Name: optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes
Uploaded: 2012-12-13T12:00:00
Duration: 22 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes at JoVE.com

The authors would particularly like to thank the following individuals for their technical and intellectual contributions to the development of these methods through the years: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nad&egrave;ge Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis Cell Science and PTI Research), Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice Givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc.), and Mary Waugh (Dartmouth Medical School). They would also like to thank the Bowdoin class of 2006 from the Annual Courses in Research Methods and Applications of Flow Cytometry, which generated the data shown in Figure 2.
Flow cytometry was performed at Roswell Park Cancer Institute's Flow Cytometry Laboratory, which was established in part by equipment grants from the NIH Shared Instrument Program, and receives support from the Core Grant (5 P30 CA016056-29) from the National Cancer Institute to the Roswell Park Cancer Institute, and at the Abramson Cancer Center Flow Cytometry and Cell Sorting Resource Laboratory of the University of Pennsylvania, which was established in part by equipment grants from the NIH Shared Instrument Program, and receives support from NIH #2P30 CA016520 from the National Cancer Institute. The work shown in Figures 3 and 5 was also supported in part by SBIR grant EB00228 from the National Institutes of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) awarded to PTI Research, Inc.

<ol>
	<li>Poon, R. Y., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Bagwell, C. B., Muirhead, K. A., Diamond, R. A., DeMaggio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+PKH+Membrane+Intercalating+Dyes+to+Monitor+Cell+Trafficking+and+Function.">Use of PKH Membrane Intercalating Dyes to Monitor Cell Trafficking and Function.</a> Living Color: Flow Cytometry and Cell Sorting Protocols. , 302-352 (2000).</li><li>Wallace, P. K., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Tracking+2007:+A+Proliferation+of+Probes+and+Applications.">Cell Tracking 2007: A Proliferation of Probes and Applications.</a> Immunol. Invest. 36, 527-562 (2007).</li><li>Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+lymphocyte+proliferation,+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data.">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nat. Protoc. 2, 2057-2067 (2007).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat. Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li><li>Bolton, D. L., Minang, J. T., Trivett, M. T., Song, K., Tuscher, J. J., Li, Y., Piatak, M., O'Connor, D., Lifson, J. D., Roederer, M., Ohlen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking,+Persistence,+and+Activation+State+of+Adoptively+Transferred+Allogeneic+and+Autologous+Simian+Immunodeficiency+Virus-Specific+CD8++T+Cell+Clones+during+Acute+and+Chronic+Infection+of+Rhesus+Macaques.">Trafficking, Persistence, and Activation State of Adoptively Transferred Allogeneic and Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones during Acute and Chronic Infection of Rhesus Macaques.</a> J. Immunol. 184, 303-314 (2010).</li><li>Juopperi, T. A., Sharkis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Quiescent+Murine+Hematopoietic+Stem+Cells+by+Homing+Properties.">Isolation of Quiescent Murine Hematopoietic Stem Cells by Homing Properties.</a> Meth. Mol. Biol. 430, 21-30 (2008).</li><li>Kusumbe, A. P., Bapat, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+aneuploid+populations+within+developing+tumors+are+the+major+determinants+of+tumor+dormancy.">Cancer stem cells and aneuploid populations within developing tumors are the major determinants of tumor dormancy.</a> Cancer Res. 69, 9245-9253 (2009).</li><li>Pece, S., Tosonim, D., Confalonieri, S., Mazzarol, G., Vecchi, M., Ronzoni, S., Bernard, L., Viale, G., Pelicci, P. G., Fiore, P. P. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+Molecular+Heterogeneity+of+Breast+Cancers+Correlates+with+Their+Cancer+Stem+Cell+Content.">Biological and Molecular Heterogeneity of Breast Cancers Correlates with Their Cancer Stem Cell Content.</a> Cell. 140, 62-73 (2010).</li><li>Gertner-Dardenne, J., Poupot, M., Gray, B. D., Fourni&#233;, J. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+fluorochrome+trackers+of+membrane+transfers+between+immune+cells.">Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells.</a> Immunol. Invest. 36, 665-685 (2007).</li><li>Bercovici, N., Givan, A. L., Waugh, M. G., Fisher, J. L., Vernel-Pauillac, F., Ernstoff, M. S., Abastado, J. P., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+precursor+analysis+of+T-cell+responses+to+antigen.">Multiparameter precursor analysis of T-cell responses to antigen.</a> J. Immunol. Methods. 276, 5-17 (2003).</li><li>Givan, A. L., Fisher, J. L., Waugh, M. G., Bercovici, N., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cell-tracking+dyes+to+determine+proliferation+precursor+frequencies+of+antigen-specific+T+cells.">Use of cell-tracking dyes to determine proliferation precursor frequencies of antigen-specific T cells.</a> Methods Mol. Biol. 263, 109-124 (2004).</li><li>Schwaab, T., Tretter, C. P., Gibson, J. J., Cole, B. F., Schned, A. R., Harris, R., Fisher, J. L., Crosby, N., Stempkowski, L. M., Heaney, J. A., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-related+immunity+in+prostate+cancer+patients+treated+with+human+recombinant+granulocyte+monocyte-colony+stimulating+factor+(GM-CSF).">Tumor-related immunity in prostate cancer patients treated with human recombinant granulocyte monocyte-colony stimulating factor (GM-CSF).</a> Prostate. 66 (6), 667-674 (2006).</li><li>Bantly, A. D., Gray, B. D., Breslin, E., Weinstein, E. G., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellVue+Claret,+a+New+Far-Red+Dye,+Facilitates+Polychromatic+Assessment+of+Immune+Cell+Proliferation.">CellVue Claret, a New Far-Red Dye, Facilitates Polychromatic Assessment of Immune Cell Proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 581-605 (2007).</li><li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+assay+for+quantitation+of+rare+antigen-specific+T-cells:+using+cell-tracking+dyes+to+calculate+precursor+frequencies+for+proliferation.">A flow cytometric assay for quantitation of rare antigen-specific T-cells: using cell-tracking dyes to calculate precursor frequencies for proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 563-580 (2007).</li><li>Tario, J. D., Gray, B. D., Wallace, S. S., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lipophilic+tracking+dyes+for+monitoring+cell+proliferation.">Novel lipophilic tracking dyes for monitoring cell proliferation.</a> Immunol Invest. 36, 861-885 (2007).</li><li>Wallace, P. K., Tario, J. D., Fisher, J. L., Wallace, S. S., Ernstoff, M. S., , ., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Antigen-Driven+Responses+by+Flow+Cytometry:+Monitoring+Proliferation+by+Dye+Dilution.">Tracking Antigen-Driven Responses by Flow Cytometry: Monitoring Proliferation by Dye Dilution.</a> Cytometry. 73, 1019-1034 (2008).</li><li>Barth, R. J., Fisher, D. A., Wallace, P. K., Channon, J. Y., Noelle, R. L., Gui, J., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Randomized+Trial+of+Ex+vivo+CD40L+Activation+of+a+Dendritic+Cell+Vaccine+in+Colorectal+Cancer+Patients:+Tumor-Specific+Immune+Responses+Are+Associated+with+Improved+Survival.">A Randomized Trial of Ex vivo CD40L Activation of a Dendritic Cell Vaccine in Colorectal Cancer Patients: Tumor-Specific Immune Responses Are Associated with Improved Survival.</a> Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).</li><li>Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Immune+Cell+Proliferation+and+Cytotoxic+Potential+Using+Flow+Cytometry.">Tracking Immune Cell Proliferation and Cytotoxic Potential Using Flow Cytometry.</a> Meth. Mol. Biol. 699, 119-164 (2011).</li><li>Fuse, S., Underwood, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Analysis+of+In+Vivo+CD8++T+Cell+Cytotoxicity+Against+Multiple+Epitopes+using+Multicolor+Flow+Cytometry.">Simultaneous Analysis of In Vivo CD8+ T Cell Cytotoxicity Against Multiple Epitopes using Multicolor Flow Cytometry.</a> Immunol. Invest. 36, 829-845 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Fleck, M., Mackensen, A., Zoso, A., Halbritter, D., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111, 3546-3552 (2008).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+cellular+proliferation+data:+Avoid+the+panglossian.">Interpretation of cellular proliferation data: Avoid the panglossian.</a> Cytometry. 79A, 95-101 (2011).</li><li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+(CFSE)+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation.">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> J. Vis. Exp. (44), e2259 (2010).</li><li>Houlihan, D. D., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Review+of+Clinical+Trials+of+Bone+Marrow+Stem+Cells+in+Liver+Disease.">Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease.</a> Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).</li><li>Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+In+Vitro+Suppressive+Capacity+of+Regulatory.">Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory.</a> T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).</li></ol>

К. Хамфри, JD Tario, младший и К. Уоллес получил предварительные коммерческие ячейки отслеживания реагентов для оценки от Life Technologies, Inc и BD Biosciences. AD Bantly и JS Мур получил предварительные коммерческие ячейки отслеживания реагентов для оценки от Life Technologies, Inc и финансирование из PTI Research, Inc для предварительного коммерческих характеристик различных клеточных CellVue отслеживания красителей. К. Muirhead работает на SciGro, Inc, которая оказывает консалтинговые услуги Phanos Technologies, Inc (владелец PKH и CellVue красители) и обеспечивает резервное копирование технической поддержки для Sigma-Aldrich и молекулярной Ориентация Technologies, Inc (дистрибьюторов этих красители). Производство и свободный доступ к этой статье проводится при финансовой поддержке Sigma-Aldrich.

Методы, описанные здесь, которые содержатся в наших совместных лабораторий наиболее надежно дать оптимальные результаты для hPBMC маркировки с помощью мембранных красителей 13,16,18 и лимфоцитов фенотипирование подмножества и распространение слежения с использованием либо мембранных белков или красители 2,11,13,16, 18. Как показано на рисунках 1 и 2, яркое равномерное маркировки легче всего достигается путем ограничения наличии физиологической соли и с помощью смешивания техники, что приводит к быстрому, однородные воздействия всех клеток в той же концентрации красителя. Потому что окрашивание мембраны красителей происходит путем разделения в липидный бислой, другие переменные, которые изменяют свободный концентрации красителя может также повлиять на маркировке эффективности. Например, маркировка в круглое дно полистирола труб приводит к менее эффективной вымывания солей до ресуспендирования в Разбавитель С, а также к снижению концентрации красителя бесплатно за счет красить адсорбции на стенках труб, в частности,при более низких концентрациях красителя. Оба эти фактора, как правило, дают широкие окрашивания распределения, чем когда маркировка осуществляется с помощью коническим днищем полипропиленовые трубы (рис. 3, 4 и неопубликованные результаты). Возраст образцов и типов также могут влиять на ширину пика даже при оптимизированной процедуры окрашивания используются. Например, резюме для PKH26 лимфоцитов поз изолированы от свеженарисованного крови колеблется от 14-20% (рис. 3, Ref. 13 и неопубликованные результаты), тогда как резюме для лимфоциты изолированы от 24 час старых образцов крови или TRIMA pheresis фильтров в диапазоне от 25-30 % (рис. 4 и Ref. 18). Окрашивание однородность и степень, в которой нежизнеспособные клетки могут быть исключены из анализа как повлияет ли различимые пики дочь проявляются в профиль разведения красителя, который, в свою очередь, влияет на выбор модели распространения в соответствии с наблюдаемыми данными (рис. 5 и 6 </strong&gt;). Хотя ModFit (Verity Software House, Topsham, ME) используется здесь в качестве примера программного обеспечения, используемого для создания таких показателей, как индекс пролиферации и прекурсоров частоты (рис. 3, 5 и 6; таблица 3), другие программные пакеты также содержат модули для анализа Распространение данных. К ним относятся FCSExpress (De Novo программного обеспечения, Лос-Анджелес, Калифорния) и FlowJo (Tree Star, Inc, Ashland, OR). Все эти программы используют нелинейных наименьших квадратов анализ итеративно найти наиболее подходящий к необработанным данным, меняя положение, высоту и SD (или ширина) гауссовых пиков представляющие последовательные поколения дочь. Пролиферативный индекс (PI) и Предтечи частоты (PF) являются наиболее часто используемыми мерами степень распространения. PI, как это определено ModFit, является мерой увеличение количества клеток в течение анализа, аналогичного «индекс стимуляции &#39;из анализа поглощения тимидина. PF возвращает фракции клеток в начальной заселенияион, который ответил на стимула растет. Рекомендуется осторожность, однако, при чтении литературы, начиная с терминологии несколько различается среди программных пакетов (например, FlowJo и ModFit используют разные определения и расчеты для того, что имеется в виду под &quot;распространением Index&quot;) 22. Важнейшие вопросы обсуждаются здесь для маркировки и распространения анализ с мембраной красителей встречаются также при использовании белка красителей. Например, особое внимание на технику смешивания также необходимо соблюдать, наряду с исключением мертвых / отмирающих клеток, для получения равномерного распределения и различимых пиков дочь при использовании CFSE (рис. 6) 2-4,13,18,24. Соответствующий выбор флуорохромы для фенотипирования и жизнеспособности оценка также важна, чтобы избежать чрезмерного спектрального перекрытия и неспособность признать антитела положительных клеток, в частности, с видимым излучающих белка красители, такие как CFSE 2-4,11,13,16,18 </sup&gt;. Снижение концентрации красителя уменьшается отслеживания компенсации проблем в соседних спектральных каналов, но также ограничивает число клеточных делений, которые могут быть проверены, прежде чем интенсивность дочерние клетки начинают перекрываться с автофлуоресценции. Кроме того, использование новой ячейки отслеживания красители, такие как далеко красный бордовый излучающих CellVue (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) или фиолетовый излучающих CellTrace Violet (Life Technologies, Grand Island, NY) может уменьшить компенсацию задач (рис. 6). Наконец, хотя мембрана красители обычно склонны проявлять меньшую токсичность 11,26, можно более-метки клетки либо с классом красителя. Поэтому всегда необходимо убедиться, что концентрация отслеживания красителя не изменило функциональные клетки, которые необходимо отслеживать (рис. 6) 3,13,16,18.

<table border="1"><tbody><tr><td> Реагенты и оборудование </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Купленных </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9400 </td><td></td></tr><tr><td> Бычий сывороточный альбумин (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> Эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) </td><td> Атланта биологические </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> Хэнкс сбалансированный солевой раствор (HBSS) </td><td> Life Technologies </td><td> 14175-079 </td><td> Кальций и магний бесплатно, без фенола красного </td></tr><tr><td> IgG человека Кон фракция II и III глобулины </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-4386 </td><td></td></tr><tr><td> Мышь анти-человеческим CD3-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td> Насыщение концентрации, как это определено лабораторией титрования </td></tr><tr><td> Мышь анти-CD4 человека и АПК </td><td> BD Biosciences </td><td> 340672 </td><td> Насыщение концентрации, как это определено лабораторией титрования </td></tr><tr><td> Мышь анти-человеческий CD4-PECy7 </td><td> BD Biosciences </td><td> 348799 </td><td> Насыщение концентрации, как это определено лабораторией титрования </td></tr><tr><td> Мышь анти-человеческие CD8-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 347313 </td><td> Насыщение концентрации, как это определено лабораторией титрования </td></tr><tr><td> Мышь анти-человеческие CD8-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD0805 </td><td> Насыщение концентрации, как это определено лабораторией титрования </td></tr><tr><td> Мышь анти-человеческим CD19-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD1905 </td><tD&gt; Saturating концентрации, как это определено лабораторией титрования </td></tr><tr><td> Мышь анти-человеческим CD25-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340938 </td><td> Насыщение концентрации, как это определено лабораторией титрования </td></tr><tr><td> Мышь анти-человеческий CD127-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 557938 </td><td> Насыщение концентрации, как это определено лабораторией титрования </td></tr><tr><td> Мышь анти-CD3 человека </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0037-85 </td><td> 1,0 мг / мл; азид бесплатно </td></tr><tr><td> Мышь анти-CD28 человека </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0289-85 </td><td> 1,0 мг / мл; азид бесплатно </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300-058 </td><td></td></tr><tr><td> PKH26 красного флуоресцентного комплекта линкера ячейку, содержащую 10-3М PKH26 в этаноле и разведения C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> PKH26GL-1KT или MINI26-1KT </td><td> Процедуры в шаге 1 также применяютсяв наборы, содержащие PKH67 или другими красителями CellVue </td></tr><tr><td> CellVue Claret дальнего красного флуоресцентного комплекта линкера ячейку, содержащую 10-3М CellVue Claret в этаноле и разведения C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MINCLARET-1KT или MIDCLARET-1KT </td><td></td></tr><tr><td> 5 - (а-6)-карбоксифлуоресцеина диацетат, сукцинимидил эфира (CFDA-SE) </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> C34554 </td><td> Non-флуоресцентный; расщепляется мембраны эстераз с образованием флуоресцентного амино-реактивного карбоксифлуоресцеина сукцинимидил эфира (CFSE) </td></tr><tr><td> LIVE / DEAD поправимо Фиолетовый </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> L34955 </td><td></td></tr><tr><td> Стерильные 12 х 75 мм конической полипропиленовые трубы и крышки </td><td> VWR </td><td> 60818-102 </td><td> Дает лучше мембраны красителя окрашивание эффективности (снижение красителя адсорбции; меньше потери клеток в супернатант аспирация) </td></tr><tr><td> 12 х 75 мм Rounг нижний полистирол труб </td><td> Becton Dickinson </td><td> 21008-936 </td><td></td></tr><tr><td> Проточный цитометр </td><td> BD Bioscience </td><td> FACSCalibur LSRFortessa </td><td> Любой цитометр в состоянии обнаружить FITC, PKH26, и 7-AAD (например, 488 нм;. EM 520 нм, 567 нм и 655 нм, соответственно) и APC отл. 633-640 нм; их. 660 нм) </td></tr><tr><td> Проточный цитометр </td><td> Beckman Coulter </td><td> LSRII CyAn </td><td> Любой цитометр в состоянии обнаружить FITC, PKH26, и 7-AAD (например, 488 нм;. EM 520 нм, 567 нм и 655 нм, соответственно) и APC отл. 633-640 нм; их. 660 нм) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Лаборатория Подготовлено </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, концентрированной складе </td><td> Не Доступно </td><td> Не Доступно </td><td> 1 мг / мл в PBS. Заморозить в аликвоты и хранят при температуре -20 ° C. </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, пристаЦарь складе </td><td> Не Доступно </td><td> Не Доступно </td><td> 100 мкг / мл в PBS; подготовить ежедневно с 1 мг / мл замороженного запаса. </td></tr><tr><td> IgG блок </td><td> Не Доступно </td><td> Не Доступно </td><td> HBSS + 10 мг / мл человеческого IgG фракции Кона II и III глобулинов + 10 мг / мл BSA. </td></tr></tbody></table>

optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes at JoVE.com

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Успешное использование красителей клетки слежения для мониторинга иммунной функции и пролиферации клеток включает в себя несколько важных этапов. Мы опишем методы: 1) получение яркого, равномерного, воспроизводимые этикетки-ния с мембранными красители, 2) выбрать флуорохромы и условий сбора данных и 3) выбор модели для количественной пролиферации клеток на основе красителя разбавлением.

Оптимизирован Окрашивание и распространения методов моделирования для деления клеток Мониторинг использования красителей сотовых слежения

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Селективный маркировки на поверхности клеток белков, используя CyDye ПГЛП Fluor Минимальная Красители

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Живая Препарирование Drosophila Эмбрионы: Упрощенная методы скрининга Мутант Коллекции антител Окрашивание

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Определение сотовый номер при использовании культуры клеток Счетчик скипетр сотовый

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Мониторинг динамических изменений в митохондриальной уровня кальция во время апоптоза Использование генетически закодированные Кальций датчика

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Сотовые слежения Использование Photoconvertible белков в процессе развития данио рерио

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

In Vivo Моделирование Morbid геноме человека Данио рерио использованием

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Гистохимический Окрашивание<em&gt; Арабидопсис</em&gt; Вторичный клеточной стенки Элементы

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Методы для кожи телесные повреждения и анализы для заживления ответы в<em&gt; C. Элеганс</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Временная Отслеживание клеточного цикла прогрессии Использование проточной цитометрии без необходимости синхронизации

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Сравнение трех различных методов для определения пролиферации клеток рака молочной железы в клеточных линиях

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...