Name: rearing and injection of manduca sexta larvae to assess bacterial virulence
Uploaded: 2012-12-11T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence at JoVE.com

Yazarlar Goodrich-Blair laboratuar geçmiş üyelerine teşekkür etmek istiyorum: Samantha Orchard, Kimberly Cowles, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Megan Menard ve Youngjin Park bu protokolün gelişmesine katkılarından dolayı. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı Hibe IOS-0950873 ve Sağlık NRSA dostluk FAI084441Z Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edildi.

1. Böcek Yumurta Sterilizasyon ve Yetiştirilmesi <ol><li> 900-1,000 ml H 2 O içinde sağlanan agar ilk otoklavlanarak 15 g diyet hazırlayın Hemen sonra iyi bir laboratuvar blender 166 gr buğday tohumu diyet ve harmanı ile otoklav, karıştırın. 4 de alüminyum folyo için diyet aktarmak, ardından serinlemek için bir tabak (veya yemekleri) dökün, sıkıca sarın ve mağaza ° C </li><li> Girişte, M. sterilize ara sıra karıştırarak, 90 mm ​​filtre kağıdı ile bir cam filtre tu...

<ol>
	<li>Bintrim, S. B., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+inactivation+of+genes+encoding+the+crystalline+inclusion+proteins+of+Photorhabdus+luminescens+results+in+mutants+with+pleiotropic+phenotypes.">Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes.</a> J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).</li><li>Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioassay+for+homogeneous+parasporal+crystal+of+Bacillus+thuringiensis+using+the+tobacco+hornworm,+Manduca+sexta.">Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta.</a> Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).</li><li>P&#233;chy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+a+novel+gene+cluster+encoding+an+insect+toxin+in+plant-associated+strains+of+Pseudomonas+fluorescens.">Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens.</a> Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).</li><li>Nu&#241;ez-Valdez, M. E., Calder&#243;n, M. A., Aranda, E., Hern&#225;ndez, L., Ram&#237;rez-Gama, R. M., Lina, L., Rodr&#237;guez-Segura, Z., Guti&#233;rrez Mdel, C., Villalobos, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+Mexican+strain+of+Serratia+entomophila+pathogenic+against+root-damaging+larvae+of+Scarabaeidae+(Coleoptera).">Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera).</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).</li><li>Forst, S. A., Tabatabai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+histidine+kinase,+EnvZ,+in+the+production+of+outer+membrane+proteins+in+the+symbiotic-pathogenic+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus.">Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).</li><li>Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+responses+of+a+lepidopteran+insect,+Manduca+sexta.">Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta.</a> Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).</li><li>Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+recognition+proteins+in+Manduca+sexta+plasma.">Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).</li><li>Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+immune+response+to+the+entomopathogen+Photorhabdus.">Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus.</a> Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).</li><li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friend+and+foe:+the+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila.">Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).</li><li>D'Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+host+for+Pseudomonas+aeruginosa+Infection.">Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection.</a> J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).</li><li>Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+toxicity+of+Photorhabdus+luminescens+W14+toxin+complexes+in+Escherichia+coli.">Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).</li><li>Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+variation+in+Xenorhabdus+nematophila+virulence+and+suppression+of+Manduca+sexta+immunity.">Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity.</a> Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).</li><li>Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus+depresses+nodulation+reactions+to+infection+by+inhibiting+eicosanoid+biosynthesis+in+tobacco+hornworms,+Manduca+sexta.">The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).</li><li>Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+regulator+Lrp+contributes+to+mutualism,+pathogenesis+and+phenotypic+variation+in+the+bacterium+Xenorhabdus+nematophila.">The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila.</a> Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).</li><li>Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+activity+of+a+Xenorhabdus+nematophila+haemolysin+required+for+full+virulence+towards+Manduca+sexta+insects.">Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects.</a> Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).</li><li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutualism+and+pathogenesis+in+Xenorhabdus+and+Photorhabdus:+two+roads+to+the+same+destination.">Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination.</a> Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).</li><li>Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+modulation+of+immunity:+changes+within+the+feeding+period+of+the+fifth+larval+stage+in+the+defence+reactions+of+Manduca+sexta+to+infection+by+Photorhabdus.">Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus.</a> J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).</li><li>Kavanagh, K., Reeves, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+potential+of+insects+for+in+vivo+pathogenicity+testing+of+microbial+pathogens.">Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens.</a> FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).</li></ol>

M. direkt enjeksiyon Burada açıklandığı gibi entomopatojen bakterilerle Sexta larva, bakteriyel virulans analiz için basit ve etkili bir araç olarak hizmet vermektedir. Yöntemi farklı deneysel konularda ve / veya koşullara göre aynı zamanda son derece uyarlanabilir. Bakteriler enjeksiyon öncesinde çeşitli şekillerde hazırlanabilir. X&#39;in durumda nematophila, orta-günlük faz besin açısından zengin Luria-Bertani (LB) ortamda yetişen yabani türü hücre enjeksi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 90 mm filtre kağıdı </td><td> Whatman </td><td> 1001 090 </td><td></td></tr><tr><td> Cam filtre tutucusu </td><td> Millipore </td><td> XX1004700 </td><td></td></tr><tr><td> Manduca Sexta yumurta </td><td> Carolina Biological Supply </td><td> 143880 </td><td></td></tr><tr><td> Gypsy Moth Diyet + agar </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0296029301 </td><td></td></tr><tr><td> 5.5 oz. Plastik kaplar ve kapakları </td><td> Yalnız Kupası Şirketi </td><td> URC55-0090 PL4-0090 </td><td></td></tr><tr><td> 1 oz. Plastik kaplar ve kapakları </td><td> DART Konteyner A.Ş. </td><td> 100PC 100PCL25 </td><td></td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td></td&gt; <td></td><td> 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM 2 Na HPO 4, 1,46 mM KH 2 PO 4, pH 7.4 &#39; </td></tr><tr><td> Şırınga </td><td> Hamilton </td><td> 80208 </td><td> 30 gauge, 0.375 &quot;uzunluğunda, gelin tarzı 2 </td></tr></tbody></table>

rearing and injection of manduca sexta larvae to assess bacterial virulence

Yaygın olarak bilinen bir tütün hornworm Manduca Sexta, domates ve tütün içeren solanaceous bitkilerle beslenen, önemli bir tarımsal zararlıların olarak kabul edilir. M. duyarlılık entomopatojenik bakteri türleri 1-5, hem de böcek bağışıklık sistemi 6-8 ile ilgili olarak mevcut olan bilgi birikimini çeşitli Sexta larva ve beklemede olan genom sekansı 9 bu konak-mikrop etkileşimleri araştırılmasında kullanım için iyi bir model organizma yapmak patogenezi sırasında. Buna ek olarak, M. Sexta larvaları diğer duyarlı böcek türüne laboratuar göreli olarak işlemek ve sürdürmek için nispeten büyük ve kolay. Onların büyük boyutu da enfeksiyona konak yanıtının analizi için etkili doku / hemolimf ekstraksiyon kolaylaştırır. Burada sunulan yöntem M. hemocoel içine bakterilerin direkt enjeksiyon (kan boşluğu) açıklar Sexta larva. Bu yaklaşımsadece enjeksiyonundan sonra böcek ölüme zaman izleyerek, çeşitli bakteri türleri, suşları, ya da mutantlarının virülans özelliklerini incelemek ve karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu yöntem genellikle böcek girmesinden kazanmak için bir araç olarak nematod vektörleri ile ilişkilendirmek Xenorhabdus ve Photorhabdus türlerin patojenite incelemek için geliştirilmiştir. Entomopatojen nematodlar genellikle doğal sindirim veya solunum açıklıklar yoluyla larva enfekte ve böcek hemolimf (kan) kısa bir süre sonra 10 içine onların simbiyotik bakteri içeriğini yayınlayacak. Burada açıklanan yöntem ve böylece enjeksiyon böcek üzerinde bakteri ve nematod etkileri ayrılmasının bir nematod vektör için ihtiyaç atlar. Bu yöntem, nickleme 11 ve oral toksisite deneyleri 12 de dahil olmak üzere, entomopathogenesis analiz etmek için var olan diğer yöntemler kullanılarak mümkün değildir inokulum, içinde bulaşıcı malzemenin doğru sayımı (hücre ya da protein) için olanak sağlar <edirekt enjeksiyon yöntemi tam hücreli inokulum virülans adresleri ise m&gt;. Ayrıca, oral toksisite testleri, larvaların sindirim sistemine girmiş salgılanan toksinler virülans ele. Burada açıklandığı gibi direkt enjeksiyon yöntemi programı Böcek ölümleri takip ederek bakteriyel patogenez analiz etmektir. Bununla birlikte, bu metod M. üzerindeki enfeksiyon üzerindeki etkilerini araştırmak kullanılmak üzere genişletilebilir Sexta bağışıklık sistemi. Böcek humoral ve hücresel yanıtları hem yoluyla enfeksiyona yanıt verir. Beden irinterine ait tepki ile ilişkili bakteri desen ve tanıma farklı antimikrobiyal peptitler daha sonraki üretim 7 içerir; bu peptitlerin kodlayan genlerin ekspresyonu RNA ekstraksiyonu ve PCR kantitatif 13 aracılığıyla doğrudan enfeksiyonu takiben izlenebilir. Enfeksiyon hücresel yanıt nodülasyon, kapsülleme ve hemocytes 6 Enfeksiyöz ajanlar fagositozu içerir </sup&gt;. Bu tepkileri analiz etmek için, enjekte böcekler disseke ve mikroskopi 13, 14 tarafından görüntülenebilir.

Böcek ölümleri bir tahlil temsili bir örneği Şekil 3&#39;te gösterilmektedir. Bu deneyde, böcekler ya da vahşi tip (ATCC19061) veya orta-log fazı (zorlanma başına n = 6 böcekler) için yetiştirilen Xenorhabdus nematophila bir zayıflatılmış mutant suşu (LRP 13) yaklaşık 50 koloni oluşturan birim (CFU) enjekte edildi. Böcekler yaklaşık olarak 72 saat süre ile izlenir ve her bir timepoint hâlâ hayatta enjekte edilen böceklerin yüzde kaydedildi. Bu ...

Watch this Scientific Journal Video about Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence at JoVE.com

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Yöntemin hemocoel içine entomopatojenik bakteri doğrudan enjeksiyon kullanır burada açıklanan<em&gt; Manduca Sexta</em&gt; Böcek larvaları.<em&gt; M. Sexta</em&gt; Piyasada bulunan ve iyi çalışılmış böcek türüdür. Bu nedenle, bu yöntem, bir veya her iki ortağın perspektifinden konak-bakteri etkileşimleri analiz için basit bir yaklaşımı temsil etmektedir.

Ve Yetiştirme ve Enjeksiyon<em&gt; Manduca Sexta</emBakteriyel virülans Değerlendirememesi&gt; Larva

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ixodes scapularis Keneler gelen tükürük, Tükürük Bezi ve hemolimf Koleksiyonu

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Bir uyarılabilir İfade Sistemi uygulamak Hücre içi Sinyali ile Bakteriyel Virulans Faktörler Girişim Eğitim için

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

Bir Model Olarak Zebra balığı Nitrit teratojenik potansiyelini değerlendirmek için

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of ...

The Madagascar Hissing Cockroach as an Alternative Non-mammalian Animal Model to Investigate Virulence, Pathogenesis, and Drug Efficacy

Hamam böceği virülans, Patogenez ve uyuşturucu etkinliği araştırmak için alternatif bir Non-memeli hayvan Model tıslama Madagaskar

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Mycobacterium abscessus virülans işaretleri tanımlaması fagositler hücre içi çoğaltma için

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Virülans ve Aeromonas enfeksiyon Caenorhabditis elegans modelindeki patogenezinde değerlendirilmesi

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Bir yüksek-den geçerek Shigella-belirli bakterisidal tahlil

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Opsonophagocytic öldürme tahlil bakteriyel patojenlere karşı immünolojik yanıt değerlendirmek için

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...