Name: assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes
Uploaded: 2013-01-07T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes at JoVE.com

وأيد هذا العمل من خلال منحة من المعاهد القومية للصحة، والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى، 2R01DK59558 (لGN). قدم معهد بحوث UAMS بالحركة بدعم من المعاهد الوطنية للصحة المركز الوطني للبحوث منحة UL1 الموارد RR029884 التمويل الجزئي لقياس التدفق الخلوي في كور UAMS. نشكر الدكتور Peipei بينغ (جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس، لوس أنجلوس، CA) لتوفير قسامة من اتش يحمل الترميز [كدنا] متحولة السلبية (غير نشط) المهيمن PKC-ε، والدكتور ألين Samarel (جامعة لويولا الطبي؛ مايوود، IL) لتوفير قسامة من ناقلات الغدانية ترميز متحولة بالموقع جوهري من PKC-ε. كما نشكر الدكاترة. بيتر باركر وسودن بيتر (إمبريال كوليدج لندن، لندن، المملكة المتحدة) لتوفير الترميز [كدنا] نشطة جوهري PKC-ε.

1. عزل الأنابيب الصغيرة الكلوي الدانية للثقافة الأولية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الأرنب والمكوس الكليتين ووضعها في طبق بتري مليئة العازلة الإعدادية العقيمة (DMEM/F12 متوسطة) في الصفحي هود التدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفوسفات مخزنة ي?...

<ol>
	<li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+culture+conditions+stimulate+gluconeogenesis+in+primary+cultures+of+renal+proximal+tubule+cells.">Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells.</a> Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).</li><li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-ascorbic+acid+regulates+growth+and+metabolism+of+renal+cells:+improvements+in+cell+culture.">L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture.</a> Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).</li><li>Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-selective+activation+of+protein+kinase+C+by+nitric+oxide+in+the+heart+of+conscious+rabbits:+a+signaling+mechanism+for+both+nitric+oxide-induced+and+ischemia-induced+preconditioning.">Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning.</a> Circ. Res. 84, 587-604 (1999).</li><li>Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+both+Raf+and+Ras+is+necessary+for+activation+of+transcription+of+the+human+T+cell+receptor+beta+gene+by+protein+kinase+C,+Ras+plays+multiple+roles.">Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles.</a> J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).</li><li>Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#949;+activation+induces+mitochondrial+dysfunction+and+fragmentation+in+renal+proximal+tubules.">Protein kinase C-&#949; activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).</li><li>Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+ERK1/2+pathway+mediates+oxidant-induced+decreases+in+mitochondrial+function+in+renal+cells.">Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).</li><li>Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+activation+improves+oxidative+phosphorylation+in+renal+proximal+tubular+cells+following+nephrotoxicant+injury.">Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).</li><li>Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#945;+and+ERK1/2+mediate+mitochondrial+dysfunction,+decreases+in+active+Na++transport,+and+cisplatin-induced+apoptosis+in+renal+cells.">Protein kinase C-&#945; and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).</li><li>Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-+a+inhibits+the+repair+of+oxidative+phosphorylation+after+S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine+injury+in+renal+cells.">Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).</li><li>Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+a+functional+p21WAF1/CIP1+gene+accelerates+caspase-independent+apoptosis+induced+by+cisplatin+in+renal+cells.">Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+renal+cell+apoptosis:+caspase+3-dependent+and+-independent+pathways.">Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).</li></ol>

النهج المقدمة هنا يسمح للoverexpression من نظائر الانزيمات الفردية PKC في الثقافة الأساسية للخلايا الكلى أنبوبي القريبة. هناك العديد من نقاط القوة لهذا النهج: 1. لأنها تتيح للتحقيق في الآليات التنظيمية في عدد السكان متجانسة من الخلايا (خلايا الكلى الأنبوبي الداني) التي هي ال?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td></tr><tr><td> الصفحي تدفق هود </td><td> شركة الكترون الحرارية </td><td> FORMA 1104 </td></tr><tr><td> 2 مل و 15 مل الأنسجة Dounce طاحونة </td><td> ويتون </td><td> 989-24607، 357544 </td></tr><tr><td> 85 و 235 ميكرون شبكة النايلون </td><td> قطع صغيرة </td><td> CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD </td></tr><tr><td> 50 مل أنبوب الطرد المركزي العقيمة </td><td> BIOLOGIX </td><td> BCT-P 50BS </td></tr><tr><td> 1.5 مل أنبوب الصغيرة </td><td> Sarstedt </td><td> 72.690.001 </td></tr><tr><td> 35 × 10 مم الأطباق ثقافة عقيمة </td><td> كورنينج </td><td> 430165 </td></tr><tr><td> جوعان جهاز طرد مركزي </td><td> جوعان </td><td> جوعان CR3 11175704 الدوار: جوعان T40 </td></tr><tr&gt; <td> قابل للتعديل الجزئي الطرد المركزي </td><td> SIGMA </td><td> نموذج 1 حتي 15 </td></tr><tr><td> الأكسجين البيولوجي مراقب </td><td> YSI للإعلام </td><td> YSI الموديل 5300A </td></tr><tr><td> واحد الأكسجين الجزئي غرفة النظام </td><td> YSI للإعلام </td><td> 5356S </td></tr><tr><td> دقق الأكسجين </td><td> YSI للإعلام </td><td> 5331A </td></tr><tr><td> تعميم حمام </td><td> YSI للإعلام </td><td> 5310 </td></tr><tr><td> بوكل وستاندرد كيت غشاء </td><td> YSI للإعلام </td><td> 5775 </td></tr><tr><td> النمام المغناطيسي </td><td> YSI للإعلام </td><td> 5222 </td></tr><tr><td> مسطحة مسجل </td><td> كيب وZONEN </td><td> BD 11E </td></tr><tr><td> 48-96-جيدا وكذلك لوحات شفافة </td><td> COSTAR </td><td> 3548، 3679 </td></tr><tr><td> Thermomixer R </td><td> Eppendorf </td><td> 5355 21919 </td></tr><tr><td> شاكر المداري MAXQ 2000 </td><td> الحرارية العلمية </td><td> SHKA 2000 </td></tr><tr><td> أطياف FLUOR زائد (الامتصاصية / مضان / التلألؤ القارئ) </td><td> TECAN </td><td> F129005 </td></tr><tr><td> المياه جاكت الولايات المتحدة Autoflow التلقائية CO 2 حاضنة </td><td> NUAIRE </td><td> NU 4850 </td></tr><tr><td> 12x75 الثقافة أنابيب الاختبار البوليسترين مم للالتدفق الخلوي </td><td> فيشر العلامة التجارية </td><td> 14-961-20 </td></tr><tr><td> Axioskop الهدف المياه الغمر 63x / 0،90 W </td><td> كارل زايس </td><td> 114846 ACHROPLAN 44 00 67 </td></tr><tr><td> DMEM / F12 </td><td> Cellgro </td><td> 99 حتي 830 - PB </td></tr><tr><td> DMEM / F12 هام </td><td> سيجما </td><td> D 2906 - 1L </td></tr><tr><td> ديفيروكسامين Mesylate </td><td> Hospiرا </td><td> D110 </td></tr><tr><td> النوع الأول كولاجيناز </td><td> ورثينجتون </td><td> 4196 </td></tr><tr><td> التربسين المانع </td><td> سيجما </td><td> T 6522 - 500mg </td></tr><tr><td> 5،5 &#39;، 6،6&#39;-ثلاثي كلورو 1، 1 &#39;، 3،3&#39;-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine يوديد (JC-1) </td><td> إينفيتروجن </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Mitotracker الأحمر </td><td> إينفيتروجن </td><td> M22425 </td></tr><tr><td> ATP ضوء بارد الفحص كيت HS II </td><td> روش </td><td> 11 699 709 001 </td></tr><tr><td> Annexin V - FITC الحل </td><td> BioVision </td><td> 1001 - 200 </td></tr><tr><td> تدفق عداد الكريات </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> BD FACSCalibur </td></tr></tbody></table>

assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes

ويشارك البروتين كيناز C (بي كي سي) عائلة من نظائر الانزيمات في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية. البيانات المتوفرة لدينا تثبت أن الأخيرة PKC ينظم وظيفة الميتوكوندريا الخلوية وحالة الطاقة. تقارير عديدة أثبتت أن تفعيل ε-PKC PKC واحد ويحسن وظيفة الميتوكوندريا في القلب الإقفاري ويتوسط كارديوبروتيكتيون. في المقابل، أظهرت لنا أن تشارك PKC-α وPKC ε في nephrotoxicant التي يسببها ضعف الميتوكوندريا وموت الخلايا في خلايا الكلى. ولذلك، كان الهدف من هذه الدراسة هو تطوير نموذج في المختبر من خلايا الكلى الحفاظ على الوظائف في الميتوكوندريا بالموقع نظائر الانزيمات التي يمكن تفعيلها بشكل انتقائي أو PKC تحول دون لتحديد دورها في تنظيم الفسفرة المؤكسدة وبقاء الخلية. تم زراعة الخلايا الأولية الثقافات الكلوي أنبوبي القريبة (RPTC) في ظروف أفضل مما أسفر عن التنفس ونشاط الميتوكوندريا ميتوchondrial الانزيمات مماثلة لتلك التي في RPTC في الجسم الحي. لأن التقنيات التقليدية ترنسفكأيشن (Lipofectamine، الصعق الكهربائي) غير فعالة في الثقافات الأولية ولها آثار ضارة على وظيفة الميتوكوندريا، تم تسليم PKC-ε cDNAs متحولة إلى RPTC من خلال ناقلات الغدانية. هذا النهج القائم على النتائج في ترنسفكأيشن أكثر من 90٪ RPTC مثقف. هنا، نقدم طرق لتقييم دور PKC-ε في: 1. تنظيم التشكل الميتوكوندريا وظائف المرتبطة توليف ATP، و 2. بقاء RPTC في الثقافة الأولية. يتم تنشيط PKC-ε بواسطة overexpressing النشط جوهري PKC-ε متحولة. هو تحول دون PKC-ε بواسطة overexpressing متحولة غير نشط من PKC-ε. ويتم تقييم وظيفة الميتوكوندريا عن طريق فحص التنفس، سلامة السلسلة التنفسية، وأنشطة الجهاز التنفسي والمجمعات F 0 F 1-أتباز، ATP معدل الإنتاج، والمحتوى ATP. التنفس هوssessed في ديجيتونين-permeabilized RPTC كدولة 3 (التنفس القصوى في وجود ركائز الزائدة وADP) وفكت التنفس. يتم تقييم سلامة السلسلة التنفسية عن طريق قياس أنشطة جميع مجمعات أربعة من السلسلة التنفسية في الميتوكوندريا المعزولة. يتم تقييم قدرة الفسفرة المؤكسدة عن طريق قياس القدرة غشاء الميتوكوندريا، ATP معدل الإنتاج، ونشاط F 0 F 1-أتباز. ويتم تقييم الحالة من الطاقة RPTC من خلال تحديد المحتوى ATP داخل الخلايا. وتصور مورفولوجيا الميتوكوندريا في الخلايا الحية باستخدام الأحمر MitoTracker 580، صبغة الفلورسنت التي تتراكم على وجه التحديد في الميتوكوندريا، وmonolayers حية يتم فحصها تحت المجهر الفلورسنت. ويتم تقييم جدوى استخدام RPTC annexin V / propidium تلطيخ يوديد تليها التدفق الخلوي لتحديد الخلايا وورام. تسمح هذه الطرق لتفعيل انتقائي / تثبيط نظائر الانزيمات PKC الفرديةلتقييم دورها في الوظائف الخلوية في مجموعة متنوعة من الظروف الفسيولوجية والمرضية التي يمكن أن تكون مستنسخة في في المختبر.

الشكل 1 يبين أن تسليم الغدانية من [كدنا] ترميز بالموقع جوهري (caPKC-ε) وغير نشطة (dnPKC-ε) من المسوخ PKC-ε النتائج في مستويات البروتين زيادة كبيرة في ε-PKC في RPTC والميتوكوندريا. overexpressed الخلايا المصابة مع [كدنا] تحمل ناقلات caPKC-ε في فسفرته (نشط) شكل ε-PKC بينما الخلايا المصا?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes at JoVE.com

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

ويرد وصف آثار تفعيل نظائر الانزيمات بروتين كيناز (بي كي سي) C على وظائف الميتوكوندريا المرتبطة التنفس والفسفرة المؤكسدة وعلى بقاء الخلية. النهج يتكيف تقنية الغدانية إلى overexpress انتقائي نظائر الانزيمات PKC في الثقافة الخلية الأولية ومجموعة متنوعة من فحوصات لتحديد وظائف الميتوكوندريا والطاقة حالة من الخلية.

تقييم وظائف الميتوكوندريا وبقاء الخلية في خلايا الكلى البروتين Overexpressing نظائر الانزيمات C كيناز

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Research

JoVE Journal

Biology

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

العد وتحديد صلاحية خلايا مثقف

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

تفعيل موت الخلايا المبرمج من قبل Microinjection هيولي من السيتوكروم ج</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

تقييم التعبير GFP واستمرار استخدام يستند إلى صورة طالي عداد الكريات

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Viability Assays for Cells in Culture

فحوصات قابلية للخلايا في الثقافة

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

المناهج التجريبية لدراسة الميتوكوندريا التعريب وظيفة من دورة الخلية النووية كيناز، Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

قياس وقت واحد من الميتوكوندريا الكالسيوم والميتوكوندريا غشاء المحتملة في الخلايا الحية التي كتبها نيون الميكروسكوب

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

الثقافة الأولية من خلايا الفئران البطاني وفحوصات لوظائف ستيرويدوجينيك

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

تحفيز الصور بواسطة ليزر Femtosecond ينشط إشارات الكيناز (ERK) أو أحداث الميتوكوندريا في الخلايا المستهدفة

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

تحسين دقة التقييم السيتومتري للتدفق لإمكانات الغشاء الميتوكوندريا في الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف من خلال تثبيط مضخات Efflux

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...