Name: rearing and injection of manduca sexta larvae to assess bacterial virulence
Uploaded: 2012-12-11T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לחברי העבר של גודריץ-בלייר המעבדה: סמנתה אורצ&#39;רד, קימברלי קאולס, ארין הרברט-טראן, גרג ריצ&#39;רדס, מייגן נרד, וYoungjin פרק על תרומתם לפיתוח של פרוטוקול זה. עבודה זו מומנה על ידי מענק קרן המדע הלאומי IOS-0950873 והמכונים הלאומיים לבריאות NRSA המלגה FAI084441Z.

1. עיקור ביצת חרקים וגידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הדיאטה של 15 גרם מעוקר הראשון של אגר ספק ב900-1,000 המ&quot;ל H 2 O. מייד לאחר מעוקר, לערבב עם דיאטה 166 גר &#39;ניבט חיטה ותערובת היטב במעבדת בלנדר. יוצק לצלחת (או צלחות) להתקרר, ואז להעביר לדיאט?...

<ol>
	<li>Bintrim, S. B., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+inactivation+of+genes+encoding+the+crystalline+inclusion+proteins+of+Photorhabdus+luminescens+results+in+mutants+with+pleiotropic+phenotypes.">Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes.</a> J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).</li><li>Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioassay+for+homogeneous+parasporal+crystal+of+Bacillus+thuringiensis+using+the+tobacco+hornworm,+Manduca+sexta.">Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta.</a> Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).</li><li>P&#233;chy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+a+novel+gene+cluster+encoding+an+insect+toxin+in+plant-associated+strains+of+Pseudomonas+fluorescens.">Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens.</a> Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).</li><li>Nu&#241;ez-Valdez, M. E., Calder&#243;n, M. A., Aranda, E., Hern&#225;ndez, L., Ram&#237;rez-Gama, R. M., Lina, L., Rodr&#237;guez-Segura, Z., Guti&#233;rrez Mdel, C., Villalobos, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+Mexican+strain+of+Serratia+entomophila+pathogenic+against+root-damaging+larvae+of+Scarabaeidae+(Coleoptera).">Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera).</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).</li><li>Forst, S. A., Tabatabai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+histidine+kinase,+EnvZ,+in+the+production+of+outer+membrane+proteins+in+the+symbiotic-pathogenic+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus.">Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).</li><li>Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+responses+of+a+lepidopteran+insect,+Manduca+sexta.">Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta.</a> Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).</li><li>Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+recognition+proteins+in+Manduca+sexta+plasma.">Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).</li><li>Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+immune+response+to+the+entomopathogen+Photorhabdus.">Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus.</a> Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).</li><li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friend+and+foe:+the+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila.">Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).</li><li>D'Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+host+for+Pseudomonas+aeruginosa+Infection.">Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection.</a> J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).</li><li>Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+toxicity+of+Photorhabdus+luminescens+W14+toxin+complexes+in+Escherichia+coli.">Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).</li><li>Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+variation+in+Xenorhabdus+nematophila+virulence+and+suppression+of+Manduca+sexta+immunity.">Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity.</a> Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).</li><li>Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus+depresses+nodulation+reactions+to+infection+by+inhibiting+eicosanoid+biosynthesis+in+tobacco+hornworms,+Manduca+sexta.">The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).</li><li>Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+regulator+Lrp+contributes+to+mutualism,+pathogenesis+and+phenotypic+variation+in+the+bacterium+Xenorhabdus+nematophila.">The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila.</a> Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).</li><li>Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+activity+of+a+Xenorhabdus+nematophila+haemolysin+required+for+full+virulence+towards+Manduca+sexta+insects.">Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects.</a> Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).</li><li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutualism+and+pathogenesis+in+Xenorhabdus+and+Photorhabdus:+two+roads+to+the+same+destination.">Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination.</a> Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).</li><li>Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+modulation+of+immunity:+changes+within+the+feeding+period+of+the+fifth+larval+stage+in+the+defence+reactions+of+Manduca+sexta+to+infection+by+Photorhabdus.">Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus.</a> J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).</li><li>Kavanagh, K., Reeves, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+potential+of+insects+for+in+vivo+pathogenicity+testing+of+microbial+pathogens.">Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens.</a> FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).</li></ol>

ההזרקה הישירה של מ &#39; זחלי סקסטה עם חיידקי entomopathogenic, כפי שמתוארים כאן, משמשים כאמצעי פשוט ויעיל לניתוח ארסיות חיידקים. השיטה היא גם ישימה מאוד כדי להתאים לנושאים ניסיוניים שונים ו / או תנאים. חיידקים יכולים להיות מוכנים בדרכים קודמות להזרקה שונות. במקרה של <e...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 90 נייר סינון מ&quot;מ </td><td> Whatman </td><td> 1001 090 </td><td></td></tr><tr><td> בעל זכוכית מסנן </td><td> Millipore </td><td> XX1004700 </td><td></td></tr><tr><td> Manduca סקסטה ביצים </td><td> אספקת קרוליינה הביולוגית </td><td> 143880 </td><td></td></tr><tr><td> דיאט עש הצועני + אגר </td><td> Biomedicals MP </td><td> 0296029301 </td><td></td></tr><tr><td> 5.5 גר &#39;. מכולות ומכסי פלסטיק </td><td> חברת גביע יחיד </td><td> URC55-0090-0090 Pl4 </td><td></td></tr><tr><td> 1 גר &#39;. מכולות ומכסי פלסטיק </td><td> DART מכולות תאגיד </td><td> 100PC 100PCL25 </td><td></td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td></td&gt; <td></td><td> 137 המ&quot;מ NaCl, 2.7 mM KCl, 8 מ&quot;מ Na 2 HPO 4, 1.46 mM KH 2 4 ת.ד., 7.4 pH </td></tr><tr><td> מזרק </td><td> המילטון </td><td> 80208 </td><td> 30 מד, 0.375 &quot;אורך, סגנון נקודה 2 </td></tr></tbody></table>

rearing and injection of manduca sexta larvae to assess bacterial virulence

Manduca סקסטה, הידוע בכינויו hornworm הטבק, נחשבת למזיק חקלאי משמעותי, האכלה על צמחי solanaceous כוללים טבק ועגבנייה. רגישותו של מ &#39; זחלי סקסטה למגוון מיני entomopathogenic חיידקי 1-5, כמו גם השפע של מידע הזמין לגבי מערכת חיסון של חרק 6-8, ואת רצף הגנום עד 9 להפוך אותו לאורגניזם מודל טוב לשימוש בחקר אינטראקציות מארח חיידק במהלך פתוגנזה. בנוסף, מ &#39; זחלי סקסטה גדולים יחסית וקלים לתפעל ולתחזק במעבדה היחסית למיני חרקים רגישים אחרים. ממדיהן גדולים גם מאפשרים מיצוי רקמה / hemolymph יעיל לניתוח של תגובת המארח לזיהום. השיטה שהוצגה כאן מתארת ​​הזרקה הישירה של חיידקים לhemocoel (חלל דם) של מ &#39; זחלי סקסטה. גישה זוניתן להשתמש בו כדי לנתח ולהשוות את המאפיינים הארסיים של מינים שונים של חיידקים, נקע, או פשוט על ידי מוטציות ניטור הזמן למות חרק לאחר הזרקה. שיטה זו פותחה ללמוד פתוגניות של Xenorhabdus ומיני Photorhabdus, אשר בדרך כלל לקשר עם וקטורים נמטודות כאמצעי לזכות כניסה לחרקים. נמטודות Entomopathogenic בדרך כלל להדביק זחלים דרך עיכול טבעי או פתחי נשימה, ולשחרר את תוכנם לתוך החיידקים סימביוטיים hemolymph החרקים (דם) זמן קצר לאחר מכן 10. שיטת ההזרקה המתוארת כאן עוקפת את הצורך בוקטור נמטודות, ובכך מתירה את ההשפעות של חיידקים ונמטודות על החרקים. שיטה זו מאפשרת לספירה מדויקת של חומר מדבק (תאים או חלבונים) בבידוד, דבר שאינו אפשרי בשיטות קיימות אחרות לניתוח entomopathogenesis, כוללות לסחוב 11 ומבחני רעילות אוראליים 12 <eמ &#39;&gt;. כמו כן, מבחני רעילות אוראליים לטפל הארסיות של רעלים מופרשים הציגו לתוך מערכת העיכול של זחלים, ואילו בשיטת ההזרקה הישירה כתובות הארסיות של inocula כל התאים. התועלת של שיטת ההזרקה הישירה כפי שתואר כאן היא לנתח פתוגנזה חיידקים על ידי ניטור תמותת חרקים. עם זאת, שיטה זו יכולה בקלות להיות מורחבת לשימוש בחקר ההשפעות של זיהום על מ &#39; מערכת חיסונית של סקסטה. החרקים מגיבים לזיהום באמצעות שתי תגובות הומורלית ותאיות. התגובה הומורלית כוללת זיהוי תבניות חיידקים הקשורים והפקה הבאה של פפטידים שונים מיקרוביאלית 7; הביטוי של גני מקודדי חלבונים אלה יכול להיות במעקב לאחר זיהום ישיר באמצעות RNA חילוץ וכמותית PCR 13. התגובה התאית לזיהום כרוך nodulation, אנקפסולציה, וphagocytosis של חומרים מזהמים על ידי hemocytes 6 </sup&gt;. כדי לנתח את התגובות האלה, חרקים מוזרקים יכולים להיות גזורים ומדמיינים ידי מיקרוסקופיה 13, 14.

דוגמה מייצגת של assay תמותת חרקים מתואר באיור 3. בניסוי זה, חרקים הוזרקו כ 50 יחידות להרכיב מושבה (CFU) של כל אחד מסוגים פרא (ATCC19061) או זן מוחלש מוטציה (LRP 13) של Xenorhabdus nematophila גדל שלב יומן האמצע (n = 6 חרקים למתח). חרקים נצפו במשך כ 72 שעות, ואחוזים מהחרקים הזר...

Watch this Scientific Journal Video about Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence at JoVE.com

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

השיטה המתוארת כאן מנצלת הזרקה ישירה של חיידקי entomopathogenic לhemocoel של<em&gt; Manduca סקסטה</em&gt; זחלי חרקים.<em&gt; מ סקסטה</em&gt; הוא חרק זמין מסחרי ונחקר היטב. לכן, שיטה זו מייצגת גישה פשוטה לניתוח אינטראקציות מארח בקטריאלי מנקודת המבט של אחד או שני בני הזוג.

גידול והזרקה של<em&gt; Manduca סקסטה</em&gt; זחלים להערכה ארסית קטריאלי

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

רוק, בלוטות הרוק, וכן אוסף Hemolymph מ קרציות קרצית Scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

ניטור העצרת של מופרש בקטריאלי ארסי פקטור שימוש Crosslinking אתר ספציפי

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

יישום מערכת ביטוי עין מתנהלת לחקר הפרעות של גורמים בקטריאלי ארסיות עם איתות תאיים

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

דג הזברה כמודל להעריך את הפוטנציאל טרטוגניות של ניטריט

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of ...

The Madagascar Hissing Cockroach as an Alternative Non-mammalian Animal Model to Investigate Virulence, Pathogenesis, and Drug Efficacy

מדגסקר שריקה מקק בתור מודל אלטרנטיבי של בעלי חיים שאינם מידע יונקים לחקור התקפה אלימה, פתוגנזה ואת יעילות התרופה

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

זיהוי סמנים התקפה אלימה של Mycobacterium abscessus עבור שכפול תאיים ב Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

הערכת התקפה אלימה ו פתוגנזה של זיהום Aeromonas במודל Caenorhabditis elegans

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

תפוקה גבוהה שיגלה-Assay אחרים ספציפיים

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Opsonophagocytic הריגה הנועד להעריך תגובות אימונולוגי נגד פתוגנים חיידקיים

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...