Name: rearing and injection of manduca sexta larvae to assess bacterial virulence
Uploaded: 2012-12-11T12:00:00
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このプロトコルの開発への貢献のためにサマンサオーチャード、キンバリーコールズ、エリンハーバート·チャン、グレッグ·リチャーズ、ミーガンメナード、とヨンジンパーク：筆者らはグッドリッチ·ブレアラボの過去のメンバーに感謝したいと思います。この作品は、全米科学財団の助成金、IOS-0950873と健康NRSAフェローシップFAI084441Zの国立研究所によって資金を供給された。

1。虫卵の殺菌と飼育<ol><li> 900-1,000 mlのH 2 Oで提供寒天の最初のオートクレーブ15グラムで食事を準備します直後によく研究室ブレンダーで166グラムの小麦胚芽食とブレンドしたオートクレーブ、ミックス。 4でアルミ箔にダイエットを転送し、冷却するための皿（または皿）に注ぎ、しっかりとラップし、℃で保存</li><li>到着時には、Mを殺菌する時々かき混ぜながら90ミリメ?...

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	<li>Bintrim, S. B., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+inactivation+of+genes+encoding+the+crystalline+inclusion+proteins+of+Photorhabdus+luminescens+results+in+mutants+with+pleiotropic+phenotypes.">Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes.</a> J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).</li><li>Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioassay+for+homogeneous+parasporal+crystal+of+Bacillus+thuringiensis+using+the+tobacco+hornworm,+Manduca+sexta.">Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta.</a> Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).</li><li>P&#233;chy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+a+novel+gene+cluster+encoding+an+insect+toxin+in+plant-associated+strains+of+Pseudomonas+fluorescens.">Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens.</a> Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).</li><li>Nu&#241;ez-Valdez, M. E., Calder&#243;n, M. A., Aranda, E., Hern&#225;ndez, L., Ram&#237;rez-Gama, R. M., Lina, L., Rodr&#237;guez-Segura, Z., Guti&#233;rrez Mdel, C., Villalobos, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+Mexican+strain+of+Serratia+entomophila+pathogenic+against+root-damaging+larvae+of+Scarabaeidae+(Coleoptera).">Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera).</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).</li><li>Forst, S. A., Tabatabai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+histidine+kinase,+EnvZ,+in+the+production+of+outer+membrane+proteins+in+the+symbiotic-pathogenic+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus.">Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).</li><li>Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+responses+of+a+lepidopteran+insect,+Manduca+sexta.">Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta.</a> Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).</li><li>Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+recognition+proteins+in+Manduca+sexta+plasma.">Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).</li><li>Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+immune+response+to+the+entomopathogen+Photorhabdus.">Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus.</a> Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).</li><li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friend+and+foe:+the+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila.">Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).</li><li>D'Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+host+for+Pseudomonas+aeruginosa+Infection.">Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection.</a> J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).</li><li>Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+toxicity+of+Photorhabdus+luminescens+W14+toxin+complexes+in+Escherichia+coli.">Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).</li><li>Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+variation+in+Xenorhabdus+nematophila+virulence+and+suppression+of+Manduca+sexta+immunity.">Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity.</a> Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).</li><li>Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus+depresses+nodulation+reactions+to+infection+by+inhibiting+eicosanoid+biosynthesis+in+tobacco+hornworms,+Manduca+sexta.">The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).</li><li>Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+regulator+Lrp+contributes+to+mutualism,+pathogenesis+and+phenotypic+variation+in+the+bacterium+Xenorhabdus+nematophila.">The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila.</a> Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).</li><li>Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+activity+of+a+Xenorhabdus+nematophila+haemolysin+required+for+full+virulence+towards+Manduca+sexta+insects.">Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects.</a> Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).</li><li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutualism+and+pathogenesis+in+Xenorhabdus+and+Photorhabdus:+two+roads+to+the+same+destination.">Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination.</a> Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).</li><li>Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+modulation+of+immunity:+changes+within+the+feeding+period+of+the+fifth+larval+stage+in+the+defence+reactions+of+Manduca+sexta+to+infection+by+Photorhabdus.">Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus.</a> J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).</li><li>Kavanagh, K., Reeves, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+potential+of+insects+for+in+vivo+pathogenicity+testing+of+microbial+pathogens.">Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens.</a> FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).</li></ol>

Mの直接注入ここで説明するように昆虫病原細菌とsextaの幼虫は、細菌の病原性を解析するためのシンプルで効果的な手段として機能します。この方法はまた、別の実験対象および/または条件に合わせて高度に適応可能である。細菌は、注射前に、種々の方法で調製する​​ことができる。 Xの場合にはnematophila、中間対数期に栄養豊富なルリア-ベルターニ（LB）培?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> 90ミリメートルろ紙</td><td>ワットマン</td><td> 1001 090 </td><td></td></tr><tr><td>ガラスフィルターホルダー</td><td>ミリポア</td><td> XX1004700 </td><td></td></tr><tr><td> たばこスズメガ卵</td><td>カロライナ生物サプライ</td><td> 143880 </td><td></td></tr><tr><td>マイマイガダイエット+寒天</td><td> MPバイオメディカル</td><td> 0296029301 </td><td></td></tr><tr><td> 5.5オンスプラスチック容器と蓋</td><td>ソロカップカンパニー</td><td> URC55-0090 PL4-0090 </td><td></td></tr><tr><td> 1オンスプラスチック容器と蓋</td><td> DARTコンテナ株式会社</td><td> 100PC 100PCL25 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td></td&gt; <td></td><td> 137mMのNaCl、2.7mMのKCl、8mMののNa 2 HPO 4、1.46 mMのKH 2 PO 4、pH7.4の</td></tr><tr><td>注射器</td><td>ハミルトン</td><td> 80208 </td><td> 30ゲージ、0.375 &quot;長さ、ポイントスタイル2 </td></tr></tbody></table>

rearing and injection of manduca sexta larvae to assess bacterial virulence

一般的にタバコイモムシとして知られているたばこスズメガは 、タバコやトマトなど、ナス科の植物を食べ、重要な農業害虫と見なされます。 Mの感受性昆虫病原性細菌種の多様1-5、ならびに昆虫の免疫系6から8に関して入手可能な情報の富、および保留中のゲノム配列9〜sextaの幼虫は宿主-微生物相互作用を研究に使用するための優れたモデル生物作る発病時。さらに、M. sextaの幼虫は他の感受性の昆虫種に実験室での相対的に操作し、維持するために比較的大きいと簡単です。それらの大きなサイズも、感染に対する宿主応答の解析のための効率的な組織/体液抽出が容易になります。 ここで紹介する方法は、Mの血体腔内細菌の直接注入（血液空洞）を記述するsextaの幼虫。このアプローチ単に注射後に昆虫の死までの時間を監視することによって、様々な細菌種、株、または変異体の毒性の特性を分析し、比較するために使用できます。このメソッドは、通常、昆虫へのエントリを取得するための手段として、線虫ベクトルと関連付けるXenorhabdusとPhotorhabdus種の病原性を研究するために開発されました。昆虫病原性線虫は、通常、天然の消化器や呼吸器の開口部を介して幼虫に感染し、昆虫の体液（血液）、その後すぐに10にその共生細菌の内容物を放出する。ここで説明した注入法は、このように昆虫に細菌や線虫の影響を脱共役、線虫のベクトルの必要を回避します。この方法は、ニッキング11と経口毒性アッセイ12を含むentomopathogenesisを分析するための他の既存の方法を使用しては不可能である種菌内感染性物質の正確な列挙型（細胞やタンパク質）を可能に<e直接噴射方式は全細胞接種の病原性に対処する一方で、mは&gt;また、経口毒性アッセイは、幼虫の消化器系に導入され、分泌された毒素の病原性に対処します。 ここで説明したように直接注入法の有用性は、昆虫死亡率を監視することにより、細菌の病原性を解析することである。しかし、この方法は簡単にMに感染の影響を研究に使用するために拡張することができますsexta免疫システム。昆虫は体液性および細胞性応答の両方を介して感染に応答します。体液性応答は細菌関連パターンの認識や各種抗菌ペプチドのその後の生産7を含み、これらのペプチドをコードする遺伝子の発現をRNA抽出と定量PCR 13を介して直接感染後に監視することができます。感染に対する細胞応答は根粒形成、カプセル化、および血球6による感染性病原体の食作用を伴う</sup&gt;。これらの応答を解析するために、注入された昆虫を切開し、顕微鏡13,14により可視化することができます。

昆虫死亡率アッセイの代表例を図3に示します。この実験では、昆虫は野生型（ATCC19061）または中間対数期（株当たりn = 6虫）まで成長Xenorhabdus nematophilaの弱毒変異株（LRP 13）のいずれかの約50コロニー形成単位（CFU）を注射した。昆虫は約72時間観察し、各時点でまだ生きて注入された昆虫のパーセントを記録した。このケースでは、弱毒株は、昆虫殺害でク...

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Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

ここで説明する方法は、血体腔に昆虫病原細菌の直接注入を利用<em&gt;たばこスズメガ</em&gt;昆虫の幼虫。<em&gt; M sexta</em&gt;市販されており、よく研究された昆虫です。したがって、この方法は、1つまたは両方のパートナーの視点からホスト細菌の相互作用を分析する簡単な方法を表しています。

の飼育とインジェクション<em&gt;たばこスズメガ</em細菌毒性を評価するための&gt;幼虫

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

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マダニScapularisダニの唾液、唾液腺、および体液コレクション

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

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発生とのマルチ表現型ハイコンテンツスクリーニング<em&gt; Q熱リケッチア</em&gt;トランスポゾン変異体

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

誘導発現系を適用すると、細胞内シグナル伝達と細菌の病原性因子の干渉を研究するために、

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

亜硝酸塩の催奇形性を評価するためのモデルとしてのゼブラフィッシュ

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of ...

The Madagascar Hissing Cockroach as an Alternative Non-mammalian Animal Model to Investigate Virulence, Pathogenesis, and Drug Efficacy

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Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can ...

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貪食細胞における細胞内のレプリケーションの結核菌 abscessusの病原性マーカーの同定

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

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病原性と線虫モデルにおけるアエロモナス感染症の病態の評価

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

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Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

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病原性細菌に対する免疫学的応答を評価するための Opsonophagocytic 殺害アッセイ

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...