Name: rearing and injection of manduca sexta larvae to assess bacterial virulence
Uploaded: 2012-12-11T12:00:00
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Les auteurs tiennent à remercier les anciens membres du laboratoire de Goodrich-Blair: Samantha Orchard, Kimberly Cowles, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Megan Menard, et Youngjin parc pour leurs contributions à l&#39;élaboration de ce protocole. Ce travail a été financé par la National Science Foundation subvention IOS-0950873 et le National Institutes of Health NRSA FAI084441Z bourse.

1. Stérilisation des oeufs d&#39;insectes et d&#39;élevage <ol><li> Préparer l&#39;alimentation d&#39;abord autoclave 15 g de gélose fournie dans 900-1000 ml H O. 2 Immédiatement après passage à l&#39;autoclave, le mélange avec 166 g de nourriture de germe de blé et bien mélanger dans un mélangeur de laboratoire. Verser dans un plat (ou des plats) pour refroidir, puis transfert à l&#39;alimentation du papier d&#39;aluminium, enveloppez hermétiquement et conserver à 4 ° C. </li><li> À l&#39;a...

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	<li>Bintrim, S. B., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+inactivation+of+genes+encoding+the+crystalline+inclusion+proteins+of+Photorhabdus+luminescens+results+in+mutants+with+pleiotropic+phenotypes.">Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes.</a> J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).</li><li>Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioassay+for+homogeneous+parasporal+crystal+of+Bacillus+thuringiensis+using+the+tobacco+hornworm,+Manduca+sexta.">Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta.</a> Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).</li><li>P&#233;chy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+a+novel+gene+cluster+encoding+an+insect+toxin+in+plant-associated+strains+of+Pseudomonas+fluorescens.">Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens.</a> Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).</li><li>Nu&#241;ez-Valdez, M. E., Calder&#243;n, M. A., Aranda, E., Hern&#225;ndez, L., Ram&#237;rez-Gama, R. M., Lina, L., Rodr&#237;guez-Segura, Z., Guti&#233;rrez Mdel, C., Villalobos, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+Mexican+strain+of+Serratia+entomophila+pathogenic+against+root-damaging+larvae+of+Scarabaeidae+(Coleoptera).">Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera).</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).</li><li>Forst, S. A., Tabatabai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+histidine+kinase,+EnvZ,+in+the+production+of+outer+membrane+proteins+in+the+symbiotic-pathogenic+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus.">Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).</li><li>Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+responses+of+a+lepidopteran+insect,+Manduca+sexta.">Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta.</a> Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).</li><li>Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+recognition+proteins+in+Manduca+sexta+plasma.">Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).</li><li>Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+immune+response+to+the+entomopathogen+Photorhabdus.">Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus.</a> Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).</li><li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friend+and+foe:+the+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila.">Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).</li><li>D'Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+host+for+Pseudomonas+aeruginosa+Infection.">Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection.</a> J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).</li><li>Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+toxicity+of+Photorhabdus+luminescens+W14+toxin+complexes+in+Escherichia+coli.">Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).</li><li>Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+variation+in+Xenorhabdus+nematophila+virulence+and+suppression+of+Manduca+sexta+immunity.">Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity.</a> Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).</li><li>Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus+depresses+nodulation+reactions+to+infection+by+inhibiting+eicosanoid+biosynthesis+in+tobacco+hornworms,+Manduca+sexta.">The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).</li><li>Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+regulator+Lrp+contributes+to+mutualism,+pathogenesis+and+phenotypic+variation+in+the+bacterium+Xenorhabdus+nematophila.">The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila.</a> Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).</li><li>Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+activity+of+a+Xenorhabdus+nematophila+haemolysin+required+for+full+virulence+towards+Manduca+sexta+insects.">Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects.</a> Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).</li><li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutualism+and+pathogenesis+in+Xenorhabdus+and+Photorhabdus:+two+roads+to+the+same+destination.">Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination.</a> Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).</li><li>Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+modulation+of+immunity:+changes+within+the+feeding+period+of+the+fifth+larval+stage+in+the+defence+reactions+of+Manduca+sexta+to+infection+by+Photorhabdus.">Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus.</a> J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).</li><li>Kavanagh, K., Reeves, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+potential+of+insects+for+in+vivo+pathogenicity+testing+of+microbial+pathogens.">Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens.</a> FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).</li></ol>

L&#39;injection directe de M. larves avec des bactéries entomopathogènes sexta, comme décrit ici, sert comme un moyen simple et efficace pour analyser la virulence bactérienne. La méthode est également très adaptable à différents sujets de l&#39;expérience et / ou des conditions. Les bactéries peuvent être préparés de diverses façons avant l&#39;injection. Dans le cas de X. nematophila, les cellules de type sauvage cultivées dans riche en nutriments Luria-Bertani (LB) à la mi-...

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> 90 Papier filtre mm </td><td> Whatman </td><td> 1001 090 </td><td></td></tr><tr><td> Porte-filtre en verre </td><td> Millipore </td><td> XX1004700 </td><td></td></tr><tr><td> Manduca sexta oeufs </td><td> Caroline biologique Alimentation </td><td> 143880 </td><td></td></tr><tr><td> Diet spongieuse + agar </td><td> MP Biomédical </td><td> 0296029301 </td><td></td></tr><tr><td> 5,5 oz contenants et couvercles de plastique </td><td> Solo Cup Company </td><td> URC55-0090-0090 PL4 </td><td></td></tr><tr><td> 1 oz contenants et couvercles de plastique </td><td> DART Container Corporation </td><td> 100PC 100PCL25 </td><td></td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td></td&gt; <td></td><td> 137 mm de NaCl, 2,7 mM de KCl, 8 mM Na 2 HPO 4, 1,46 mM KH 2 PO 4, pH 7,4 </td></tr><tr><td> Seringue </td><td> Hamilton </td><td> 80208 </td><td> Calibre 30, 0,375 &quot;style de point de longueur, 2 </td></tr></tbody></table>

rearing and injection of manduca sexta larvae to assess bacterial virulence

Manduca sexta, communément connu sous le sphinx du tabac, est considéré comme un ravageur agricole important, se nourrissant de plantes solanacées, dont le tabac et la tomate. La susceptibilité de M. larves sexta à une grande variété d&#39;espèces bactériennes entomopathogènes 1-5, ainsi que la richesse des informations disponibles sur le système immunitaire de l&#39;insecte 6-8, et la séquence du génome attente 9 rendent un organisme bon modèle pour une utilisation dans l&#39;étude des interactions hôte-microbe au cours de la pathogenèse. En outre, M. larves sexta sont relativement grands et faciles à manipuler et à entretenir dans le rapport de laboratoire sensibles à d&#39;autres espèces d&#39;insectes. Leur grande taille facilite aussi efficace tissus / hémolymphe d&#39;extraction pour l&#39;analyse de la réponse de l&#39;hôte à l&#39;infection. La méthode présentée ici décrit l&#39;injection directe de bactéries dans le hémocèle (cavité sang) de M. larves sexta. Cette approchepeut être utilisé pour analyser et comparer les caractéristiques de virulence de diverses espèces bactériennes, les souches, ou des mutants par simple surveillance du temps de mort de l&#39;insecte après l&#39;injection. Cette méthode a été développée pour étudier la pathogénicité de Xenorhabdus et des espèces Photorhabdus qui associent généralement avec les nématodes vecteurs comme un moyen de gagner l&#39;entrée dans l&#39;insecte. Les nématodes entomopathogènes infectent généralement les larves via digestive naturelle ou orifices respiratoires, et de libérer leurs contenus symbiotiques bactériens dans l&#39;hémolymphe des insectes (sang) peu de temps après 10. Le procédé d&#39;injection décrits ici contourne la nécessité d&#39;un nématode vecteur, ainsi découpler les effets des bactéries et des nématodes sur les insectes. Cette méthode permet à l&#39;énumération précise des matières infectieuses (cellules ou protéines) dans l&#39;inoculum, ce qui n&#39;est pas possible à l&#39;aide d&#39;autres méthodes existantes pour l&#39;analyse entomopathogenesis, y compris entaille 11 et des essais de toxicité orale 12 <em&gt;. Aussi, les essais de toxicité orale face à la virulence des toxines sécrétées introduites dans le système digestif des larves, alors que la méthode d&#39;injection directe porte sur la virulence de la cellule entière inoculums. L&#39;utilité de la méthode d&#39;injection directe comme décrit ici est d&#39;analyser la pathogenèse bactérienne en surveillant la mortalité des insectes. Cependant, cette méthode peut facilement être étendu pour une utilisation dans l&#39;étude des effets de l&#39;infection sur la M. sexta système immunitaire. L&#39;insecte réagit à l&#39;infection par les deux réponses humorales et cellulaires. La réponse humorale comprend la reconnaissance de bactéries associées aux modèles et la production subséquente de plusieurs peptides anti-microbiens 7; l&#39;expression de gènes codant pour ces peptides peut être surveillée à la suite de l&#39;infection directe par l&#39;intermédiaire d&#39;extraction d&#39;ARN et PCR quantitative 13. La réponse cellulaire à l&#39;infection implique la nodulation, l&#39;encapsulation et la phagocytose des agents infectieux par les hémocytes 6 </sup&gt;. Pour analyser ces réponses, les insectes injectés peuvent être disséqués et visualisées par microscopie 13, 14.

Un exemple représentatif d&#39;un essai mortalité des insectes est représenté dans la figure 3. Dans cette expérience, les insectes ont été injectés avec environ 50 unités formant colonies (UFC) de l&#39;une de type sauvage (ATCC19061) ou une souche mutante atténuée (lrp 13) de Xenorhabdus nematophila grandi au milieu de la phase logarithmique (n = 6 insectes par souche). Les insectes ont été observés pendant environ 72 heures, et le pour cent des insectes inje...

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Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

La méthode décrite ici utilise l&#39;injection directe de bactéries entomopathogènes dans le hémocèle de<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Les larves d&#39;insectes.<em&gt; M. sexta</em&gt; Est un insecte disponible dans le commerce et bien étudié. Ainsi, cette méthode représente une approche simple pour analyser les interactions hôte-bactéries du point de vue de l&#39;un ou des deux partenaires.

L&#39;élevage et de l&#39;injection de<em&gt; Manduca sexta</emLes larves&gt; pour évaluer la virulence bactérienne

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

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