Name: time-lapse fluorescence imaging of arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the rootchip
Uploaded: 2012-07-07T11:00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip at JoVE.com

Agradecemos Philipp Denninger para obter ajuda com o vídeo de preparação e Chaudhuri Bhavna para fornecer linhas de plantas que expressam FRET sensores. Este trabalho foi suportado por concessões do National Science Foundation (MCB 1021677), o Departamento de Energia (DE-FG02-04ER15542) a WBF, o National Institutes of Health e do Howard Hughes Medical Institute para SRQGG foi apoiada por um longo EMBO prazo comunhão. MM foi apoiado pela Fundação Alexander von Humboldt.

Nota: Execute todas as etapas etapas preparatórias em condições estéreis. 1. Preparação de Cones de plástico para germinação de sementes <ol><li> Encha de 10 cm de placa de Petri com meio de crescimento contendo agar a 1% para uma espessura de 5 mm. Usamos uma força meia modificado Hoagland meio 4, mas a composição do meio deve ser escolhida para se adequar individuais requisitos experimentais. </li><li> Enquanto o meio é ainda líquido, utilizar uma pipeta multi-canal 10 para encher as pontas das pipetas uL com 5 uL de meio a partir da placa de Petri. </li><li> Armazenar as pontas cheias na caixa de ponta de pipeta até que o meio é sólido, então cortada para 4 mm de comprimento e cones de plástico colocado em pé em uma placa de Petri contendo meio de crescimento sólido. </li></ol> 2. Germinação e crescimento de mudas <ol><li> Tona esterilizar sementes em NaOCl a 5% durante 5 min, lavar três vezes com água estéril, em seguida, colocar uma única semente no topo de cada um dos cone meio-cheias. </li><li> Selar a placa com fita micropore (3M) e armazenar a 4 ° C para sincronizar a germinação. </li><li> Após três dias, transferir as placas a uma câmara de crescimento para iniciar a germinação. As nossas condições de crescimento são a 23 ° C com um ciclo de light/8h 16h alta escuro (intensidade de luz: 100 μE m -2 s -1). </li><li> Entre 5 e 7 dias após a germinação, as mudas devem estar prontas para a transferência para o RootChip. Neste momento, pontas de raiz deve estar próximo das saídas inferiores dos cones de plástico. Verifique a saúde de plântulas, comprimento da raiz e, se for o caso, a expressão de um marcador fluorescente sob um microscópio de dissecação. </li><li> Marcar mudas individuais para transferência para o chip. Seleccione dez ou menos no caso de um plântulas é danificada durante a transferência. </li></ol> 3. Transferência de Mudas para a RootChip <ol><li> Para esterilizar o RootChip para experimentos de longa duração, embrulheo dispositivo em papel de seda, lugar numa placa de Petri de vidro, e autoclave. </li><li> Uma vez que o RootChip esfriar, cubra-o com meio de crescimento líquido. O RootChip deve ser completamente imerso, mas o nível do fluido deve ser não mais do que 3 mm acima da superfície RootChip. </li><li> Com uma pipeta 20 uL, puxe médio através da entrada de raiz e saída da câmara para encher a câmara de observação com meio. </li><li> Cones de plástico plug selecionado no passo 2,5 para as entradas RootChip. Os cones deve caber nas entradas. Uma vez que o RootChip é montado sobre uma fina camada de vidro óptico, não se aplicam demasiada pressão para o chip. </li><li> Incubar a RootChip durante a noite em meio líquido. Para evitar flutuante, coloque duas lâminas de vidro para o chip. Adicionar uma barra de agitação magnética e fechar o prato. </li><li> Transferir a montagem de um agitador magnético e agitar suavemente o meio. </li><li> O entradas RootChip de intersecção dos canais a um ângulo de 30 ° para o dispositivo normal para facilitate crescimento da raiz para os canais (Figura 1A). Para apoiar ainda mais o crescimento na direcção desejada, inclinar ligeiramente o conjunto colocando uma lâmina de vidro sob a placa de Petri sobre o lado da frente das saídas de chip. </li><li> Para manter o ciclo de luz / escuro, iluminar as plântulas com uma lâmpada de anel (intensidade de luz: 100 μE m -2 s -1) ligado a um temporizador. </li></ol> 4. Ligar o RootChip ao Transportador <ol><li> No dia seguinte, encher um frasco, selável pressurizable com meio de crescimento líquido (Figura 1B). </li><li> Inverta a transportadora chip e colocá-lo sobre uma superfície estável. Remover o RootChip a partir do meio líquido e inseri-lo lado PDMS para baixo para dentro da abertura inferior do transportador chip. Orientar o chip de modo que o lado que contém as entradas da camada de controlo está virada para o lado da pressão de conectores de linha de tubagem na parede lateral transportador. </li><li> Seca-se a tampa de vidro noinferior do chip suavemente por blotting com papel de seda. Fixe a RootChip à transportadora com fita adesiva e direito a congregação inteira. </li><li> Conectores da tubulação são feitas por cortar tubos microboro plástico flexível (TYGON, 0,20 &quot;ID x 0,060&quot; OD) em 5 centímetros de comprimento e conectá-los ao aço inoxidável microboro tubos (New England Tubo Pequeno, 0,025 &quot;OD x 0,013&quot; ID x 0,75 &quot; de comprimento). Encha os conectores de tubos com água utilizando uma seringa e ficha cada ligador de tubagem para dentro da entrada correspondente de controle da camada no chip. A água será mais tarde preencher os canais camada de controle e ser usado para transmitir a pressão para as válvulas micromecânicos. </li><li> Ligar as extremidades opostas das linhas em mídia / frasco de solução (s). Aplicar pressão para o frasco de solução com uma seringa de ar. A pressão de ar aumentada dentro do frasco solução irá forçar o líquido para as linhas. </li></ol> 5. Montagem do RootChip ao microscópio <ol><li> Coloque a transportadora para a Microscfase ope. Para reduzir a possibilidade de o conjunto deslocando sobre o decurso da experiência, devido a vibrações na sala, o transportador deve encaixam perfeitamente os entalhes do inserto fase. </li><li> As válvulas de chip e do fluxo de meio através do chip são controlados por pressão de ar. Duas linhas com os reguladores são ramificadas fora de uma linha de pressão principal - um é utilizado para controlar o fluxo médio através dos canais, eo outro está ligado a válvulas de solenóide de ar que accionar os válvulas push-up da camada de controlo. As válvulas solenóides são operados a partir do computador através da válvula controladora USB (desenvolvido por Rafael Gómez-Sjöberg, Lawrence Berkeley National Lab). Feche ambos os reguladores de pressão antes de ligar o chip. </li><li> Adicionar alguns mililitros de água para os reservatórios do veículo para manter a umidade alta dentro do conjunto. Esta etapa deve ser repetida ao longo do curso dos experimentos mais longos para manter as plantas sequem. Mantenha o volume baixo para minimizar tele quantidade de líquido que pode ser derramado sobre o microscópio. Para experimentos de longa duração, a saída das tomadas de chips pode ser guiado para os reservatórios da transportadora, ligando os pontos de venda de chips para os reservatórios com microboro tubulação (veja o passo 4.4). Alternativamente, o fluxo de saída que se acumula na superfície do chip pode ser recolhido por pipetagem. </li><li> Prepare folhas quadrados de plástico transparente de protetores da folha (C-Line). Fixe o plástico transparente para o transportador por fita dupla face para manter a umidade elevada na montagem. </li><li> Posicione o anel de luz sobre o chip e manter o ciclo de claro / escuro. A luz anel deve ser desligado antes do início de cada experiência que utiliza marcadores fluorescentes, como a iluminação directa irá interferir com a recolha de imagem. </li></ol> 6. Operação do RootChip usando a Interface LabView A interface do controlador RootChip para a plataforma de software LabVIEW podeser baixado do nosso site <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip</a> . <ol><li> As válvulas no chip são fechados por aplicação de pressão para a camada de controlo, neste caso, abrindo as válvulas de ar de solenóide. A interface do controlador permite acionamento das válvulas, clicando no botão abaixo do número da válvula. Verde brilhante indica aplicação de pressão e de fecho de uma válvula de chip (Figura 2B). Ative todas as três válvulas de entrada solução na interface do controlador antes de abrir os reguladores de pressão. Nota: A interface controlador dispõe de um ciclo de feedback, que permite a monitorização do estado do sistema. Esse recurso pode ser ativado clicando no botão &quot;cotejamento&quot; na interface do controlador. </li><li> Abra o regulador de pressão para a camada de controle e, inicialmente definido para 15 psi, em seguida, abra o regulador para a camada de fluxo e, inicialmente definido para 5 psi. DepenDing sobre a taxa de fluxo desejada, as pressões podem ser ajustada mais tarde. </li><li> Abra a válvula de entrada para o meio de crescimento de escolha para lavar as câmaras com o meio. </li><li> Verificar caminhos de fluxo sob o microscópio. Tipicamente, o ar é retido nos canais de fluxo e deve ser removido. Além disso, os canais de a camada de controle ainda conter ar que deve ser forçado para fora e substituído por a água dos conectores tubo (sem saída enchimento). Ambas as tarefas são alcançados através de lavagem cada uma das oito câmaras várias vezes (5 psi) até que todo o ar é forçado a partir dos canais para a PDMS (&quot;desgaseificação&quot;). Nota: O controlador interface pode ser programado para automatizar experimentos. Tais rotinas podem também ser utilizados para desgaseificar o chip. </li></ol> 7. Os resultados representativos O objectivo principal da RootChip é combinar uma plataforma de imagem e um sistema de perfusão em um único dispositivo com um elevado nível de integração. Para demonstrar a manipulaçãodo microambiente das raízes que corou as câmaras com corante alimentar escuro (1:4 diluição em meio hidropônico) e medida a troca de fluido no interior das câmaras. À pressão recomendada de 5 psi, medimos a uma troca completa dentro de 10 segundos, a uma taxa de fluxo calculado de aproximadamente 1,5 uL / min (Figura 3). Observou-se também o crescimento das raízes das plântulas, neste caso cultivadas no escuro e fornecido com 10 mM de glucose como fonte de energia externa (Figura 4). Dependendo das condições de crescimento, tais como luz e composição do meio, as plantas podem ser observados no RootChip por até três dias. O RootChip tem sido utilizado para monitorizar a glucose intracelular e os níveis de galactose em raízes que expressam nanosensores codificados geneticamente, com base no Förster Transferência de Energia de Ressonância (FRET) 5-7. Raízes no chip foram perfundidos com pulsos quadrados de glucose ou galactose solução ( <strong&gt; Figura 5). Os níveis intracelulares de açúcares foram monitorizados e são mostrados aqui expresso como uma razão entre a intensidade do Citrino fluoróforo aceitador para a intensidade da ECFP doador. O aumento da proporção indica acumulação de açúcar. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1. Princípio RootChip. <ol class="ualpha"><li> O RootChip apresenta oito câmaras de observação para o crescimento e de imagem de raízes. As primeiras sementes germinam em cones de plástico - fabricado a partir de pontas de pipeta de plástico - que são preenchidos com meio sólido. A ponta de raiz cresce através do meio e atinge a câmara onde um fluxo contínuo de meio líquido mantém as condições na câmara constante. Válvulas micromecânica (vermelho) controlar o fluxo. O chip é montado sobre uma tampa de vidro óptico. Desenho sem escala. (Adaptado com permissão de Grossmann et al., 2011 Plant Cell.) </li><li> Scheme de um frasco de solução pressurizable com diafragma (vermelho). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig2.jpg" alt="A Figura 2" /> Figura 2. Ligar e montagem do RootChip. <ol class="ualpha"><li> Vista de cima da RootChip totalmente conectado e transportadora montada em um microscópio invertido. </li><li> Esquema ilustrando o sistema de válvulas e do controlador de interface. Um exemplo para uma válvula de fixação para guiar o fluxo de fluido para uma única câmara é mostrado. Embora as válvulas de 4 a 8 actuam como válvulas, válvulas individuais de 0 a 3 ato em grupos. Com este sistema de uma câmara de indivíduo pode ser tratada através da activação de uma combinação de válvulas. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig3.jpg" alt="A Figura 3" /> Figura 3. Troca de soluções no ch observaçãoambers. visualização da troca de fluido em uma câmara de observação utilizando uma solução de corante. A imagem é uma sobreposição de campo brilhante e falsa cor-de-intensidade do sinal de coloração. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig4.jpg" alt="A Figura 4" /> Figura 4. No chip crescimento das raízes. A observação de uma única raiz crescente expressando uma fluorescente FRET nanosensor para a glucose / galactose ao longo de 20 h. Formato da hora: hh: mm; barra de escala: 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig5.jpg" alt="A Figura 5" /> Figura 5. Medindo os níveis de açúcar intracelulares usando FRET nanosensores. <ol class="ualpha"><li> A quantidade de sensor é mostrado como citrino intensidade dentro da extremidade da raiz (à esquerda). A resposta do intracelular FRET nanosensor para a aplicação de glucose ou galactose solução é mostrado como imagens raciométrica. (Adaptado com permissão de Grossmann et al., 2011 Plant Cell) Barra de escala:. 100 mm. </li><li> Rastreio FRET relação muda em resposta a três pulsos repetidos quadrados de glucose (verde) e galactose (vermelho). </li></ol>

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	<li>Grossmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RootChip:+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science.">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).</li><li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography.">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li><li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Imaging+with+Fluorescent+Biosensors:+Advanced+Tools+for+Spatiotemporal+Analysis+of+Biodynamics+in+Cells.">Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors: Advanced Tools for Spatiotemporal Analysis of Biodynamics in Cells.</a> Annu. Rev. Plant Biol. , (2012).</li><li>Loqu&#233;, D., Lalonde, S., Looger, L. L., von Wir&#233;n, N., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytosolic+trans-activation+domain+essential+for+ammonium+uptake.">A cytosolic trans-activation domain essential for ammonium uptake.</a> Nature. 446, 195-198 (2007).</li><li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors.">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21, 45-54 (2010).</li><li>Fehr, M., Frommer, W. B., Lalonde, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+maltose+uptake+in+living+yeast+cells+by+fluorescent+nanosensors.">Visualization of maltose uptake in living yeast cells by fluorescent nanosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 9846-9851 (2002).</li><li>Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLUT1+and+GLUT9+as+major+contributors+to+glucose+influx+in+HepG2+cells+identified+by+a+high+sensitivity+intramolecular+FRET+glucose+sensor.">GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1091-1099 (2008).</li><li>Chaudhuri, B., Hörmann, F., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+glucose+flux+impedance+using+FRET+sensors+in+wild-type+Arabidopsis+plants.">Dynamic imaging of glucose flux impedance using FRET sensors in wild-type Arabidopsis plants.</a> J. Exp. Bot. 62, 2411-2417 (2011).</li><li>Meier, M., Lucchetta, E. M., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+stimulation+of+the+Arabidopsis+thaliana+root+using+multi-laminar+flow+on+a+microfluidic+chip.">Chemical stimulation of the Arabidopsis thaliana root using multi-laminar flow on a microfluidic chip.</a> Lab Chip. 10, 2147-2153 (2010).</li><li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-in-chip:+Microfluidic+system+for+studying+root+growth+and+pathogenic+interactions+in+Arabidopsis.">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> Appl. Phys. Lett. 98, 263703-26 (2011).</li><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-373 (2006).</li><li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+Compatibility+of+Poly(dimethylsiloxane)-Based+Microfluidic+Devices.">Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices.</a> Anal. Chem. 75, 6544-6554 (2003).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

As principais vantagens do RootChip sobre os métodos de crescimento convencionais são a preparação minimamente invasiva para a microscopia, a capacidade de reversivelmente e repetidamente alterar o ambiente de raiz, e da capacidade de observação contínua de tecido developmentally competente e fisiologicamente saudável durante um período de vários dias. Anteriormente, as plantas foram cultivadas em meios gelificados verticalmente e transferidos para um sistema de perfusão imediatamente antes da experiência, o que permitiu medir apenas raízes de cada vez 8. Ferramentas microfluídicos têm sido utilizados para Arabidopsis, mas a um nível baixo de integração 9 ou sem controlo de perfusão 10. O RootChip combina um alto nível de integração com a capacidade de automatizar experimentos através de orientação de fluxo preciso. Outra vantagem desta plataforma, característica de todos os dispositivos microfluídicos 11, é que apenas quantidades mínimas de líquido são necessárias para fornecer a raiz com a porca necessáriorients, mesmo para experimentos que abrangem vários dias. O RootChip está concebido como um dispositivo de uso único, mas desde que os custos de produção de chips estão baixos, as pequenas quantidades de reagentes consumidos faz o chip ainda é muito rentável. Existem alguns passos críticos que devem ser tomadas para garantir a saúde das mudas: O volume nos cones de plástico é apenas uL 3-4, que vai começar a secar quando exposta ao ar. Por isso, é crítico que os cones são transferidos para o chip de forma rápida e de humidade é mantida elevada até que as raízes tenham atingido as câmaras de observação, o que irá fornecer-lhes água suficiente. Passos 4.2 para 4.5 deve ser realizada rapidamente e sem interrupção para evitar o ressecamento das mudas. Passos de 3,5 - 3,8 descrever a incubação do chip em meios líquidos durante o qual as raízes crescem para dentro das câmaras de observação. Este passo pode ser ignorada pela montagem do chip no carrier imediatamente e iniciando a perfusão constante com meio de crescimento. No entanto, é recomendável imersão em meio de crescimento durante a noite, uma vez que tem algumas vantagens: 1) cria um ambiente húmido de modo as plântulas são menos provável que se torne dessecado à medida que crescem para dentro da câmara de observação, 2), o chip é embebido em líquido, de modo desgaseificação (passo 6,4) será mais rápido. É importante a utilização de meios de comunicação com baixas concentrações de soluto. As soluções mais concentradas podem precipitar e entupir os canais, especialmente se o chip é usado em vários dias. Uma vez que o dispositivo está conectado à linha de pressão de ar, o fluxo de meio é controlado alterando a pressão hidráulica nas válvulas. Para garantir o correcto encerramento das válvulas micromecânicos, é importante escolher uma pressão de comando que é cerca de três vezes maior do que a pressão de fluxo. A pressão de fluxo não deve exceder 15 psi como o fluido vai ser empurrado para fora das entradas de raiz. Altas pressões may também causar delaminação do chip, o que torna o inutilizável chip. Uma limitação do RootChip é que o PDMS é porosa e hidrofóbico. Enquanto o material é praticamente inerte a soluções aquosas, que podem absorver compostos orgânicos 12. Isso pode interferir com uma troca rápida de soluções como compostos orgânicos podem vazar a partir do material, mesmo quando o fornecimento deste composto foi parado na entrada. Devido à porosidade, a utilização de solventes orgânicos podem causar inchaço do PDMS 12. Continuamos a optimizar a RootChip e alargar a sua utilidade, por exemplo, com raízes de plantas de cultivo. Acreditamos que melhorando o acesso à raiz para o tratamento e observação, ferramentas microfluídicos como a RootChip vai abrir novas dimensões de pesquisa raiz.

<table border="1"><tbody><tr><td> Itens </td><td> Fonte </td><td> Informações </td></tr><tr><td> Chip transportadora, software e outras informações. </td><td> Carnegie Institution - DPB </td><td> CAD e CNC arquivos para a fabricação transportadora, software controlador e mais informações estão disponíveis para download no site da <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip~~HEAD=NNS</a> Portadores também podem ser encomendados a partir deste site. </td></tr><tr><td> RootChip </td><td> Stanford Fundição </td><td> Máscara projetos e protocolos de fabricação estão disponíveis mediante solicitação. Ready-to-use RootChips pode ser encomendado a partir de <a href="http://www.stanford.edu/group/foundry/" target="_blank">http://www.stanford.edu/group/foundry/</a> </td></tr><tr><td> Controlador de Chip </td><td> -Home built-</td><td> O sistema controlador automático de válvula foi originalmente desenvolvido por Rafael Gómez-Sjöberg, Lawrence Berkeley National Lab. Uma instrução detalhada de como construir o seu próprio controlador de válvula atuada pode ser encontrada em <a href="https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers" target="_blank">https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers</a> </td></tr></tbody></table>

time-lapse fluorescence imaging of arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the rootchip

As funções de raiz como a âncora físico da planta e é o órgão responsável pela captação de água e nutrientes minerais, como nitrogênio, fósforo, sulfato e oligo-elementos que as plantas adquirem a partir do solo. Se queremos desenvolver abordagens sustentáveis ​​para a produção de alta produtividade da cultura, nós precisamos entender melhor como a raiz se desenvolve, ocupa um amplo espectro de nutrientes, e interage com organismos simbiontes e patogênicos. Para alcançar esses objetivos, precisamos ser capazes de explorar as raízes em detalhes microscópicos ao longo de períodos que variam de minutos a dias. Nós desenvolvemos o RootChip, um polidimetilsiloxano (PDMS) - dispositivo micro based, o que nos permite crescer e raízes de imagem de mudas de Arabidopsis, evitando qualquer esforço físico às raízes durante a preparação para a imagem 1 (Figura 1). O dispositivo contém uma estrutura de canal bifurcada com válvulas micromecânicos para guiar o fluxo do fluidoa partir de entradas de solução para cada um dos oito câmaras de observação 2. Este sistema de perfusão permite que o microambiente de raiz para ser controlado e modificado com precisão e rapidez. O volume das câmaras é de aproximadamente 400 nl, exigindo assim apenas quantidades mínimas de solução de teste. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para o estudo da biologia raiz no RootChip utilizando imagens baseadas em abordagens com a resolução em tempo real. Raízes pode ser analisada ao longo de vários dias usando microscopia lapso de tempo. Raízes podem ser perfundidos com soluções nutritivas ou inibidores, e até oito plântulas podem ser analisados ​​em paralelo. Este sistema tem o potencial para uma vasta gama de aplicações, incluindo a análise do crescimento das raízes na presença ou ausência de produtos químicos, de fluorescência baseada em análise da expressão do gene, ea análise de biossensores, por exemplo, FRET nanosensores 3.

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Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Este artigo fornece um protocolo para o cultivo de mudas de Arabidopsis no RootChip, uma plataforma microfluídica imagem que combina controle automatizado das condições de crescimento com acompanhamento raiz microscópica e FRET baseado em medição de níveis de metabólitos intracelulares.

Time-lapse imagens de fluorescência de crescimento de raiz Arabidopsis com Manipulação acelerada do meio root usando o RootChip

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