Name: rearing and injection of manduca sexta larvae to assess bacterial virulence
Uploaded: 2012-12-11T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence at JoVE.com

De auteurs willen het verleden leden van de Goodrich-Blair lab bedanken: Samantha Orchard, Kimberly Cowles, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Megan Menard, en Youngjin Park voor hun bijdragen aan de ontwikkeling van dit protocol. Dit werk werd gefinancierd door de National Science Foundation subsidie ​​IOS-0950873 en de National Institutes of Health NRSA gemeenschap FAI084441Z.

1. Insect Egg Sterilisatie en grootbrengen <ol><li> Bereid voeding door eerst autoclaaf 15 g van de ontvangen agar in 900-1,000 ml H 2 O. Onmiddellijk na behandeling in een autoclaaf, meng met 166 g tarwekiemen dieet en mix goed in een laboratorium blender. Giet het mengsel in een schaal (of gerechten) om af te koelen, vervolgens overbrengen dieet om aluminiumfolie, strak wikkelen, en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Bij aankomst, steriliseren M. sexta eieren met 250 ml 0,6% bleekmiddeloplossing gedure...

<ol>
	<li>Bintrim, S. B., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+inactivation+of+genes+encoding+the+crystalline+inclusion+proteins+of+Photorhabdus+luminescens+results+in+mutants+with+pleiotropic+phenotypes.">Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes.</a> J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).</li><li>Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioassay+for+homogeneous+parasporal+crystal+of+Bacillus+thuringiensis+using+the+tobacco+hornworm,+Manduca+sexta.">Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta.</a> Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).</li><li>P&#233;chy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+a+novel+gene+cluster+encoding+an+insect+toxin+in+plant-associated+strains+of+Pseudomonas+fluorescens.">Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens.</a> Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).</li><li>Nu&#241;ez-Valdez, M. E., Calder&#243;n, M. A., Aranda, E., Hern&#225;ndez, L., Ram&#237;rez-Gama, R. M., Lina, L., Rodr&#237;guez-Segura, Z., Guti&#233;rrez Mdel, C., Villalobos, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+Mexican+strain+of+Serratia+entomophila+pathogenic+against+root-damaging+larvae+of+Scarabaeidae+(Coleoptera).">Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera).</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).</li><li>Forst, S. A., Tabatabai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+histidine+kinase,+EnvZ,+in+the+production+of+outer+membrane+proteins+in+the+symbiotic-pathogenic+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus.">Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).</li><li>Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+responses+of+a+lepidopteran+insect,+Manduca+sexta.">Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta.</a> Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).</li><li>Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+recognition+proteins+in+Manduca+sexta+plasma.">Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).</li><li>Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+immune+response+to+the+entomopathogen+Photorhabdus.">Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus.</a> Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).</li><li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friend+and+foe:+the+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila.">Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).</li><li>D'Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+host+for+Pseudomonas+aeruginosa+Infection.">Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection.</a> J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).</li><li>Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+toxicity+of+Photorhabdus+luminescens+W14+toxin+complexes+in+Escherichia+coli.">Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).</li><li>Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+variation+in+Xenorhabdus+nematophila+virulence+and+suppression+of+Manduca+sexta+immunity.">Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity.</a> Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).</li><li>Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus+depresses+nodulation+reactions+to+infection+by+inhibiting+eicosanoid+biosynthesis+in+tobacco+hornworms,+Manduca+sexta.">The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).</li><li>Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+regulator+Lrp+contributes+to+mutualism,+pathogenesis+and+phenotypic+variation+in+the+bacterium+Xenorhabdus+nematophila.">The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila.</a> Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).</li><li>Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+activity+of+a+Xenorhabdus+nematophila+haemolysin+required+for+full+virulence+towards+Manduca+sexta+insects.">Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects.</a> Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).</li><li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutualism+and+pathogenesis+in+Xenorhabdus+and+Photorhabdus:+two+roads+to+the+same+destination.">Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination.</a> Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).</li><li>Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+modulation+of+immunity:+changes+within+the+feeding+period+of+the+fifth+larval+stage+in+the+defence+reactions+of+Manduca+sexta+to+infection+by+Photorhabdus.">Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus.</a> J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).</li><li>Kavanagh, K., Reeves, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+potential+of+insects+for+in+vivo+pathogenicity+testing+of+microbial+pathogens.">Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens.</a> FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).</li></ol>

De directe injectie van M. sexta larven met entomopathogene bacteriën, zoals hier beschreven, dient als een eenvoudig en effectief middel om bacteriële virulentie analyseren. De methode is ook zeer aanpasbaar aan te passen verschillende proefpersonen en / of voorwaarden. Bacteriën kunnen op diverse manieren bereid voor injectie. Bij X. nematophila, wild type cellen gekweekt in voedselrijke Luria-Bertani (LB) medium tot mid-log fase zijn typisch de meest virulente, doden meeste of alle insecten binne...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 90 mm filterpapier </td><td> Whatman papier </td><td> 1001 090 </td><td></td></tr><tr><td> Glazen filterhouder </td><td> Millipore </td><td> XX1004700 </td><td></td></tr><tr><td> Manduca sexta eieren </td><td> Carolina Biological Supply </td><td> 143880 </td><td></td></tr><tr><td> Gypsy Moth Dieet + agar </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0296029301 </td><td></td></tr><tr><td> 5,5 oz. plastic containers en deksels </td><td> Solo Cup Company </td><td> URC55-0090 PL4-0090 </td><td></td></tr><tr><td> 1 oz. plastic containers en deksels </td><td> DART Container Corporation </td><td> 100PC 100PCL25 </td><td></td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td></td&gt; <td></td><td> 137 mm NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4, 1,46 mM KH 2PO 4, pH 7,4 </td></tr><tr><td> Injectiespuit </td><td> Hamilton </td><td> 80208 </td><td> 30 gauge, 0,375 &quot;lengte, punt stijl 2 </td></tr></tbody></table>

rearing and injection of manduca sexta larvae to assess bacterial virulence

Manduca sexta, algemeen bekend als de tabak hornworm, wordt beschouwd als een belangrijke en tuinbouw en daarbuiten, het voeden op Solanaceae planten, met inbegrip van tabak en tomaat. De gevoeligheid van M. sexta larven van verschillende bacteriesoorten entomopathogene 1-5, evenals de rijkdom aan informatie beschikbaar over het insect immuunsysteem van 6-8 en de hangende genoomsequentie 9 het een goede modelorganisme voor gebruik bij het ​​bestuderen gastheer-microbe interacties tijdens pathogenese. Bovendien M. sexta larven zijn relatief groot en gemakkelijk te manipuleren en te behouden in het laboratorium opzichte van andere gevoelige insectensoorten. Hun grote formaat maakt het ook efficiënt weefsel / hemolymfe extractie voor de analyse van de gastheer respons op infectie. Werkwijze hier gepresenteerde beschrijft de directe injectie van bacteriën in de hemocoel (bloedholte) van M. Sexta larven. Deze benaderingkunnen worden geanalyseerd en de virulentie kenmerken van verschillende bacteriesoorten, stammen, of mutanten vergelijken eenvoudig bewaken van de tijd insect dood na injectie. Deze methode is ontwikkeld om de pathogeniteit van Xenorhabdus en Photorhabdus species die typisch associëren met nematode vectoren als middel om toegang tot het insect krijgen bestuderen. Entomopathogene nematoden meestal besmetten larven via natuurlijke spijsvertering of respiratoire openingen, en laat hun symbiotische bacteriën inhoud in het insect hemolymfe (bloed) kort daarna 10. De injectiemethode hier beschreven omzeilt de noodzaak van een nematode vector, waardoor het loskoppelen van de effecten van bacteriën en nematode op het insect. Deze methode zorgt voor nauwkeurige kwantificering van besmet materiaal (cellen of eiwit) in de inoculum, wat niet mogelijk is met andere bestaande methodes voor het analyseren entomopathogenesis, zoals knikken 11 en 12 assays orale toxiciteit <em&gt;. Ook orale toxiciteit assays betrekking op de virulentie van toxines uitgescheiden ingebracht in het spijsverteringsstelsel van larven, terwijl de directe injectiewerkwijze richt de virulentie van gehele cellen inocula. Het nut van de directe injectie methode zoals hier beschreven bacteriële pathogenese analyseren bewaken insect mortaliteit. Echter, deze werkwijze eenvoudig worden uitgebreid voor het bestuderen van de effecten van besmetting van het M. sexta immuunsysteem. Het insect reageert op infectie via zowel humorale als cellulaire responsen. De humorale respons omvat herkenning van bacterieel geassocieerde patronen en daaropvolgende productie van diverse antimicrobiële peptiden 7, de expressie van genen die coderen voor deze peptiden kunnen worden bewaakt na directe infectie via RNA extractie en kwantitatieve PCR 13. De cellulaire respons op infectie omvat nodulatie, inkapselen en fagocytose van ziekteverwekkers door hemocyten 6 </sup&gt;. Om deze reacties te analyseren, kan geïnjecteerd insecten worden ontleed en gevisualiseerd door microscopie 13, 14.

Een representatief voorbeeld van een insect mortaliteit assay is weergegeven in figuur 3. In dit experiment werden insecten geïnjecteerd met ongeveer 50 kolonievormende eenheden (CFU) van hetzij wild type (ATCC19061) of een verzwakte mutante stam (LRP 13) van Xenorhabdus nematophila gekweekt tot mid-log fase (n = 6 insecten per stam). Insecten waargenomen ongeveer 72 uur en het percentage geïnjecteerde insecten nog in leven elk tijdpunt opgenomen. In dit geval is de verzwa...

Watch this Scientific Journal Video about Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence at JoVE.com

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

De hier beschreven methode maakt gebruik van directe injectie van entomopathogene bacteriën in de hemocoel van<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Insectenlarven.<em&gt; M. Sexta</em&gt; Is een commercieel verkrijgbaar en goed bestudeerde insect. Aldus is deze methode een eenvoudige benadering voor het analyseren gastheer-bacteriële interacties vanuit een of beide partners.

Opfok en Injectie van<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Larven naar bacteriële virulentie beoordelen

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Speeksel, speekselklieren en hemolymfe Collectie van Ixodes scapularis Teken

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

Monitoring van de Assemblee van een afgescheiden virulentiewerd Factor behulp van Site-specifieke Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generatie en Multi-fenotypische High-inhoud Screening van<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Het toepassen van een induceerbare Expression Systeem om interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulaire signalering Studie

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

Zebravis als een model om de teratogene potentie van nitriet Assess

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of ...

The Madagascar Hissing Cockroach as an Alternative Non-mammalian Animal Model to Investigate Virulence, Pathogenesis, and Drug Efficacy

De Madagaskar Sissende kakkerlak als een alternatieve bij niet-zoogdieren diermodel te onderzoeken Drug werkzaamheid, virulentie en pathogenese

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identificatie van merkers van de virulentie van Mycobacterium abscessus voor intracellulaire replicatie in fagocyten

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluatie van de virulentie en pathogenese van Aeromonas infectie in een Model Caenorhabditis elegans

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Een High-throughput Shigella-specifieke bactericide Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Opsonophagocytic doden Assay te beoordelen van de immunologische reacties tegen bacteriële pathogenen

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...