Name: rearing and injection of manduca sexta larvae to assess bacterial virulence
Uploaded: 2012-12-11T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence at JoVE.com

Författarna vill tacka tidigare medlemmar av Goodrich-Blair lab: Samantha Orchard, Kimberly Cowles, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Megan Menard och Youngjin Park för deras bidrag till utvecklingen av detta protokoll. Detta arbete har finansierats av National Science Foundation IOS-0950873 och National Institutes of Health NRSA gemenskap FAI084441Z.

1. Insect ägg Sterilisering och Uppfödning <ol><li> Förbered kost genom att först autoklavering 15 g av den medföljande agar i 900-1,000 ml H 2 O. Omedelbart efter autoklavering, blanda med 166 g vetegroddar kost och blanda väl i en laboratorieblandare. Häll i en skål (eller rätter) svalna, sedan överföra kost till aluminiumfolie, linda hårt, och förvara vid 4 ° C. </li><li> Vid ankomsten, sterilisera M. sexta ägg med 250 ml 0,6% blekmedel lösning för 2-3 minuter i ett glas filterh...

<ol>
	<li>Bintrim, S. B., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+inactivation+of+genes+encoding+the+crystalline+inclusion+proteins+of+Photorhabdus+luminescens+results+in+mutants+with+pleiotropic+phenotypes.">Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes.</a> J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).</li><li>Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioassay+for+homogeneous+parasporal+crystal+of+Bacillus+thuringiensis+using+the+tobacco+hornworm,+Manduca+sexta.">Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta.</a> Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).</li><li>P&#233;chy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+a+novel+gene+cluster+encoding+an+insect+toxin+in+plant-associated+strains+of+Pseudomonas+fluorescens.">Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens.</a> Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).</li><li>Nu&#241;ez-Valdez, M. E., Calder&#243;n, M. A., Aranda, E., Hern&#225;ndez, L., Ram&#237;rez-Gama, R. M., Lina, L., Rodr&#237;guez-Segura, Z., Guti&#233;rrez Mdel, C., Villalobos, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+Mexican+strain+of+Serratia+entomophila+pathogenic+against+root-damaging+larvae+of+Scarabaeidae+(Coleoptera).">Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera).</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).</li><li>Forst, S. A., Tabatabai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+histidine+kinase,+EnvZ,+in+the+production+of+outer+membrane+proteins+in+the+symbiotic-pathogenic+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus.">Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).</li><li>Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+responses+of+a+lepidopteran+insect,+Manduca+sexta.">Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta.</a> Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).</li><li>Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+recognition+proteins+in+Manduca+sexta+plasma.">Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).</li><li>Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+immune+response+to+the+entomopathogen+Photorhabdus.">Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus.</a> Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).</li><li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friend+and+foe:+the+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila.">Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).</li><li>D'Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+host+for+Pseudomonas+aeruginosa+Infection.">Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection.</a> J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).</li><li>Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+toxicity+of+Photorhabdus+luminescens+W14+toxin+complexes+in+Escherichia+coli.">Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).</li><li>Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+variation+in+Xenorhabdus+nematophila+virulence+and+suppression+of+Manduca+sexta+immunity.">Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity.</a> Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).</li><li>Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus+depresses+nodulation+reactions+to+infection+by+inhibiting+eicosanoid+biosynthesis+in+tobacco+hornworms,+Manduca+sexta.">The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).</li><li>Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+regulator+Lrp+contributes+to+mutualism,+pathogenesis+and+phenotypic+variation+in+the+bacterium+Xenorhabdus+nematophila.">The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila.</a> Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).</li><li>Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+activity+of+a+Xenorhabdus+nematophila+haemolysin+required+for+full+virulence+towards+Manduca+sexta+insects.">Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects.</a> Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).</li><li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutualism+and+pathogenesis+in+Xenorhabdus+and+Photorhabdus:+two+roads+to+the+same+destination.">Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination.</a> Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).</li><li>Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+modulation+of+immunity:+changes+within+the+feeding+period+of+the+fifth+larval+stage+in+the+defence+reactions+of+Manduca+sexta+to+infection+by+Photorhabdus.">Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus.</a> J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).</li><li>Kavanagh, K., Reeves, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+potential+of+insects+for+in+vivo+pathogenicity+testing+of+microbial+pathogens.">Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens.</a> FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).</li></ol>

Den direkta injektionen av M. sexta larver med entomopatogena bakterier, som beskrivs här, fungerar som ett enkelt och effektivt sätt att analysera bakteriell virulens. Metoden är också mycket anpassningsbar för att passa olika försökspersoner och / eller förhållanden. Bakterier kan framställas på olika sätt före injektion. I fallet X. nematophila, vildtyp celler odlade i näringsrikt Luria-Bertani (LB)-medium till mitten av log-fasen är vanligtvis den mest virulenta, dödar de flesta ell...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> 90 mm filterpapper </td><td> Whatman </td><td> 1001 090 </td><td></td></tr><tr><td> Glasfilter hållare </td><td> Millipore </td><td> XX1004700 </td><td></td></tr><tr><td> Manduca sexta ägg </td><td> Carolina Biological Supply </td><td> 143.880 </td><td></td></tr><tr><td> Gypsy Moth Kost + agar </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0296029301 </td><td></td></tr><tr><td> 5,5 oz. plastbehållare och lock </td><td> Solo Cup Company </td><td> URC55-0090 PL4-0090 </td><td></td></tr><tr><td> 1 oz. plastbehållare och lock </td><td> DART Container Corporation </td><td> 100pc 100PCL25 </td><td></td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td></td&gt; <td></td><td> 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 4 HPO, 1,46 mM KH 2 PO 4, pH 7,4 </td></tr><tr><td> Spruta </td><td> Hamilton </td><td> 80.208 </td><td> 30 gauge, 0,375 &quot;längd, punkt stil 2 </td></tr></tbody></table>

rearing and injection of manduca sexta larvae to assess bacterial virulence

Manduca sexta, allmänt känd som tobak hornworm, anses vara en betydande jordbruk skadedjur, äter Solanaceae växter som tobak och tomat. Känsligheten av M. sexta larver till en mängd olika entomopatogena bakteriearter 1-5, samt mängd information som finns tillgänglig om insekten immunförsvar 6-8, och i avvaktan på arvsmassa 9 gör det till en bra modell organism för användning i studier värd-mikrob interaktioner under patogenes. Dessutom, M. sexta larver är relativt stora och lätta att manipulera och underhålla i laboratoriet i förhållande till andra mottagliga insektsarter. Sin storlek underlättar också effektiv vävnad / hemolymfa utvinning för analys av värdens svar på infektion. Den metod som presenteras här beskriver direkt injektion av bakterier i hemocoel (blod hålighet) av M. sexta larver. Detta tillvägagångssättkan användas för att analysera och jämföra virulensen hos olika bakteriella arter, stammar eller mutanter genom att helt enkelt övervaka tiden till död insekt efter injektion. Denna metod har utvecklats för att studera sjukdomsalstrande Xenorhabdus och Photorhabdus arter, som normalt förknippar med nematod vektorer som ett sätt att få tillträde till insekten. Entomopatogena nematoder infektera normalt larver genom naturlig matsmältningssystemet eller respiratoriska öppningar, och släppa sina symbiotiska bakterier innehåll i insekten hemolymfa (blod) kort därefter 10. Injektionen här beskrivna metoden kringgår behovet av en nematod vektor, vilket frikoppling effekterna av bakterier och nematod på insekten. Denna metod tillåter en exakt räkning av infektiöst material (celler eller protein) i inokulatet, vilket inte är möjligt med andra befintliga metoder för analys entomopathogenesis inklusive nicking 11 och muntliga analyser toxicitet 12 <em&gt;. Dessutom, oral toxicitet analyser behandla virulensen hos utsöndrade toxiner som förs in i matsmältningssystemet av larver, medan den direkta injektion metod behandlar virulens av helcells-inokulat. Användbarheten av direkt insprutning metoden som beskrivs här är att analysera bakteriell patogenes genom övervakning insekt dödlighet. Emellertid kan denna metod lätt utvidgas för användning vid studier av effekterna av infektion på M. sexta immunsystem. Insekten svarar på infektion via både humorala och cellulära svar. Det humorala svaret innefattar erkännande av bakteriell-associerade mönster och efterföljande produktion av olika antimikrobiella peptider 7, uttrycket av gener som kodar för dessa peptider kan övervakas efter direkt infektion via RNA-extraktion och kvantitativ PCR 13. Det cellulära svar på infektion innebär nodulation, inkapsling och fagocytos av smittämnen som hemocyter 6 </sup&gt;. För att analysera dessa svar kan injiceras insekter kan dissekeras och visualiseras genom mikroskopi 13, 14.

Ett representativt exempel på en insekt dödlighet analys avbildas i figur 3. I detta experiment, var insekter injicerades med ca 50 kolonibildande enheter (CFU) av antingen vildtyp (ATCC19061) eller en försvagad mutant stam (LRP 13) i Xenorhabdus nematophila odlades till mitten av log-fasen (n = 6 insekter per stam). Insekter observerades under ca 72 timmar, och procent av injicerade insekter lever vid varje tidpunkt registreras. I detta fall, uppvisade den försvagade st...

Watch this Scientific Journal Video about Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence at JoVE.com

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Den här beskrivna metoden utnyttjar direktinsprutning av entomopatogena bakterier i hemocoel av<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Insektslarver.<em&gt; M. sexta</em&gt; Är en kommersiellt tillgänglig och väl studerade insekt. Således representerar denna metod en enkel metod för att analysera värd-bakteriella interaktioner ur ett eller båda parter.

Uppfödning och Injektion av<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Larver att bedöma bakteriell Virulens

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliv, spottkörtel och hemolymfa Collection från Ixodes scapularis fästingar

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation och multi fenotypisk Hög halt Screening av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutanter

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Tillämpa ett inducerbart uttryck system att studera Störningar av bakteriell Virulensfaktorer med intracellulära signal

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

Zebrafisk som en modell för bedömning av teratogena potential Nitrit

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of ...

The Madagascar Hissing Cockroach as an Alternative Non-mammalian Animal Model to Investigate Virulence, Pathogenesis, and Drug Efficacy

Madagaskar väsande kackerlacka som en alternativ icke däggdjur djurmodell att undersöka virulens, patogenes och drogen effekt

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identifiering av virulens markörer för Mycobacterium abscessus för intracellulär replikering i fagocyter

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Utvärderande virulens och patogenesen av Aeromonas infektion i Caenorhabditis elegans modell

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En hög genomströmning Shigella-specifika bakteriedödande analysmetod

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Lägre dödande Assay att bedöma immunologiska reaktion mot bakteriella patogener

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...