Name: rearing and injection of manduca sexta larvae to assess bacterial virulence
Uploaded: 2012-12-11T12:00:00
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Los autores desean agradecer a los miembros anteriores del laboratorio Goodrich-Blair: Samantha Orchard, Cowles Kimberly, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Menard Megan y Parque Youngjin por sus contribuciones al desarrollo de este protocolo. Este trabajo fue financiado por la National Science Foundation de subvención IOS-0950873 y los Institutos Nacionales de Salud NRSA compañerismo FAI084441Z.

1. Esterilización de Insectos huevo y Cría <ol><li> Preparar dieta por primera autoclave 15 g de agar proporcionado en la 900-1,000 ml H 2 O. Inmediatamente después de la esterilización en autoclave, se mezclan con 166 g de germen de trigo dieta y mezcla bien en un mezclador de laboratorio. Vierta en un plato (o platos) para enfriar y transferir dieta para papel de aluminio, envolver herméticamente, y se almacena a 4 ° C. </li><li> A su llegada, esterilizar M. Sexta huevos con 250 ml de soluc...

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	<li>Bintrim, S. B., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+inactivation+of+genes+encoding+the+crystalline+inclusion+proteins+of+Photorhabdus+luminescens+results+in+mutants+with+pleiotropic+phenotypes.">Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes.</a> J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).</li><li>Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioassay+for+homogeneous+parasporal+crystal+of+Bacillus+thuringiensis+using+the+tobacco+hornworm,+Manduca+sexta.">Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta.</a> Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).</li><li>P&#233;chy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+a+novel+gene+cluster+encoding+an+insect+toxin+in+plant-associated+strains+of+Pseudomonas+fluorescens.">Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens.</a> Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).</li><li>Nu&#241;ez-Valdez, M. E., Calder&#243;n, M. A., Aranda, E., Hern&#225;ndez, L., Ram&#237;rez-Gama, R. M., Lina, L., Rodr&#237;guez-Segura, Z., Guti&#233;rrez Mdel, C., Villalobos, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+Mexican+strain+of+Serratia+entomophila+pathogenic+against+root-damaging+larvae+of+Scarabaeidae+(Coleoptera).">Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera).</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).</li><li>Forst, S. A., Tabatabai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+histidine+kinase,+EnvZ,+in+the+production+of+outer+membrane+proteins+in+the+symbiotic-pathogenic+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus.">Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).</li><li>Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+responses+of+a+lepidopteran+insect,+Manduca+sexta.">Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta.</a> Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).</li><li>Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+recognition+proteins+in+Manduca+sexta+plasma.">Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).</li><li>Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+immune+response+to+the+entomopathogen+Photorhabdus.">Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus.</a> Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).</li><li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friend+and+foe:+the+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila.">Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).</li><li>D'Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+host+for+Pseudomonas+aeruginosa+Infection.">Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection.</a> J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).</li><li>Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+toxicity+of+Photorhabdus+luminescens+W14+toxin+complexes+in+Escherichia+coli.">Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).</li><li>Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+variation+in+Xenorhabdus+nematophila+virulence+and+suppression+of+Manduca+sexta+immunity.">Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity.</a> Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).</li><li>Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus+depresses+nodulation+reactions+to+infection+by+inhibiting+eicosanoid+biosynthesis+in+tobacco+hornworms,+Manduca+sexta.">The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).</li><li>Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+regulator+Lrp+contributes+to+mutualism,+pathogenesis+and+phenotypic+variation+in+the+bacterium+Xenorhabdus+nematophila.">The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila.</a> Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).</li><li>Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+activity+of+a+Xenorhabdus+nematophila+haemolysin+required+for+full+virulence+towards+Manduca+sexta+insects.">Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects.</a> Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).</li><li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutualism+and+pathogenesis+in+Xenorhabdus+and+Photorhabdus:+two+roads+to+the+same+destination.">Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination.</a> Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).</li><li>Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+modulation+of+immunity:+changes+within+the+feeding+period+of+the+fifth+larval+stage+in+the+defence+reactions+of+Manduca+sexta+to+infection+by+Photorhabdus.">Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus.</a> J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).</li><li>Kavanagh, K., Reeves, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+potential+of+insects+for+in+vivo+pathogenicity+testing+of+microbial+pathogens.">Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens.</a> FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).</li></ol>

La inyección directa de M. larvas sexta con bacterias entomopatógenos, como se describe aquí, sirve como un medio sencillo y eficaz para analizar la virulencia bacteriana. El método es también muy adaptable para adaptarse a diferentes sujetos experimentales y / o condiciones. Las bacterias se pueden preparar de diversas maneras antes de la inyección. En el caso de X. nematophila, las células de tipo salvaje cultivadas en rica en nutrientes Luria-Bertani (LB) a mitad de la fase log son t...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 90 mm papel de filtro </td><td> Whatman </td><td> 1001 090 </td><td></td></tr><tr><td> Filtro de vidrio titular </td><td> Millipore </td><td> XX1004700 </td><td></td></tr><tr><td> Manduca sexta huevos </td><td> Carolina Biological Supply </td><td> 143880 </td><td></td></tr><tr><td> Dieta Gypsy Moth agar + </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0296029301 </td><td></td></tr><tr><td> 5,5 oz envases de plástico y tapas </td><td> Solo Cup Company </td><td> URC55-0090-0090 PI4 </td><td></td></tr><tr><td> 1 oz envases de plástico y tapas </td><td> Dart Container Corporation </td><td> 100PC 100PCL25 </td><td></td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td></td&gt; <td></td><td> 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4, 1,46 mM KH 2 PO 4, pH 7,4 </td></tr><tr><td> Jeringa </td><td> Hamilton </td><td> 80208 </td><td> Calibre 30, 0,375 &quot;de largo, estilo, punto 2 </td></tr></tbody></table>

rearing and injection of manduca sexta larvae to assess bacterial virulence

Manduca sexta, comúnmente conocido como el gusano del tabaco, se considera una plaga agrícola importante, se alimentan de plantas solanáceas, incluyendo tabaco y tomate. La susceptibilidad de M. larvas sexta a una variedad de especies bacterianas entomopatógenos 1-5, así como la gran cantidad de información disponible sobre el sistema inmunológico del insecto 6-8, y la secuencia del genoma pendiente 9 lo convierten en un organismo modelo bueno para el uso en el estudio de la interacción huésped-microbio durante la patogénesis. Además, M. sexta larvas son relativamente grandes y fáciles de manipular y mantener en el laboratorio en relación a otras especies de insectos susceptibles. Su gran tamaño también facilita eficiente tejido / hemolinfa de extracción para el análisis de la respuesta del huésped a la infección. El método aquí presentado describe la inyección directa de bacterias en el hemocele (cavidad sangre) de M. sexta larvas. Este enfoquese puede utilizar para analizar y comparar las características de virulencia de diversas especies bacterianas, cepas o mutantes simplemente monitorizar el tiempo a la muerte del insecto después de la inyección. Este método fue desarrollado para estudiar la patogenicidad de Xenorhabdus y Photorhabdus especies, que suelen asociar con vectores de nematodos como un medio para ganar la entrada en el insecto. Nematodos entomopatógenos típicamente infectan larvas vía digestiva natural o aberturas respiratorias, y liberan su contenido de bacterias simbióticas en la hemolinfa del insecto (sangre) poco después 10. El método de inyección aquí descrito evita la necesidad de un vector de nematodos, así desacoplar los efectos de las bacterias y nematodos en el insecto. Este método permite la enumeración precisa de material infeccioso (células o proteínas) en el inóculo, que no es posible con otros métodos existentes para el análisis de entomopathogenesis, incluyendo formación de muescas 11 y los ensayos de toxicidad por vía oral 12 <em&gt;. Además, los ensayos de toxicidad por vía oral frente a la virulencia de las toxinas secretadas introducidos en el sistema digestivo de las larvas, mientras que el método de inyección directa se refiere a la virulencia de los inóculos de células enteras. La utilidad del método de inyección directa como se describe aquí es analizar la patogénesis bacteriana mediante la supervisión de mortalidad de los insectos. Sin embargo, este método puede ser fácilmente ampliado para su uso en el estudio de los efectos de la infección en el M. sexta sistema inmune. El insecto responde a la infección a través de ambas respuestas humoral y celular. La respuesta humoral se incluye el reconocimiento de bacterias asociadas con los patrones y la subsiguiente producción de diversos péptidos antimicrobianos 7, la expresión de genes que codifican estos péptidos pueden ser monitoreados posterior a la infección directa a través de la extracción de RNA y PCR cuantitativa 13. La respuesta celular a la infección implica la nodulación, encapsulación, y la fagocitosis de agentes infecciosos por hemocitos 6 </sup&gt;. Para analizar estas respuestas, insectos inyectadas pueden ser diseccionados y se visualizaron por microscopía 13, 14.

Un ejemplo representativo de un ensayo de mortalidad de los insectos se representa en la Figura 3. En este experimento, los insectos fueron inyectados con aproximadamente 50 unidades formadoras de colonias (UFC) de tipo salvaje (ATCC19061) o un mutante de la cepa atenuada (lrp 13) de Xenorhabdus nematophila crecer hasta la fase logarítmica media (n = 6 insectos por cepa). Los insectos fueron observados durante aproximadamente 72 horas, y registró el porcentaje de insectos ...

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Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

El método descrito aquí utiliza la inyección directa de bacterias entomopatógenos en el hemocele de<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Larvas de insectos.<em&gt; M. sexta</em&gt; Es un insecto disponibles comercialmente y bien estudiado. Por lo tanto, este método representa un método simple para analizar bacterianas interacción huésped-desde la perspectiva de uno o ambos socios.

Crianza y la inyección de<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Las larvas para evaluar la virulencia bacteriana

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

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Investigación

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