr konsulenttjenester til Phanos Technologies, Inc. (eier av PKH og CellVue fargestoffer) og gir backup teknisk støtte for Sigma-Aldrich og molekylær Målretting Technologies, Inc. (distributører av disse fargestoffer). Produksjon og fri tilgang til denne artikkelen er sponset av Sigma-Aldrich.

Metodene beskrevet her er de som finnes i våre kombinerte laboratorier til mest pålitelig gi optimale resultater for hPBMC merking med membran fargestoffer 13,16,18 og for lymfocytt subset fenotyping og spredning sporing ved hjelp av enten membran eller protein fargestoffer 2,11,13,16, 18 år. Som illustrert i figur 1 og 2, er lyse ensartet merking lettest oppnås ved å begrense tilstedeværelsen av fysiologiske salter og ved hjelp av en blanding teknikk som fører til hurtig, homogen eksponering av alle celler til samme konsentrasjon av fargestoff. Fordi farging med membran fargestoffer skjer ved partisjonering i lipid bilayer, kan andre variabler som endrer gratis dye konsentrasjon også påvirke merking effektivitet. For eksempel, merking i rundbunnet polystyren rør resulterer i mindre effektiv utvasking av salter før resuspensjon i Diluent C og også i redusert fri fargestoff konsentrasjon på grunn til fargebad adsorpsjon på rørvegger, særligved lavere fargestoff konsentrasjoner. Begge faktorer har en tendens til å gi flekker bredere fordelinger enn når merking er gjort ved hjelp av konisk bunn polypropylenrør (figurene 3, 4 og upubliserte resultater). Sample alder og type kan også påvirke toppbredden selv når optimaliserte flekker prosedyrer brukes. For eksempel CV for PKH26 pos lymfocytter isolert fra ferske trukket blod varierer fra 14-20% (figur 3, Ref. 13 og upubliserte resultater), mens CV for lymfocytter isolert fra 24 timers gamle blodprøver eller TRIMA pheresis filtre utvalg 25-30 % (figur 4 og Ref. 18). Flekker ensartethet og i hvilken grad ikke-levedyktige celler kan utelukkes fra analyse både påvirke om skjelnes datter toppene er tydelig i fargestoff fortynning profilen, som i sin tur påvirker valg av en spredning modell å passe de observerte data (figur 5 og 6 </strong&gt;). Selv ModFit (Verity Software House, Topsham, ME) brukes her som et eksempel på programvare som brukes til å generere beregninger som Proliferation Index og Precursor Frequency (figur 3, 5 og 6, Tabell 3), andre programvarepakker også inneholde moduler for å analysere spredning data. Disse inkluderer FCSExpress (De Novo Software, Los Angeles, CA) og FlowJo (Tre Star, Inc., Ashland, OR). Alle disse programmene bruker en ikke-lineær minste kvadraters analyse for å iterativt finne den best passer til rådata ved å endre posisjon, høyde og SD (eller bredde) Gaussian topper representerer sekvensielle datter generasjoner. Proliferativ Indeks (PI) og Precursor Frekvens (PF) er de mest brukte tiltak av omfanget av spredning. PI, som definert av ModFit, er et mål på økningen i celletall løpet av analysen, analogt med det &#39;stimulering indeks&#39; av en tymidin opptak assay. PF returnerer brøkdel av celler i den innledende population som svarte på stimulans ved proliferating. Forsiktighet anbefales, men når du leser litteratur siden terminologi varierer noe mellom programvarepakker (f.eks FlowJo og ModFit bruker forskjellige definisjoner og beregninger for hva som menes med &quot;Proliferation Index&quot;) 22. De kritiske spørsmålene diskutert her for merking og spredning analyse med membran fargestoffer er også oppstått ved bruk protein fargestoffer. For eksempel, må spesiell oppmerksomhet for blandeteknikk også observeres, sammen med uttrekk av døde / døende celler, for å oppnå ensartede distribusjoner og skjelnes datter topper ved bruk CFSE (figur 6) 2-4,13,18,24. Riktig valg av fluorokromer for fenotyping og levedyktighet vurdering er også viktig å unngå overdreven spektral overlapping og manglende evne til å gjenkjenne antistoff positive celler, særlig med synlige utslipp protein fargestoffer som CFSE 2-4,11,13,16,18 </sup&gt;. Redusere konsentrasjonen av sporing fargestoff senker kompensasjon problemer i tilstøtende spektrale kanaler, men også begrenser antall celledelinger som kan overvåkes før dattercelle intensiteter begynner å overlappe med autofluorescens. Alternativt, bruk av nyere celle sporing fargestoffer som langt røde emitting CellVue Claret (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) eller fiolett emitting CellTrace Violet (Life Technologies, Grand Island, NY), kan redusere kompensasjon problemer (figur 6). Til slutt, selv membran fargestoffer generelt en tendens til å utvise mindre toksisitet 11,26, er det mulig å over-label celler med enten klasse av fargestoff. Det er derfor alltid nødvendig å verifisere at konsentrasjonen av sporing fargestoff som brukes ikke har endret funksjonaliteten av cellene som skal spores (figur 6) 3,13,16,18.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens eller utstyr </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Kommersielt Kjøpt </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9400 </td><td></td></tr><tr><td> Bovint serumalbumin (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> Føtalt bovint serum (FBS) </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks balanserte saltløsning (HBSS) </td><td> Life Technologies </td><td> 14175-079 </td><td> Kalsium og magnesium gratis, uten fenolrødt </td></tr><tr><td> Humant IgG Cohn fraksjon II og III globuliner </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-4386 </td><td></td></tr><tr><td> Mus-anti-humant CD3-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td> Mette konsentrasjon som bestemmes av laboratoriet titrering </td></tr><tr><td> Mouse anti-menneskelige CD4-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340672 </td><td> Mette konsentrasjon som bestemmes av laboratoriet titrering </td></tr><tr><td> Mus anti-menneskelige CD4-PECy7 </td><td> BD Biosciences </td><td> 348799 </td><td> Mette konsentrasjon som bestemmes av laboratoriet titrering </td></tr><tr><td> Mus-anti-humant CD8-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 347313 </td><td> Mette konsentrasjon som bestemmes av laboratoriet titrering </td></tr><tr><td> Mus anti-human CD8-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD0805 </td><td> Mette konsentrasjon som bestemmes av laboratoriet titrering </td></tr><tr><td> Mus anti-human CD19-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD1905 </td><td&gt; gjennomtrekking konsentrasjon som bestemmes av laboratoriet titrering </td></tr><tr><td> Mus anti-human CD25-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340938 </td><td> Mette konsentrasjon som bestemmes av laboratoriet titrering </td></tr><tr><td> Mus anti-human CD127-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 557938 </td><td> Mette konsentrasjon som bestemmes av laboratoriet titrering </td></tr><tr><td> Mus anti-human CD3 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0037-85 </td><td> 1,0 mg / ml; azid gratis </td></tr><tr><td> Mus anti-humant CD28 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0289-85 </td><td> 1,0 mg / ml; azid gratis </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300-058 </td><td></td></tr><tr><td> PKH26 røde fluoriserende celle linker kit som inneholder 10-3M PKH26 i EtOH og Diluent C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> PKH26GL-1KT eller MINI26-1KT </td><td> Prosedyrer i Trinn 1 gjelder ogsåtil utstyr som inneholder PKH67 eller andre CellVue fargestoffer </td></tr><tr><td> CellVue Claret langt røde fluoriserende celle linker kit som inneholder 10-3M CellVue Claret i EtOH og Diluent C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MINCLARET-1KT eller MIDCLARET-1KT </td><td></td></tr><tr><td> 5 - (og-6)-karboksyfluorescein diacetat, succinimidyl-ester (CFDA-SE) </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> C34554 </td><td> Ikke-fluoriserende, kløyvde ved membran esteraser å danne fluorescerende amino-reaktivt karboksyfluorescens succinimidyl ester (CFSE) </td></tr><tr><td> LIVE / DEAD Fixable Violet </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> L34955 </td><td></td></tr><tr><td> Steril 12 x 75 mm konisk polypropylenrør og luer </td><td> VWR </td><td> 60818-102 </td><td> Gir bedre membran fargestoff flekker effektivitet (redusert fargestoff adsorpsjon, mindre celle tap under supernatant aspirasjon) </td></tr><tr><td> 12 x 75 mm round bunn polystyren rør </td><td> Becton Dickinson </td><td> 21008-936 </td><td></td></tr><tr><td> Flowcytometer </td><td> BD Biovitenskap </td><td> FACSCalibur LSRFortessa </td><td> Hvilkensomhelst cytometeret stand til å oppdage FITC, PKH26, og 7-AAD (ex. 488 nm;. Em 520 nm, 567 nm, og 655 nm, henholdsvis) og APC ex. 633-640 nm; EM. 660 nm) </td></tr><tr><td> Flowcytometer </td><td> Beckman Coulter </td><td> LSRII CYAN </td><td> Hvilkensomhelst cytometeret stand til å oppdage FITC, PKH26, og 7-AAD (ex. 488 nm;. Em 520 nm, 567 nm, og 655 nm, henholdsvis) og APC ex. 633-640 nm; EM. 660 nm) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Laboratory Forberedt </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, konsentrert lager </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 1 mg / ml i PBS. Fryse i alikvoter og oppbevar ved -20 ° C. </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, working lager </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 100 ug / ml i PBS, forbered daglig fra 1 mg / ml frossen lager. </td></tr><tr><td> IgG blokk </td><td> NA </td><td> NA </td><td> HBSS + 10 mg / ml human IgG Cohn fraksjon II og III globuliner + 10 mg / ml BSA. </td></tr></tbody></table>

optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes

Fluorescerende celle sporing fargestoffer i kombinasjon med flyt og bilde cytometri, er kraftige verktøy som brukes til å studere samspillet og skjebnene til forskjellige celletyper in vitro og in vivo. 1-5 Selv om det finnes tusenvis av publikasjoner som bruker slike fargestoffer, noen av de mest vanlig forekommende celle sporing søknader omfatte overvåking av: <ol><li> stilk og stamceller quiescence, spredning og / eller differensiering 6-8 </li><li> antigen-drevet membran transfer 9 og / eller forløperen celleproliferasjon 3,4,10-18 og </li><li> immune regulatoriske og effektor celle funksjon 1,18-21. </li></ol> Kommersielt tilgjengelige celle sporing fargestoffer varierer mye i sine kjemi og fluorescens egenskaper, men det store flertallet faller inn under en av to klasser basert på deres mekanisme celle merking. &quot;Membran fargestoffer&quot;, preget av PKH26, er svært lipofile fargestoffer that partisjon stabilt, men ikke-kovalent til cellemembraner 1,2,11. &quot;Protein fargestoffer&quot;, preget av CFSE, er amino-reaktive fargestoffer som danner stabile kovalente bindinger med celle proteiner 4,16,18. Hver klasse har sine egne fordeler og begrensninger. Nøkkelen til deres suksess bruk, særlig i flerfarget studier der flere fargestoffer brukes til å spore ulike celletyper, er derfor å forstå de kritiske spørsmålene som muliggjør optimal bruk av hver klasse 2-4,16,18,24. Protokollene inkludert her trekke fram tre vanlige årsaker til dårlig eller variabel resultater ved bruk av celle-sporing fargestoffer. Disse er: <ol><li> Unnlatelse av å oppnå lyse, uniform, reproduserbar merking. Dette er et nødvendig utgangspunkt for enhver celle sporing studien, men krever oppmerksomhet til ulike variabler ved bruk membran fargestoffer enn ved bruk protein fargestoffer eller likevekt bindende reagenser som antistoffer. </li><li> Suboptimale fluorokrom kombinasjoner ennd / eller unnlate å inkludere kritiske kompensasjon kontroller. Sporing fargestoff fluorescens er typisk 10 februar til 10 mars ganger sterkere enn antistoff fluorescens. Det er derfor essensielt å verifisere at tilstedeværelsen av sporing fargestoff ikke kompromittere evnen til å oppdage andre prober som brukes. </li><li> Unnlatelse av å få en god passform med topp modellering programvare. Slik programvare kan kvantitativ sammenligning av proliferativ respons på tvers av ulike populasjoner eller stimuli basert på forløperen frekvens eller andre beregninger. Innhenting av en god passform, krever imidlertid utelukkelse av døde / døende celler som kan forvrenge fargestoff fortynning profiler og matchende av forutsetningene modellen med egenskapene den observerte fargestoff fortynning profil. </li></ol> Eksemplene gitt her illustrerer hvordan disse variablene kan påvirke resultatene ved bruk membran og / eller protein fargestoffer å overvåke celleproliferasjon.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes at JoVE.com

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Vellykket bruk av celle sporing fargestoffer for å overvåke immun celle funksjon og spredning involverer flere kritiske trinn. Vi beskriver metoder for: 1) å skaffe lys, jevn, reproduserbar etikett-ing med membran fargestoffer, 2) å velge fluorokromer og datainnhenting betingelser, og 3) velger modell å kvantifisere celleproliferasjon basert på fargestoff fortynning.

Optimalisert flekker og spredning modellering Metoder for Celledeling Overvåking hjelp Cell Tracking Fargestoffer

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Cell sporing ved hjelp av Photoconvertible Proteiner Under Sebrafisk Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

In Vivo Modeling av Morbid Human Genome hjelp Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Histochemical Farging av<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sekundær Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Metoder for Skin såre og Analyser for Wound Responses i<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Temporal Sporing av cellecyklusprogresjonen Bruke flowcytometrisystemer uten behov for synkronisering

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Sammenligning av tre forskjellige metoder for bestemmelse Cell Proliferation i brystkreftcellelinjer

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...