Name: optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes
Uploaded: 2012-12-13T12:00:00
Duration: 22 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes at JoVE.com

Författarna vill särskilt tacka följande personer för deras tekniska och intellektuella bidrag till utvecklingen av dessa metoder genom åren: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nadège Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis Cell Science och PTI forskning) , Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice Givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc.), och Mary Waugh (Dartmouth Medical School). De skulle också vilja tacka Bowdoin klassen 2006 från den årliga kurser i forskningsmetoder och tillämpningar av flödescytometri, vilket genererade de data som visas i figur 2. Flödescytometri utfördes vid Roswell Park Cancer Institute: s flödescytometri Laboratory, som grundades delvis av utrustning anslag från NIH Delad Instrument Program och får stöd från Core Grant (5 P30 CA016056-29) från NationalCancer Institute i Roswell Park Cancer Institute, och vid Abramson Cancer Center flödescytometri och cellsortering Resource Laboratory vid University of Pennsylvania, som grundades delvis av utrustning anslag från NIH Delad Instrument Program och får stöd från NIH # 2P30 CA016520 från National Cancer Institute. Arbetet som visas i figur 3 och 5 fick också stöd delvis av SBIR bidrag EB00228 från National Institutes of Biomedical Imaging och bioteknik (NIBIB) tilldelas PTI Research, Inc.

1. Allmän Membran märkning med PKH26 Cell Tracking Dye (ref. 25, figur 1) <ol><li> Använd steril teknik för steg från 1,1 till 1,9. Förbered ~ 10 7 humana perifera mononukleära blodceller eller lymfocyter (hPBMC, HPBL) använder laboratoriets standardmetoden med tillsats av en slutlig 300 xg centrifugering för att minimera kontamination blodplättar. Resuspendera celler vid 10 7 / ml i HBSS +1% BSA och plats på is, reservera en 500 pl alikvot (5x10 6 celler) för användning i steg 2. </li><li> Placera 5x10 6 celler (500 pl) i en 12 x 75 mm koniskt polypropenrör. Tvätta en gång med 3,5 ml HBSS. Försiktigt aspirera supernatanten och lämnar inte mer än 15-25 il resterande vätska, men se till att inte ta bort celler. Använd detta rör för att framställa en 2x cellsuspension i steg 1,4. </li><li> Under cellen tvätt i steg 1,2, tillsätt 0,5 ml diluent C-märkning fordon (från PKH26GL satsen) till ett 12 x 75 mm koniskt polypropenrör. Använd detta rör prepär en 2x PKH26 lösning i steg 1,5. </li><li> Tillsätt 0,5 ml utspädningsmedel C-märkning fordon till den tvättade cellpelleten från steg 1,2 och aspirera och dispensera 3-4 gånger för att erhålla en enkelcellsuspension (2x celler). Undvik bubbelbildning och överdriven blandning, vilket kan minska cellviabiliteten och återhämtning. </li><li> Omedelbart efter beredning av 2x cellsuspensionen i steg 1,4, förbereda en 2x (4 pM) färgämneslösningen genom att tillsätta 2,0 | il av 1,0 mM PKH26 färgämne lager i etanol (från PKH26GL satsen) till diluent C-röret som framställts i Steg 1,3 och skaka till dispergera jämnt. </li><li> Omedelbart efter beredning av 2x färgämneslösningen i steg 1,5, snabbt Pipettera 2x cellsuspensionen från steg 1,4 till 2x färglösningen och samtidigt aspirera och dispensera 3-4 gånger för att helt skingra celler i färg Gör inte:. Tillsätt 1,0 mM färgen direkt celler, häll 2x celler till 2x färg, eller lägga 2x celler till 2x färg under virvling. Eftersom färgning är nästan ögonblicklig, sådana metoder ger mindreenhetliga stödnivåer än den rekommenderade metoden (figur 2). </li><li> Efter 1 minut, tillsätt 1,0 ml värmeinaktiverat serum eller HBSS +5% BSA för att stoppa färgämnesupptagning i cellmembranen. Underlåtenhet att använda tillräckligt med protein riskerar bildande av färgämnet aggregat, som kan pelleten med celler under tvättningsstegen och orsaka oavsedd märkning av andra celler närvarande i ett experiment. Om mediet med 10% värmeinaktiverat serum (CM) eller HBSS +1% BSA skall användas som stoppreagens, utför färgning i en 15 ml koniskt polypropylenrör och lägga till minst 5,0 ml stoppreagens för att säkerställa adsorption av alla unincorporated färgämne. </li><li> Centrifugera märkta cellerna under 5 min @ ~ 400 x g.. Försiktigt aspirera supernatanten utan att ta bort celler. Tvätta pelleten två gånger med 4 ml av CM eller HBSS +1% BSA, dispergera pelleten väl före återcentrifugering. För att minimera överföring av färgämne adsorberas på rörväggarna och maximera tvätteffekt, överföra cellerna till ett nytt polypropenrör efter fiRST resuspension. Obs: tillräckligt färgade celler uppvisar en tydlig rosa skiftning i pelleten. </li><li> Resuspendera den tvättade cellpelleten i 1,0 ml HBSS +1% BSA. Räkna cellerna, bestämma cellutvinning och justera volymen för erhållande av en slutlig koncentration av 10 7 / ml. Med noggrann aspiration bör cellutvinning vara ≥ 85%. Om cellen återhämtning är &lt;70%, fastställa orsaken innan du går vidare. Återkalla en 150 ul alikvot (1.5x10 6 celler) och placera på is för användning i steg 2. </li></ol> 2. Beredning av instrument och analys Setup Kontroller (tabell 1) <ol><li> Alikvotera 50 pl (5x10 5) av ofärgade celler från cellsuspensionen sparade i steg 1,1 i vardera av fem 1,8 ml Eppendorf-rör: 1, 3, 4, 5, och 7. Alikvotera 50 ^ (5x10 5) av PKH26 pos celler från steg 1,9 till var och en av tre rör: 2, 6 och 8. </li><li> Tillsätt 10 | il IgG blocket (100 pg / rör av IgG, se tabell av reagens) till rören 1-8och inkubera i 10 min vid omgivande temperatur (20-25 ° C). </li><li> Lägg en mättande mängd av antikroppen (er) som anges i tabell 1 till Rör 4, 5, 7, och 8 och inkubera alla prover (Rör 1-8) för 30 min vid omgivande temperatur och skyddas från ljus. </li><li> Lägg 1,5 ml HBSS +1% BSA till alla prover, pelletera cellerna genom centrifugering (5 min @ 400 xg) och tvätta en gång med 1,5 ml HBSS +1% BSA, med noggrann strävan att undvika cellförlust. </li><li> Återsuspendera varje prov i 500 | il HBSS +1% BSA. Om så krävs för prover som skall analyseras på cytometer, överföring till ett 12 x 75 mm rund botten rör. Tillsätt 10 | il av 100 | ig / ml 7-AAD dagliga arbetstiden lager (se tabell av reagens) till rören 3, 6, 7 och 8 såsom visas i tabell 1. Inkubera på is under 30 min före användning i flödescytometern installation och färgning verifiering (steg 3). </li></ol> 3. Flödescytometern installation och färgning Verifiering <ol><li> Kontrollera att flödet cytomeTER fungerar korrekt, med hjälp av laboratoriets etablerade procedurer för daglig kvalitetskontroll. Kontrollera att signaler kan lätt detekteras i varje spektral fönster som skall användas, och att detektorns respons är linjärt proportionell mot signalintensitet i fönstret som ska användas för spridning övervakning 14. </li><li> Förvärva FSC vs SSC data för Rör 1 med linjära display skalor. Justera varje detektor har förstärkning så att lymfocytpopulationen faller i nedre vänstra kvadranten av punktdiagram, inte utanför skalan i antingen parameter och inte avbryts på grund av tröskeleffekt. Samla ungated FSC vs SSC data för alla proverna i steg från 3,3 till 3,7. </li><li> Förvärva data för Rör 1, med ingen färg ersättning och logaritmiska skalor display för alla 4 fluorescens detektorer. Justera varje detektor höga spänning (HV) för att placera autofluorescens av ofärgade lymfocyter på skalan med få / inga celler ansamlas i den första kanalen. Ställ en analys gräns för varje histogrammotsvarar den ljusaste 2% av ofärgade celler. </li><li> Använda ingen färg ersättning och de HV inställningar etablerade i steg 3,2 och 3,3, skaffa data för Rör 2, samla FSC, SSC och signaler i alla 4 fluorescens detektorer. För detektorn används för att övervaka PKH26 fluorescens, kontrollera att alla PKH26 pos celler visas på skalan som en enda symmetrisk topp i den 3: e -4: e decennium, med få / inga celler i den sista kanalen. Om det finns flera toppar eller topp form är skev, upprepa steg 1 med noggrann uppmärksamhet på salt minimering och blanda teknik (figur 2). Justera vid behov färgämneskoncentration. </li><li> Använda inställningar etablerade i steg 3,3, skaffa data för Rör 3, samla FSC, SSC och signaler i alla 4 fluorescens detektorer. För detektorn för att övervaka 7-AAD fluorescens, kontrollera att 7-AAD pos celler faller över 2% gräns fastställts i steg 3,3 (dvs att icke livsdugliga celler är väl lösasfrån livskraftiga 7-AAD neg celler). </li><li> Använda inställningar etablerade i steg 3,3, skaffa data för Rör 4, samla FSC, SSC och signaler i alla 4 fluorescens detektorer. Kontrollera att CD8 pos celler väl löses från ofärgade celler (dvs. faller över 2% gräns fastställts i steg 3,3 för FITC detektorn). Upprepa med rör 5 och kontrollera att CD8 pos celler väl löses från ofärgade celler (dvs. faller över 2% gräns fastställts i steg 3,3 för APC detektorn). </li><li> Använda inställningar etablerade i steg 3,3, skaffa data för Tubes 6, 7 och 8, samla FSC, SSC och signaler i alla 4 fluorescens detektorer. </li><li> Använd listan Filer läget som samlats in för Rören 1-5 och din färg kompensation programvara för att skapa en färg överlappar matris för varje fluorokrom i detektorerna som används för att övervaka de tre övriga fluorokromer. Tillämpa denna matris till listan läget filen för prov 6 och kontrollera att förekomsten av PKH26 labEling ändrar inte förmågan att upptäcka 7-AAD pos celler. </li><li> Applicera färgen överlappar matrisen från steg 3,8 till listan läget filen för prov 7 och kontrollera att: a) 3 väl upplösta subpopulationer (CD3 neg CD4 neg, CD3 pos CD4 neg och CD3 pos CD4-pos) kan identifieras på ett FITC vs APC punktdiagram, och b) förekomst av anti-CD3-FITC och anti-CD4-APC ändrar inte förmågan att upptäcka 7-AAD pos celler. Om förekomst av anti-CD3-FITC ändrar övre 2% gränsen för uppgifter som samlats in på PKH26 detektorn justera gränsen behov. </li><li> Applicera färgen överlappning matrisen från steg 3,8 till listan läget filen för prov 8. Om förekomst av PKH26 märkning förändrar 2% gränsen för FITC, 7-AAD eller APC detektorer från dem som använder autofluorescens kontroll i steg 3,3, justera gränsen (er) som behövs med hjälp Tube 7 i tabell 1 och kontrollera att den är fortfarande möjligt att distinguish CD3 pos CD4 pos, CD3 pos CD4 neg och CD3 neg CD4 neg celler med den justerade gränsen (er). </li></ol> 4. Spridning Modell Val för celldelning övervakning av Dye Spädning <ol><li> Bestäm avståndet mellan generationerna, som är beroende på antalet kanaler och logaritmiska decennier på din cytometer. För digitala instrument, är detta värde, typiskt 4 eller 5 decennier, bestäms av antalet fack i den digitala signalprocessorn. På analoga instrument, där antalet årtionden är sällan ett heltal, kräver noggrann modellering det exakta antalet decennier bestämmas experimentellt. För att göra detta, är data från en blandning av kalibrerade fluorescerande pärlor med tillverkarens tilldelade-relativa intensiteter förvärvats vid samma detektor hög spänning inställningar som används i experimentet. Positionen av vulsten topparna möjliggör kalibrering av logaritmisk skala i form av intensity sortiment per log decennium. Specifikt görs detta genom att plotta kanalnumret för varje pärltyp mot log av tillverkaren tilldelade-värdet. Lutningen av en bäst passande räta linjen för vulsten datavärden anger antalet relativa intensitet enheter per kanal. Multiplicerat med antalet kanaler kommer detta värde vara så att antalet log årtionden för full skala, där antalet kanaler som motsvarar en två-faldig minskning i intensitet (dvs. dotter generation mellanrum) kan beräknas 14. </li><li> Bestäm om du vill använda en fast avstånd mellan generationer eller att låta avståndet flyta. En standard (fast) inställning kommer att använda generationerna avståndet värde som fastställts i steg 4,5 tilldela var varje generation och används vanligtvis när histogrammet saknar distinkta toppar. En flottör inställningen kan varje generationsskifte topp ståndpunkt fastställas av histogrammet formen och används vanligtvis när distinguishable generationerna toppar är uppenbara. </li><li> Bestäm om du vill använda en fast topp bredd för alla generationer och en flytande bredd. En fast bredd använder SD beräknades för ostimulerade kontrollprovet att modellera alla generationer och väljs typiskt när provet saknar urskiljbara generationer toppar. En flytande bredd gör att programmet kan självständigt variera SD för varje generation och bäst med urskiljbara generationer toppar. </li><li> Kör ett program som innehåller en modul spridning analys (här ModFit LT version 3,3). Fyll den stimulerade PKH26 pos-fil från data som ska analyseras (t.ex. en stimulerade 96 tim kultur av PKH26 pos celler motfärgades som för rör 8 i tabell 1). </li><li> Välj parametrarna för analys, i detta fall PKH26 (585/42) gate livskraftig (7-AAD neg) CD3 pos lymfocyter och FSC vs SSC att utesluta små skräp och stora aggregat (Figur 3). Vid fastställandetdessa regioner vara noga med att inkludera höga framåtspridning där blaster finns normalt och notera att CD3 uttryck kan vara ner moduleras i stimulerade kulturer. </li><li> Skapa en ny spridning modell med spridning guiden. Använda Öppna datafil (fliken Start), ladda ostimulerade PKH26 pos kontroll fil och definiera placeringen av högsta kanalen i föräldrarnas fördelning motsvarar odelade celler. </li><li> Analysera filen för ostimulerade PKH26 pos kontroll, notera värdena för föräldrarnas topp position och bredd (standardavvikelse). Om en fast toppbredd (SD) önskas, kontrollera Lås SD. </li><li> Ladda PKH26 neg kontroll (t.ex. en 96 HR kultur av PKH26 neg celler motfärgades som för Rör 7 i tabell 1). Justera antal generationer genom att toppen kanalen för dimmest generationen ovanför PKH26 neg kontroll. Detta bestämmer Number av dotter generationer modellen kan exakt passar och är typiskt 6-9 generationer. </li><li> Öppna datafilen för den stimulerade provet (t.ex. en stimulerad 96 tim kultur av PKH26 pos celler motfärgades som för rör 8 i tabell 1) och bekräfta att regionerna för föräldrarnas topp position och SD som definieras i steg 4,7 oförändrade. Om fast generationsväxling avstånd önskas, välj Standardmodellen alternativ, annars väljer Flytande alternativet. </li><li> Analysera varje experimentell fil i datamängden, enligt samma modell som definieras i steg 4,9. Mindre justeringar av föräldrarnas toppositionen kan vara nödvändig för de allra bästa passform som definieras både visuellt och genom den minskade chi square (RCS) värde. </li><li> Spela de önskade spridning statistik följd av bästa passform för varje experimentell fil i datamängden. För en utförlig beskrivning av möjliga mått se Ref. 22. </li></ol>

<ol>
	<li>Poon, R. Y., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Bagwell, C. B., Muirhead, K. A., Diamond, R. A., DeMaggio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+PKH+Membrane+Intercalating+Dyes+to+Monitor+Cell+Trafficking+and+Function.">Use of PKH Membrane Intercalating Dyes to Monitor Cell Trafficking and Function.</a> Living Color: Flow Cytometry and Cell Sorting Protocols. , 302-352 (2000).</li><li>Wallace, P. K., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Tracking+2007:+A+Proliferation+of+Probes+and+Applications.">Cell Tracking 2007: A Proliferation of Probes and Applications.</a> Immunol. Invest. 36, 527-562 (2007).</li><li>Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+lymphocyte+proliferation,+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data.">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nat. Protoc. 2, 2057-2067 (2007).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat. Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li><li>Bolton, D. L., Minang, J. T., Trivett, M. T., Song, K., Tuscher, J. J., Li, Y., Piatak, M., O'Connor, D., Lifson, J. D., Roederer, M., Ohlen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking,+Persistence,+and+Activation+State+of+Adoptively+Transferred+Allogeneic+and+Autologous+Simian+Immunodeficiency+Virus-Specific+CD8++T+Cell+Clones+during+Acute+and+Chronic+Infection+of+Rhesus+Macaques.">Trafficking, Persistence, and Activation State of Adoptively Transferred Allogeneic and Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones during Acute and Chronic Infection of Rhesus Macaques.</a> J. Immunol. 184, 303-314 (2010).</li><li>Juopperi, T. A., Sharkis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Quiescent+Murine+Hematopoietic+Stem+Cells+by+Homing+Properties.">Isolation of Quiescent Murine Hematopoietic Stem Cells by Homing Properties.</a> Meth. Mol. Biol. 430, 21-30 (2008).</li><li>Kusumbe, A. P., Bapat, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+aneuploid+populations+within+developing+tumors+are+the+major+determinants+of+tumor+dormancy.">Cancer stem cells and aneuploid populations within developing tumors are the major determinants of tumor dormancy.</a> Cancer Res. 69, 9245-9253 (2009).</li><li>Pece, S., Tosonim, D., Confalonieri, S., Mazzarol, G., Vecchi, M., Ronzoni, S., Bernard, L., Viale, G., Pelicci, P. G., Fiore, P. P. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+Molecular+Heterogeneity+of+Breast+Cancers+Correlates+with+Their+Cancer+Stem+Cell+Content.">Biological and Molecular Heterogeneity of Breast Cancers Correlates with Their Cancer Stem Cell Content.</a> Cell. 140, 62-73 (2010).</li><li>Gertner-Dardenne, J., Poupot, M., Gray, B. D., Fourni&#233;, J. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+fluorochrome+trackers+of+membrane+transfers+between+immune+cells.">Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells.</a> Immunol. Invest. 36, 665-685 (2007).</li><li>Bercovici, N., Givan, A. L., Waugh, M. G., Fisher, J. L., Vernel-Pauillac, F., Ernstoff, M. S., Abastado, J. P., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+precursor+analysis+of+T-cell+responses+to+antigen.">Multiparameter precursor analysis of T-cell responses to antigen.</a> J. Immunol. Methods. 276, 5-17 (2003).</li><li>Givan, A. L., Fisher, J. L., Waugh, M. G., Bercovici, N., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cell-tracking+dyes+to+determine+proliferation+precursor+frequencies+of+antigen-specific+T+cells.">Use of cell-tracking dyes to determine proliferation precursor frequencies of antigen-specific T cells.</a> Methods Mol. Biol. 263, 109-124 (2004).</li><li>Schwaab, T., Tretter, C. P., Gibson, J. J., Cole, B. F., Schned, A. R., Harris, R., Fisher, J. L., Crosby, N., Stempkowski, L. M., Heaney, J. A., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-related+immunity+in+prostate+cancer+patients+treated+with+human+recombinant+granulocyte+monocyte-colony+stimulating+factor+(GM-CSF).">Tumor-related immunity in prostate cancer patients treated with human recombinant granulocyte monocyte-colony stimulating factor (GM-CSF).</a> Prostate. 66 (6), 667-674 (2006).</li><li>Bantly, A. D., Gray, B. D., Breslin, E., Weinstein, E. G., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellVue+Claret,+a+New+Far-Red+Dye,+Facilitates+Polychromatic+Assessment+of+Immune+Cell+Proliferation.">CellVue Claret, a New Far-Red Dye, Facilitates Polychromatic Assessment of Immune Cell Proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 581-605 (2007).</li><li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+assay+for+quantitation+of+rare+antigen-specific+T-cells:+using+cell-tracking+dyes+to+calculate+precursor+frequencies+for+proliferation.">A flow cytometric assay for quantitation of rare antigen-specific T-cells: using cell-tracking dyes to calculate precursor frequencies for proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 563-580 (2007).</li><li>Tario, J. D., Gray, B. D., Wallace, S. S., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lipophilic+tracking+dyes+for+monitoring+cell+proliferation.">Novel lipophilic tracking dyes for monitoring cell proliferation.</a> Immunol Invest. 36, 861-885 (2007).</li><li>Wallace, P. K., Tario, J. D., Fisher, J. L., Wallace, S. S., Ernstoff, M. S., , ., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Antigen-Driven+Responses+by+Flow+Cytometry:+Monitoring+Proliferation+by+Dye+Dilution.">Tracking Antigen-Driven Responses by Flow Cytometry: Monitoring Proliferation by Dye Dilution.</a> Cytometry. 73, 1019-1034 (2008).</li><li>Barth, R. J., Fisher, D. A., Wallace, P. K., Channon, J. Y., Noelle, R. L., Gui, J., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Randomized+Trial+of+Ex+vivo+CD40L+Activation+of+a+Dendritic+Cell+Vaccine+in+Colorectal+Cancer+Patients:+Tumor-Specific+Immune+Responses+Are+Associated+with+Improved+Survival.">A Randomized Trial of Ex vivo CD40L Activation of a Dendritic Cell Vaccine in Colorectal Cancer Patients: Tumor-Specific Immune Responses Are Associated with Improved Survival.</a> Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).</li><li>Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Immune+Cell+Proliferation+and+Cytotoxic+Potential+Using+Flow+Cytometry.">Tracking Immune Cell Proliferation and Cytotoxic Potential Using Flow Cytometry.</a> Meth. Mol. Biol. 699, 119-164 (2011).</li><li>Fuse, S., Underwood, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Analysis+of+In+Vivo+CD8++T+Cell+Cytotoxicity+Against+Multiple+Epitopes+using+Multicolor+Flow+Cytometry.">Simultaneous Analysis of In Vivo CD8+ T Cell Cytotoxicity Against Multiple Epitopes using Multicolor Flow Cytometry.</a> Immunol. Invest. 36, 829-845 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Fleck, M., Mackensen, A., Zoso, A., Halbritter, D., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111, 3546-3552 (2008).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+cellular+proliferation+data:+Avoid+the+panglossian.">Interpretation of cellular proliferation data: Avoid the panglossian.</a> Cytometry. 79A, 95-101 (2011).</li><li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+(CFSE)+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation.">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> J. Vis. Exp. (44), e2259 (2010).</li><li>Houlihan, D. D., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Review+of+Clinical+Trials+of+Bone+Marrow+Stem+Cells+in+Liver+Disease.">Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease.</a> Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).</li><li>Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+In+Vitro+Suppressive+Capacity+of+Regulatory.">Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory.</a> T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).</li></ol>

K. Humphrey, JD Tario, Jr och PK Wallace har fått förkommersiella cell tracking reagenser för utvärdering av Life Technologies, Inc. och BD Biosciences. AD Bantly och JS Moore har fått förkommersiell cell tracking reagenser för utvärdering av Life Technologies, Inc. och finansiering från PTI Research, Inc. för förkommersiell karakterisering av olika CellVue cell tracking färgämnen. K. Muirhead är anställd av SciGro, Inc., som erbjuder konsulttjänster till Phanos Technologies, Inc. (ägare av PKH och CellVue färgämnen) och ger backup teknisk support för Sigma-Aldrich och Molecular Inriktning Technologies, Inc. (distributörer av dessa färgämnen). Produktion och fri tillgång till denna artikel är sponsrad av Sigma-Aldrich.

De metoder som beskrivs här är de som finns i våra kombinerade laboratorier mest tillförlitligt ge optimala resultat för hPBMC märkning med membran färgämnen 13,16,18 och lymfocyter delmängd fenotypning och spridning spårning med antingen membranet eller färgämnen protein 2,11,13,16, 18. Såsom illustreras i figurerna 1 och 2, är ljus likformig märkning lättast uppnås genom att begränsa närvaron av fysiologiska salter och användning av en blandnings teknik som resulterar i snabb, homogen exponering av alla celler till samma koncentration av färgämne. Eftersom färgning med membran färgämnen sker genom uppdelning i lipiddubbelskiktet kan andra variabler som ändrar gratis färgkoncentration påverka även märkning effektivitet. Till exempel märkning i runda rör botten polystyren resulterar i mindre effektiv urtvättning av salter före återsuspension i Diluent C och även i minskad fri färgkoncentration grund att färga adsorption på rörväggar, i synnerhetvid lägre färgämneskoncentrationer. Båda faktorer tenderar att ge bredare färgning fördelningar än när märkningen utförs med koniska rör botten polypropen (figurerna 3, 4 och opublicerade resultat). Prov ålder och typ kan också påverka toppbredden även när optimerade färgningsprocedurer används. Till exempel CV för PKH26 pos lymfocyter isolerade från nytaget blod sträcker sig från 14-20% (figur 3, ref. 13 och opublicerade resultat), medan CV för lymfocyter isolerade från 24 tim gammal blodprov eller Trima filter pheresis rad 25 till 30 % (Figur 4 och Ref. 18). Färgning enhetlighet och i vilken utsträckning icke-viabla celler kan uteslutas från analysen både påverka om urskiljbara dotter toppar är uppenbara i färgen utspädning profilen, vilket i sin tur påverkar valet av spridning modell för att passa de observerade data (fig 5 och 6 </strong&gt;). Även ModFit (Verity Software House, Topsham, ME) används här som ett exempel på programvara som används för att generera statistik som spridning Index och Prekursor Frekvens (figur 3, 5 och 6, tabell 3), andra programpaket innehåller också moduler för att analysera spridning uppgifter. Dessa inkluderar FCSExpress (de novo Software, Los Angeles, CA) och FlowJo (Träd Star, Inc., Ashland, OR). Alla dessa program använder en icke-linjär minsta kvadrat-analys för att iterativt hitta den som passar bäst till de rådata genom att ändra position, höjd och SD (eller bredd) på Gaussiska toppar som representerar sekventiella dotter generationer. Proliferativ Index (PI) och Prekursor Frekvens (PF) är de vanligaste åtgärderna för omfattning spridning. PI, såsom definieras av ModFit, är ett mått på ökningen av cellantalet under loppet av analysen, analogt med &quot;stimuleringsindex&quot; av en tymidinupptag. PF returnerar fraktionen av celler i det ursprungliga populatjon som svarade på stimulans genom prolifererande. Försiktighet rekommenderas dock när man läser litteratur sedan terminologin varierar något mellan programvarupaket (t.ex. FlowJo och ModFit använder olika definitioner och beräkningar för vad som menas med &quot;spridning Index&quot;) 22. De kritiska frågor som diskuterades här för märkning och spridning analys med membran färgämnen också stött vid användning protein färgämnen. Till exempel måste noggrann uppmärksamhet blandningsteknik också observeras, tillsammans med undantag av döda / döende celler, för att få enhetliga fördelningar och urskiljbara toppar dotter vid användning CFSE (Figur 6) 2-4,13,18,24. Lämpligt val av fluorokromer för fenotypning och livskraft bedömning är också viktigt att undvika alltför spektral överlappning och oförmåga att känna igen antikroppar positiva celler, särskilt med synliga färger avger protein som CFSE 2-4,11,13,16,18 </sup&gt;. Minska koncentrationen av spårning färg minskar ersättning problem i angränsande spektrala kanaler men också begränsar antalet celldelningar som kan övervakas innan dottercell intensiteter börjar överlappa autofluorescens. Alternativt kan du använda av nyare cell tracking färgämnen som långt rött emitterande CellVue Claret (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) eller violett avger CellTrace Violet (Life Technologies, Grand Island, NY) kan minska ersättning problem (Figur 6). Slutligen, även membran färgämnen i allmänhet tenderar att uppvisa mindre toxicitet 11,26, är det möjligt att över-märka celler med antingen klass av färgämne. Det är därför alltid nödvändigt att kontrollera att koncentrationen av spåra använt färg inte har ändrat funktionaliteten hos de celler som skall spåras (Figur 6) 3,13,16,18.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens eller utrustning </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Kommersiellt Köpt </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9400 </td><td></td></tr><tr><td> Bovint serumalbumin (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> Fetalt bovint serum (FBS) </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks balanserade saltlösning (HBSS) </td><td> Life Technologies </td><td> 14175-079 </td><td> Kalcium-och magnesiumfri, utan fenolrött </td></tr><tr><td> Humant IgG Cohnfraktion II och III globuliner </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-4386 </td><td></td></tr><tr><td> Mus-anti-human-CD3-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 349.201 </td><td> Mättnadskoncentration som bestäms av laboratorie titrering </td></tr><tr><td> Mus-anti-humana CD4-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340.672 </td><td> Mättnadskoncentration som bestäms av laboratorie titrering </td></tr><tr><td> Mus-anti-humana CD4-PECy7 </td><td> BD Biosciences </td><td> 348.799 </td><td> Mättnadskoncentration som bestäms av laboratorie titrering </td></tr><tr><td> Mus-anti-humana CD8-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 347.313 </td><td> Mättnadskoncentration som bestäms av laboratorie titrering </td></tr><tr><td> Mus-anti-humana CD8-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD0805 </td><td> Mättnadskoncentration som bestäms av laboratorie titrering </td></tr><tr><td> Mus-anti-human-CD19-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD1905 </td><td&gt; mättnadskoncentration som bestäms av laboratorie titrering </td></tr><tr><td> Mus-anti-human-CD25-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340.938 </td><td> Mättnadskoncentration som bestäms av laboratorie titrering </td></tr><tr><td> Mus-anti-human CD127-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 557.938 </td><td> Mättnadskoncentration som bestäms av laboratorie titrering </td></tr><tr><td> Mus-anti-human-CD3 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0037-85 </td><td> 1,0 mg / ml; azid fri </td></tr><tr><td> Mus-anti-human-CD28 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0289-85 </td><td> 1,0 mg / ml; azid fri </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300-058 </td><td></td></tr><tr><td> PKH26 röda fluorescerande celler länkare kit innehållande 10-3M PKH26 i EtOH och Diluent C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> PKH26GL-1KT eller MINI26-1KT </td><td> Förfaranden i steg 1 gäller ävenkit innehållande PKH67 eller andra färgämnen CellVue </td></tr><tr><td> CellVue Claret långt rött fluorescerande celler länkare kit innehållande 10-3M CellVue Claret i EtOH och Diluent C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MINCLARET-1KT eller MIDCLARET-1KT </td><td></td></tr><tr><td> 5 - (och-6)-karboxifluorescein-diacetat, succinimidylester (CFDA-SE) </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> C34554 </td><td> Icke-fluorescerande, spjälkas av membran esteraser att bilda fluorescerande amino-reaktiv karboxifluorescein succinimidylester (CFSE) </td></tr><tr><td> LIVE / DEAD fastställbara Violet </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> L34955 </td><td></td></tr><tr><td> Steril 12 x 75 mm konisk polypropenrör och mössor </td><td> VWR </td><td> 60818-102 </td><td> Ger bättre membran effektivitet färg färgning (reducerad färg adsorption, mindre celler förlust under supernatant aspiration) </td></tr><tr><td> 12 x 75 mm round botten polystyrenrör </td><td> Becton Dickinson </td><td> 21008-936 </td><td></td></tr><tr><td> Flödescytometern </td><td> BD Bioscience </td><td> FACSCalibur LSRFortessa </td><td> Varje cytometer kan upptäcka FITC, PKH26, och 7-AAD (ex. 488 nm,. Em 520 nm, 567 nm och 655 nm, respektive) och APC-ex. 633-640 nm, em. 660 nm) </td></tr><tr><td> Flödescytometern </td><td> Beckman Coulter </td><td> LSRII CYAN </td><td> Varje cytometer kan upptäcka FITC, PKH26, och 7-AAD (ex. 488 nm,. Em 520 nm, 567 nm och 655 nm, respektive) och APC-ex. 633-640 nm, em. 660 nm) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Laboratorietillverkade </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, koncentrerad förrådslösning </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 1 mg / ml i PBS. Frys i alikvoter och förvara vid -20 ° C. </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, workung lager </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 100 pg / ml i PBS, förbereda dagligen från 1 mg / ml fryst lager. </td></tr><tr><td> IgG blocket </td><td> NA </td><td> NA </td><td> HBSS + 10 mg / ml humant IgG Cohn-fraktion II och III globuliner + 10 mg / ml BSA. </td></tr></tbody></table>

optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes

Fluorescerande celler spårning färgämnen i kombination med flöde och bild cytometri, är kraftfulla verktyg som man kan studera interaktioner och öden olika celltyper in vitro och in vivo. 1-5 Även om det finns bokstavligen tusentals publikationer som använder sådana färgämnen, några av de vanligast förekommande cell tracking applikationer inkluderar övervakning av: <ol><li> stam och stamcellstransplantation inaktivitet, proliferation och / eller differentiering 6-8 </li><li> antigen-driven membran överföring 9 och / eller prekursor cellproliferation 3,4,10-18 och </li><li> immun reglerande och effektorcell funktion 1,18-21. </li></ol> Kommersiellt tillgängliga cell spårning färgämnen varierar mycket i sina kemiska och fluorescens egenskaper men den stora majoriteten hänföras till en av två klasser baserat på deras mekanism för cellmärkning. &quot;Membrane färgämnen&quot;, kännetecknas av PKH26, är mycket lipofila färgämnen thatt partition stabilt men icke kovalent till cellmembran 1,2,11. &quot;Protein färgämnen&quot;, kännetecknas av CFSE är amino-reaktiva färgämnen som bildar stabila kovalenta bindningar med cellproteiner 4,16,18. Varje klass har sina egna fördelar och begränsningar. Nyckeln till deras framgångsrika användningen, särskilt i multicolor studier där flera färgämnen används för att spåra olika celltyper, är därför att förstå de kritiska frågorna som möjliggör optimal användning av varje klass 2-4,16,18,24. Protokollen ingår här lyfta fram tre vanliga orsaker till dåliga eller varierande resultat när du använder cell-spårning färgämnen. Dessa är: <ol><li> Underlåtenhet att uppnå ljusa, likformig, reproducerbar märkning. Detta är en nödvändig utgångspunkt för någon cell tracking studien men kräver uppmärksamhet till olika variabler när du använder membran färgämnen än vid användning av protein färgämnen eller jämviktsbindning reagens såsom antikroppar. </li><li> Suboptimala fluorokrommängder kombinationer enND / eller underlåtenhet att inkludera kritiska ersättning kontroller. Spårning färgämnesfluorescens är typiskt februari 10 - mars 10 gånger ljusare än antikroppar fluorescens. Det är därför viktigt att kontrollera att förekomsten av spårning färg inte äventyrar möjligheten att upptäcka andra prober som används. </li><li> Underlåtenhet att erhålla en bra passform med maximal modellering programvara. Sådan programvara kan kvantitativ jämförelse av proliferativa svar på olika populationer eller stimuli baserade på föregångare frekvens eller annan statistik. Skaffa en bra passform, kräver dock uteslutande av död / döende celler som kan snedvrida dye utspädning profiler och matchning av de antaganden som ligger modellen med egenskaperna hos observerade färgen utspädning profil. </li></ol> Exemplen här illustrerar hur dessa variabler kan påverka resultatet vid användning av membran och / eller färgämnen protein för att övervaka cellproliferation.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes at JoVE.com

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Framgångsrik användning av färgämnen cell tracking för att övervaka immunceller funktion och förökning involverar flera viktiga steg. Vi beskriver metoder för: 1) få ljusa, enhetlig, reproducerbar etikett-ning med membran färgämnen, 2) välja fluorokromer och data villkor förvärv och 3) val av en modell för att kvantifiera cellproliferation baserad på färg utspädning.

Optimerade färgning och spridning modelleringsmetoder för celldelning övervakning med hjälp Färgämnen Cell Tracking

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Selektiv Märkning av proteiner på cellernas ytor med hjälp av CyDye Dige Fluor Minimal Färgämnen

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Live dissekering av Drosophila Embryon: Effektivare metoder för screening Mutant Samlingar av Antibody färgning

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Bestämma Cell antal under cellodling med Counter Scepter Cell

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Övervakning dynamiska förändringar i mitokondriernas kalciumnivåer under apoptos Använda en genetiskt kodade Kalcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Cell Spårning Med Photoconvertible proteiner under Zebrafish Utveckling

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

In Vivo Modellering av Morbid Human Genome hjälp Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Histokemisk fargning av<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sekundär cell Väggelement

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Metoder för Skin såra och Analyser för Wound-svar i<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Temporal Spårning av cellcykelprogression med användning av flödescytometri utan behov av synkronisering

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Jämförelse av tre olika metoder för bestämning av cellproliferation i bröstcancercellinjer

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...