Name: assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes
Uploaded: 2013-01-07T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de National Institutes of Health, Nationaal Instituut voor Diabetes en Maag-, Darm-en nierziekten, 2R01DK59558 (aan GN). UAMS Translationeel Onderzoek Instituut ondersteund door de National Institutes of Health National Center for Research Resources subsidie ​​UL1 RR029884 voorzien gedeeltelijke financiering voor flowcytometrie Core bij UAMS. Wij danken Dr Peipei Ping (Universiteit van Californië in Los Angeles, Los Angeles, CA) voor het verstrekken van een hoeveelheid van adenovirus dat cDNA draagt ​​het coderen van de dominante negatieve (niet actief) mutant van PKC-ε en Dr Allen Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) voor het verschaffen van een hoeveelheid van adenovirale vector coderende de constitutief actieve mutant van PKC-ε. We danken ook Drs. Peter Parker en Peter Sugden (Imperial College London, Londen, UK) voor het verstrekken van cDNA dat codeert constitutief actief PKC-ε.

1. Isolatie van renale proximale tubuli voor primaire Cultuur <ol><li> Verdoven het konijn, accijnzen beide nieren en leg ze in een petrischaal gevuld met steriele prep buffer (DMEM/F12-medium) in een laminaire stroming kap. </li><li> Perfuseren elke nier met 50 ml buffer prep gevolgd door 50 ml steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing, pH 7,4 (PBS), en PBS-oplossing ijzeroxide (45 ml + 5 ml). De-capsulate nieren en overbrengen naar de prep buffer met deferoxamine. </li><li> Oogst de cortex van elke nier. </li><li> H...

<ol>
	<li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+culture+conditions+stimulate+gluconeogenesis+in+primary+cultures+of+renal+proximal+tubule+cells.">Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells.</a> Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).</li><li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-ascorbic+acid+regulates+growth+and+metabolism+of+renal+cells:+improvements+in+cell+culture.">L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture.</a> Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).</li><li>Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-selective+activation+of+protein+kinase+C+by+nitric+oxide+in+the+heart+of+conscious+rabbits:+a+signaling+mechanism+for+both+nitric+oxide-induced+and+ischemia-induced+preconditioning.">Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning.</a> Circ. Res. 84, 587-604 (1999).</li><li>Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+both+Raf+and+Ras+is+necessary+for+activation+of+transcription+of+the+human+T+cell+receptor+beta+gene+by+protein+kinase+C,+Ras+plays+multiple+roles.">Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles.</a> J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).</li><li>Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#949;+activation+induces+mitochondrial+dysfunction+and+fragmentation+in+renal+proximal+tubules.">Protein kinase C-&#949; activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).</li><li>Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+ERK1/2+pathway+mediates+oxidant-induced+decreases+in+mitochondrial+function+in+renal+cells.">Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).</li><li>Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+activation+improves+oxidative+phosphorylation+in+renal+proximal+tubular+cells+following+nephrotoxicant+injury.">Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).</li><li>Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#945;+and+ERK1/2+mediate+mitochondrial+dysfunction,+decreases+in+active+Na++transport,+and+cisplatin-induced+apoptosis+in+renal+cells.">Protein kinase C-&#945; and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).</li><li>Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-+a+inhibits+the+repair+of+oxidative+phosphorylation+after+S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine+injury+in+renal+cells.">Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).</li><li>Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+a+functional+p21WAF1/CIP1+gene+accelerates+caspase-independent+apoptosis+induced+by+cisplatin+in+renal+cells.">Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+renal+cell+apoptosis:+caspase+3-dependent+and+-independent+pathways.">Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).</li></ol>

De hier gepresenteerde benadering maakt overexpressie van individuele isozymen van PKC in de primaire kweek van renale proximale tubulaire cellen. Er zijn verschillende sterke punten van deze aanpak: 1. Het maakt voor het onderzoeken regulerende mechanismen in een homogene celpopulatie (renale proximale tubulaire cellen) die het primaire doel voor verschillende insults (ischemie, hypoxia, oxidatieve stress), drugs en nephrotoxicants in de nier. 2. Mitochondriële functies in deze in vitro model van RPTC gekweek...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Laminaire stroming kap </td><td> Thermo Electron Corporation </td><td> FORMA 1104 </td></tr><tr><td> 2 ml en 15 ml Dounce weefsel slijpmachine </td><td> WHEATON </td><td> 989-24.607, 357544 </td></tr><tr><td> 85 en 235 micron nylon mesh </td><td> Kleine onderdelen </td><td> CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD </td></tr><tr><td> 50 ml steriele centrifugebuis </td><td> BIOLOGIX </td><td> BCT-P 50BS </td></tr><tr><td> 1,5 ml micro tube </td><td> Sarstedt </td><td> 72.690.001 </td></tr><tr><td> 35 x 10 mm steriel kweekschaaltjes </td><td> Corning </td><td> 430165 </td></tr><tr><td> Jouan Centrifuge </td><td> Jouan </td><td> Jouan CR3 11175704 Rotoren: Jouan T40 </td></tr><tr&gt; <td> Verstelbare micro-centrifuge </td><td> SIGMA </td><td> Model 1 tot 15 </td></tr><tr><td> Biologische Zuurstof Monitor </td><td> YSI Incorporated </td><td> YSI Model 5300A </td></tr><tr><td> Single Kamer Micro Oxygen System </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5356S </td></tr><tr><td> Zuurstofsonde </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5331A </td></tr><tr><td> Circulerende Bath </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5310 </td></tr><tr><td> KCl en Standard Membraan kit </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5775 </td></tr><tr><td> Magneetroerder </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5222 </td></tr><tr><td> Flatbed Recorder </td><td> Kipp &amp; Zonen </td><td> BD 11E </td></tr><tr><td> 48-well en 96-well platen transparant </td><td> Costar </td><td> 3548, 3679 </td></tr><tr><td> Thermomixer R </td><td> Eppendorf </td><td> 5355 21919 </td></tr><tr><td> Schudapparaat MaxQ 2000 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SHKA 2000 </td></tr><tr><td> Spectra FLUOR Plus (absorptie / fluorescentie / luminescentie-lezer) </td><td> Tecan </td><td> F129005 </td></tr><tr><td> Watermantel Amerikaanse Autoflow Automatische CO 2 Incubator </td><td> NUAIRE </td><td> NU 4850 </td></tr><tr><td> 12x75 mm polystyreen cultuur reageerbuizen voor flowcytometrie </td><td> Fisher Brand </td><td> 14-961-20 </td></tr><tr><td> Axioskop Water immersie objectief 63x / 0,90 W </td><td> Carl Zeiss </td><td> 114846 ACHROPLAN 44 00 67 </td></tr><tr><td> DMEM / F12 </td><td> Cellgro </td><td> 99 tot 830 - PB </td></tr><tr><td> DMEM / Ham F12 </td><td> Sigma </td><td> D 2906 - 1L </td></tr><tr><td> Deferoxamine mesylaat </td><td> Hospira </td><td> D110 </td></tr><tr><td> Type I collagenase </td><td> Worthington </td><td> 4196 </td></tr><tr><td> Trypsineremmer </td><td> Sigma </td><td> T 6522 - 500mg </td></tr><tr><td> 5,5 &#39;, 6,6&#39;-tetrachloor-1, 1 &#39;, 3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine jodide (JC-1) </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Mitotracker Rood </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 </td></tr><tr><td> ATP Bioluminescentie Assay Kit GS II </td><td> Roche </td><td> 11 699 709 001 </td></tr><tr><td> Annexine V - FITC oplossing </td><td> BioVision </td><td> 1001 - 200 </td></tr><tr><td> Flowcytometer </td><td> BD Biosciences </td><td> BD FACSCalibur </td></tr></tbody></table>

assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes

Het eiwit kinase C (PKC) familie van isoenzymen betrokken bij talrijke fysiologische en pathologische processen. Onze recente gegevens tonen aan dat PKC de mitochondriale functie en cellulaire energie status regelt. Talrijke rapporten aangetoond dat de activatie van PKC-a en PKC-ε mitochondriale functie in het ischemische hart en bemiddelt cardioprotectie verbetert. Daarentegen hebben we aangetoond dat PKC-α en PKC-ε zijn betrokken bij nephrotoxicant geïnduceerde mitochondriale dysfunctie en celdood in niercellen. Daarom is het doel van deze studie was een in vitro model van niercellen handhaven actief mitochondriële functies waarin PKC-isozymen kunnen selectief worden geactiveerd of geremd functioneel kunnen de regulatie van oxidatieve fosforylering en celoverleving ontwikkelen. Primaire kweken van renale proximale tubulaire cellen (RPTC) werden gekweekt in omstandigheden die leiden tot verbeterde mitochondriale respiratie en activiteit van mitochondrial enzymen vergelijkbaar met die in RPTC in vivo. Omdat traditionele transfectietechnieken (Lipofectamine, elektroporatie) zijn inefficiënt in primaire culturen en negatieve effecten hebben op de mitochondriale functie, werden PKC-ε mutant cDNA&#39;s geleverd aan RPTC door adenovirale vectoren. Deze aanpak resulteert in een transfectie van meer dan 90% gekweekte RPTC. Hier geven we methodes om de rol van PKC-ε in: 1. regulering van mitochondriale morfologie en de functies van ATP-synthese, en 2. overleving van RPTC in primaire cultuur. PKC-ε wordt geactiveerd door overexpressie de constitutief actieve mutant PKC-ε. PKC-ε wordt geremd door overexpressie de inactieve mutant van PKC-ε. Mitochondriale functie wordt beoordeeld door onderzoeken ademhaling, integriteit van de ademhalingsketen, activiteiten van respiratoire complexen en F 0 F 1-ATPase, productiesnelheid ATP en ATP content. Ademhaling is eenssessed in digitonine-permeabel RPTC als state 3 (maximum ademhaling in de aanwezigheid van overmaat substraten en ADP) en ongekoppelde ademhaling. Integriteit van de ademhalingsketen wordt bepaald door het meten activiteiten van alle vier complexen van de ademhalingsketen in geïsoleerde mitochondria. Capaciteit van oxidatieve fosforylering wordt beoordeeld door de mitochondriale membraanpotentiaal, ATP productiesnelheid, en de activiteit van F 0 F 1-ATPase. Energiestatus van RPTC wordt beoordeeld door de intracellulaire ATP-gehalte. Mitochondriale morfologie in levende cellen gevisualiseerd met behulp MitoTracker Red 580, een fluorescerende kleurstof die specifiek accumuleert in mitochondria en levende monolagen worden onderzocht onder een fluorescentiemicroscoop. RPTC levensvatbaarheid wordt beoordeeld op basis annexine V / propidium iodide kleuring gevolgd door flowcytometrie met apoptose en oncosis bepalen. Deze methoden maken een selectieve activering / inhibitie van afzonderlijke PKC-isozymenhun rol beoordelen cellulaire functies in verschillende fysiologische en pathologische aandoeningen die kunnen worden gereproduceerd in vitro.

Figuur 1 toont dat adenovirale levering van cDNA coderend voor de constitutief actieve (caPKC-ε) en inactieve (dnPKC-ε) mutanten van PKC-ε resulteert in significant verhoogde niveaus van eiwit PKC-ε in RPTC en mitochondria. Cellen geïnfecteerd met cDNA die de caPKC-ε vector overexpressie de gefosforyleerde (actieve) vorm van PKC-ε dat cellen geïnfecteerd met cDNA coderend dnPKC-ε overexpressie PKC-ε dat inactief was (niet gefosforyleerd) (Figuur 1). De aanwezigheid van actieve...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes at JoVE.com

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

De effecten van activering van eiwit kinase C (PKC) isozymen op mitochondriële functies geassocieerd met ademhaling en oxidatieve fosforylering en cellevensvatbaarheid beschreven. De aanpak past adenovirale techniek om selectief PKC overexpressie isozymen in primaire celkweek en verschillende assays voor mitochondriële functies en energie status van de cel te bepalen.

Beoordeling van Mitochondriale functies en levensvatbaarheid van de cellen in de nier overexpressie Proteïne kinase C-isozymen

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Research

JoVE Journal

Biology

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Tellen en bepalen van de levensvatbaarheid van de gekweekte cellen

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activering van apoptose door Cytoplasmatische micro-injectie van Cytochroom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Beoordeling van de GFP expressie en levensvatbaarheid Met behulp van de Tali Image-Based Cytometer

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Viability Assays for Cells in Culture

Levensvatbaarheid Testen voor Cellen in Cultuur

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Experimentele benaderingen om te studeren mitochondriale lokalisatie en functie van een nucleair celcyclus Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Gelijktijdige meting van mitochondriale calcium en mitochondriale membraan potentieel in levende cellen door fluorescentie microscopie

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Een grafische gebruikersinterface voor software-assisted tracking van eiwitconcentratie in dynamische cellulaire protrusies

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

Primaire cultuur van Rat Adrenocortical cellen en testen van Steroidogenic functies

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulatie door Femtosecond Laser activeert extracellulaire-Signal-gereguleerde kinase (ERK) signalering of mitochondriale gebeurtenissen in doelcellen

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

Verbetering van de nauwkeurigheid van de flowcytometrische beoordeling van het mitochondriale membraan potentieel in hematopoietische stam en voorlopercellen door remming van effluxpompen

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...