Name: rearing and injection of manduca sexta larvae to assess bacterial virulence
Uploaded: 2012-12-11T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke tidligere medlemmer av Goodrich-Blair lab: Samantha Orchard, Kimberly Cowles, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Megan Menard, og Youngjin Park for deres bidrag til utviklingen av denne protokollen. Dette arbeidet ble finansiert av National Science Foundation stipend IOS-0950873 og National Institutes of Health NRSA fellesskap FAI084441Z.

1. Insekt Egg Sterilisering og Rearing <ol><li> Forbered kosthold ved første autoklavering 15 g av den vedlagte agar i 900-1,000 ml H 2 O. Umiddelbart etter autoklavering, bland med 166 g hvetekim kosthold og bland godt i et laboratorium blender. Hell over i en tallerken (eller retter) for å kjøle, og deretter overføre kosthold til aluminiumsfolie, pakk tett, og oppbevar ved 4 ° C. </li><li> Ved ankomst, sterilisere M. sexta egg med 250 ml 0,6% blekemiddel i 2-3 min i et glass filterholderen o...

<ol>
	<li>Bintrim, S. B., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+inactivation+of+genes+encoding+the+crystalline+inclusion+proteins+of+Photorhabdus+luminescens+results+in+mutants+with+pleiotropic+phenotypes.">Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes.</a> J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).</li><li>Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioassay+for+homogeneous+parasporal+crystal+of+Bacillus+thuringiensis+using+the+tobacco+hornworm,+Manduca+sexta.">Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta.</a> Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).</li><li>P&#233;chy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+a+novel+gene+cluster+encoding+an+insect+toxin+in+plant-associated+strains+of+Pseudomonas+fluorescens.">Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens.</a> Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).</li><li>Nu&#241;ez-Valdez, M. E., Calder&#243;n, M. A., Aranda, E., Hern&#225;ndez, L., Ram&#237;rez-Gama, R. M., Lina, L., Rodr&#237;guez-Segura, Z., Guti&#233;rrez Mdel, C., Villalobos, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+Mexican+strain+of+Serratia+entomophila+pathogenic+against+root-damaging+larvae+of+Scarabaeidae+(Coleoptera).">Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera).</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).</li><li>Forst, S. A., Tabatabai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+histidine+kinase,+EnvZ,+in+the+production+of+outer+membrane+proteins+in+the+symbiotic-pathogenic+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus.">Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).</li><li>Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+responses+of+a+lepidopteran+insect,+Manduca+sexta.">Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta.</a> Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).</li><li>Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+recognition+proteins+in+Manduca+sexta+plasma.">Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).</li><li>Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+immune+response+to+the+entomopathogen+Photorhabdus.">Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus.</a> Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).</li><li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friend+and+foe:+the+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila.">Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).</li><li>D'Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+host+for+Pseudomonas+aeruginosa+Infection.">Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection.</a> J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).</li><li>Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+toxicity+of+Photorhabdus+luminescens+W14+toxin+complexes+in+Escherichia+coli.">Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).</li><li>Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+variation+in+Xenorhabdus+nematophila+virulence+and+suppression+of+Manduca+sexta+immunity.">Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity.</a> Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).</li><li>Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus+depresses+nodulation+reactions+to+infection+by+inhibiting+eicosanoid+biosynthesis+in+tobacco+hornworms,+Manduca+sexta.">The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).</li><li>Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+regulator+Lrp+contributes+to+mutualism,+pathogenesis+and+phenotypic+variation+in+the+bacterium+Xenorhabdus+nematophila.">The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila.</a> Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).</li><li>Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+activity+of+a+Xenorhabdus+nematophila+haemolysin+required+for+full+virulence+towards+Manduca+sexta+insects.">Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects.</a> Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).</li><li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutualism+and+pathogenesis+in+Xenorhabdus+and+Photorhabdus:+two+roads+to+the+same+destination.">Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination.</a> Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).</li><li>Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+modulation+of+immunity:+changes+within+the+feeding+period+of+the+fifth+larval+stage+in+the+defence+reactions+of+Manduca+sexta+to+infection+by+Photorhabdus.">Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus.</a> J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).</li><li>Kavanagh, K., Reeves, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+potential+of+insects+for+in+vivo+pathogenicity+testing+of+microbial+pathogens.">Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens.</a> FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).</li></ol>

Den direkte injeksjon av M. sexta larver med entomopathogenic bakterier, som beskrevet her, fungerer som en enkel og effektiv måte å analysere bakteriell virulens. Fremgangsmåten er også svært tilpasningsdyktig for å dekke ulike eksperimentelle fag og / eller tilstander. Bakterier kan være forberedt på ulike måter før injeksjon. I tilfelle av X. nematophila, villtype celler dyrket i næringsrikt Luria-Bertani (LB) medium til midten log fase er vanligvis den mest virulente og drepte de fleste ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> 90 mm filter papir </td><td> Whatman </td><td> 1001 090 </td><td></td></tr><tr><td> Glass filterholder </td><td> Millipore </td><td> XX1004700 </td><td></td></tr><tr><td> Manduca sexta egg </td><td> Carolina Biological forsyning </td><td> 143880 </td><td></td></tr><tr><td> Gypsy Moth Diet + agar </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0296029301 </td><td></td></tr><tr><td> 5,5 oz. plastbeholdere og lokk </td><td> Solo Cup Selskapet </td><td> URC55-0090 PL4-0090 </td><td></td></tr><tr><td> 1 oz. plastbeholdere og lokk </td><td> DART Container Corporation </td><td> 100pc 100PCL25 </td><td></td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td></td&gt; <td></td><td> 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 4 HPO, 1,46 mM KH 2 4 PO, pH 7,4 </td></tr><tr><td> Sprøyte </td><td> Hamilton </td><td> 80208 </td><td> 30 gauge, 0.375 &quot;lengde, punktstil 2 </td></tr></tbody></table>

rearing and injection of manduca sexta larvae to assess bacterial virulence

Manduca sexta, kjent som tobakk hornworm, regnes som en betydelig landbruket pest, fôring på solanaceous planter inkludert tobakk og tomat. Mottakelighet M. sexta larver til en rekke entomopathogenic bakteriearter 1-5, samt mengde informasjon tilgjengelig om insekt immunforsvar 6-8, og den ventende genomsekvens 9 gjør det til en god modell organisme for bruk i å studere vert-mikrobe interaksjoner under patogenesen. I tillegg, M. sexta larver er relativt store og lett å manipulere og vedlikeholde i laboratoriet i forhold til andre mottakelige insektarter. Sin store størrelse forenkler også effektiv vev / hemolymph ekstraksjon for analyse av verten respons til infeksjon. Metoden som presenteres her beskriver direkte injeksjon av bakterier inn i hemocoel (blod hulrom) av M. sexta larver. Denne tilnærmingenkan brukes til å analysere og sammenligne virulens egenskapene til ulike bakteriearter, stammer, eller mutanter ved å overvåke tid til insekt død etter injeksjon. Denne metoden ble utviklet for å studere patogenitet av Xenorhabdus og Photorhabdus arter, som vanligvis forbinder med nematode vektorer som et middel for å få innpass i insekt. Entomopathogenic nematoder typisk infisere larver via naturlige fordøyelsesenzymer eller respiratoriske åpninger, og slipper sin symbiotiske bakterier innholdet i insekt hemolymph (blod) kort tid etterpå 10. Injeksjonen metoden beskrevet her omgår behovet for en nematode vektor, dermed frakobling virkningene av bakterier og nematode på insekt. Denne metoden tillater for nøyaktig telling av smittefarlig materiale (celler eller protein) innenfor inokulatet, som ikke er mulig ved hjelp av andre eksisterende metoder for å analysere entomopathogenesis, herunder sammenpressing 11 og oral toksisitet analysene 12 <em&gt;. Også oral giftighet analyser adressere virulens skilles giftstoffer introdusert i fordøyelsessystemet av larver, mens den direkte injeksjon metode løser virulens av hel-celle inokula. Nytten av den direkte injeksjon metoden som er beskrevet her, er å analysere bakteriell patogenesen ved å overvåke insekt dødelighet. Imidlertid kan denne metoden enkelt utvides for anvendelse i å studere effekten av infeksjon på M. sexta immunsystem. Insektet reagerer smitte via både humorale og cellulære responser. Humoral respons omfatter anerkjennelse av bakteriell-assosierte mønstre og påfølgende produksjon av ulike antimikrobielle peptider 7; uttrykket av gener som koder for disse peptidene kan overvåkes etter at direkte smitte via RNA ekstraksjon og kvantitativ PCR 13. Den cellulære responsen til infeksjon innebærer nodulation, innkapsling og fagocytose av smittestoffer ved hemocytes 6 </sup&gt;. Å analysere disse responser, kan injiseres insekter bli dissekert og visualisert ved mikroskopi 13, 14.

Et representativt eksempel på et insekt dødelighet assay er vist i figur 3. I dette eksperimentet, ble insekter injisert med ca 50 koloni dannende enheter (CFU) av enten villtype (ATCC19061) eller en svekket mutant stamme (LRP 13) av Xenorhabdus nematophila dyrket til midt-log fase (n = 6 pr insekter stamme). Insekter ble observert i ca 72 timer, og prosent av injisert insekter lever ved hver endepunktet registrert. I dette tilfellet, utstilt attenuated belastningen en kla...

Watch this Scientific Journal Video about Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence at JoVE.com

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Metoden beskrevet her utnytter direkte injeksjon av entomopathogenic bakterier i hemocoel av<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Insektlarver.<em&gt; M. sexta</em&gt; Er en kommersielt tilgjengelig, og godt studert insekt. Dermed representerer denne metoden en enkel tilnærming til å analysere host-bakterielle interaksjoner fra perspektivet til en eller begge parter.

Oppdragelse og Injeksjon av<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Larver å vurdere Bakteriell Virulence

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Spytt, spyttkjertel, og Hemolymph Collection fra Ixodes Scapularis Flått

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generasjon og Multi-fenotypiske Høy innhold Screening av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Påføre en induserbar Expression System for å studere forstyrrelser av bakteriell virulensfaktorer med intracellulære signal

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

Sebrafisk som modell for å vurdere teratogene potensiale Nitritt

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of ...

The Madagascar Hissing Cockroach as an Alternative Non-mammalian Animal Model to Investigate Virulence, Pathogenesis, and Drug Efficacy

Madagaskar fresende kakerlakk som en alternativ ikke-pattedyr dyr modell å undersøke virulens patogenesen og narkotika effekt

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identifikasjon av virulens markører av Mycobacterium abscessus for intracellulær replikering i Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluere virulens og patogenesen av Aeromonas i en Caenorhabditis elegans modell

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En høy gjennomstrømming Shigella-spesifikke bakteriedrepende analysen

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Opsonophagocytic drepe analysen å vurdere immunologiske svar mot bakteriell patogener

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...