Name: assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes
Uploaded: 2013-01-07T12:00:00
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Ce travail a été soutenu par une subvention de la National Institutes of Health, l&#39;Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales, 2R01DK59558 (à GN). UAMS Translational Research Institute soutenu par le National Institutes of Health Centre national de recherche sur les ressources de subvention UL1 RR029884 fourni un financement partiel pour le Core cytométrie en flux à UAMS. Nous remercions le Dr Peipei Ping (Université de Californie à Los Angeles, Los Angeles, CA) pour fournir une aliquote de l&#39;adénovirus portant l&#39;ADNc codant dominant négatif (inactif) mutant de la PKC-ε et le Dr Allen Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) pour fournir un aliquot de vecteur adénoviral codant le mutant constitutivement active de la PKC-ε. Nous remercions également MM. Peter Parker et Peter Sugden (Imperial College London, Londres, Royaume-Uni) pour fournir des ADNc codant constitutivement actives PKC-ε.

1. Isolement des tubules proximaux de la culture primaire <ol><li> Anesthésier le lapin, les deux reins d&#39;accise et les placer dans une boîte de Pétri remplie de tampon de préparation stérile (DMEM/F12) dans une hotte à flux laminaire. </li><li> Perfuser chaque rein avec 50 ml de tampon de préparation suivis par 50 ml de solution stérile saline tamponnée au phosphate, pH 7,4 (PBS) et une solution d&#39;oxyde de fer PBS (45 ml + 5 ml). De-capsulate reins et les transférer dans la mémoire tampon de prépa...

<ol>
	<li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+culture+conditions+stimulate+gluconeogenesis+in+primary+cultures+of+renal+proximal+tubule+cells.">Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells.</a> Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).</li><li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-ascorbic+acid+regulates+growth+and+metabolism+of+renal+cells:+improvements+in+cell+culture.">L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture.</a> Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).</li><li>Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-selective+activation+of+protein+kinase+C+by+nitric+oxide+in+the+heart+of+conscious+rabbits:+a+signaling+mechanism+for+both+nitric+oxide-induced+and+ischemia-induced+preconditioning.">Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning.</a> Circ. Res. 84, 587-604 (1999).</li><li>Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+both+Raf+and+Ras+is+necessary+for+activation+of+transcription+of+the+human+T+cell+receptor+beta+gene+by+protein+kinase+C,+Ras+plays+multiple+roles.">Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles.</a> J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).</li><li>Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#949;+activation+induces+mitochondrial+dysfunction+and+fragmentation+in+renal+proximal+tubules.">Protein kinase C-&#949; activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).</li><li>Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+ERK1/2+pathway+mediates+oxidant-induced+decreases+in+mitochondrial+function+in+renal+cells.">Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).</li><li>Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+activation+improves+oxidative+phosphorylation+in+renal+proximal+tubular+cells+following+nephrotoxicant+injury.">Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).</li><li>Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#945;+and+ERK1/2+mediate+mitochondrial+dysfunction,+decreases+in+active+Na++transport,+and+cisplatin-induced+apoptosis+in+renal+cells.">Protein kinase C-&#945; and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).</li><li>Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-+a+inhibits+the+repair+of+oxidative+phosphorylation+after+S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine+injury+in+renal+cells.">Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).</li><li>Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+a+functional+p21WAF1/CIP1+gene+accelerates+caspase-independent+apoptosis+induced+by+cisplatin+in+renal+cells.">Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+renal+cell+apoptosis:+caspase+3-dependent+and+-independent+pathways.">Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).</li></ol>

L&#39;approche présentée ici permet la surexpression des isozymes de la PKC individuelles dans la culture primaire de cellules tubulaires proximales rénales. Il ya plusieurs points forts de cette approche: 1. Il permet d&#39;enquêter sur les mécanismes de régulation dans une population homogène de cellules (cellules tubulaires proximales rénales) qui sont la principale cible des insultes diverses (ischémie, l&#39;hypoxie, stress oxydatif), les médicaments et nephrotoxicants dans le rein. 2. Fonctions mitochond...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Hotte à flux laminaire </td><td> Thermo Electron Corporation </td><td> FORMA 1104 </td></tr><tr><td> 2 ml et 15 ml broyeur Dounce tissus </td><td> WHEATON </td><td> 989-24607, 357544 </td></tr><tr><td> 85 et 235 microns maille de nylon </td><td> Petites pièces </td><td> CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD </td></tr><tr><td> Tube 50 ml à centrifuger stérile </td><td> Biologix </td><td> BCT-P 50BS </td></tr><tr><td> 1,5 ml du tube micro </td><td> Sarstedt </td><td> 72.690.001 </td></tr><tr><td> 35 x 10 mm plats de culture stériles </td><td> Corning </td><td> 430165 </td></tr><tr><td> Centrifugeuse Jouan </td><td> Jouan </td><td> Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40 </td></tr><tr&gt; <td> Réglable micro-centrifugeuse </td><td> SIGMA </td><td> Modèle 1 à 15 </td></tr><tr><td> Moniteur d&#39;oxygène biologique </td><td> YSI Incorporated </td><td> YSI Modèle 5300A </td></tr><tr><td> Simple système d&#39;oxygène Chambre Micro </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5356S </td></tr><tr><td> Sonde d&#39;oxygène </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5331A </td></tr><tr><td> Bain à circulation </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5310 </td></tr><tr><td> Kit de KCl et normalisée de la membrane </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5775 </td></tr><tr><td> Agitateur magnétique </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5222 </td></tr><tr><td> Enregistreur à plat </td><td> Kipp &amp; Zonen </td><td> BD 11E </td></tr><tr><td> 48 puits et 96 puits ont été transparentes </td><td> Costar </td><td> 3548, 3679 </td></tr><tr><td> Thermomixer R </td><td> Eppendorf </td><td> 5355 21919 </td></tr><tr><td> Agitateur orbital MAXQ 2000 </td><td> Thermo Scientific </td><td> Shka 2000 </td></tr><tr><td> Spectra Fluor Plus (absorbance / fluorescence / luminescence lecteur) </td><td> Tecan </td><td> F129005 </td></tr><tr><td> Chemise d&#39;eau américain Autoflow automatique CO 2 incubateur </td><td> NUAIRE </td><td> NU 4850 </td></tr><tr><td> 12x75 mm tubes en polystyrène de culture d&#39;essai pour la cytométrie en flux </td><td> Marque Fisher </td><td> 14-961-20 </td></tr><tr><td> Axioskop Objectif à immersion d&#39;eau 63x / 0,90 W </td><td> Carl Zeiss </td><td> 114846 ACHROPLAN 44 00 67 </td></tr><tr><td> DMEM / F12 </td><td> Cellgro </td><td> 99 à 830 - PB </td></tr><tr><td> DMEM / Ham F12 </td><td> Sigma </td><td> D 2906 - 1L </td></tr><tr><td> Mésylate de déféroxamine </td><td> Hospira </td><td> D110 </td></tr><tr><td> Collagénase de type I </td><td> Worthington </td><td> 4196 </td></tr><tr><td> Inhibiteur de la trypsine </td><td> Sigma </td><td> T 6522 - 500mg </td></tr><tr><td> 5,5 &#39;, 6,6&#39;-tétrachloro-1, 1 &#39;, 3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodure (JC-1) </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Mitotracker Rouge </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 </td></tr><tr><td> ATP bioluminescence Assay Kit HS II </td><td> Roche </td><td> 11 699 709 001 </td></tr><tr><td> Annexine V - solution de FITC </td><td> BioVision </td><td> 1001 - 200 </td></tr><tr><td> Cytomètre en flux </td><td> BD Biosciences </td><td> BD FACSCalibur </td></tr></tbody></table>

assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes

La protéine kinase C (PKC) de la famille des isoenzymes est impliqué dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques. Nos données récentes démontrent que la PKC régule la fonction mitochondriale et l&#39;état énergétique cellulaire. De nombreux rapports ont démontré que l&#39;activation de la PKC-a et de la PKC-ε améliore la fonction mitochondriale dans la cardiopathie ischémique et cardioprotection médiateur. En revanche, nous avons montré que la PKC-α et PKC-ε sont impliqués dans nephrotoxicant induite par la dysfonction mitochondriale et la mort cellulaire dans les cellules rénales. Par conséquent, l&#39;objectif de cette étude était de développer un modèle in vitro de cellules rénales maintenir actives les fonctions mitochondriales dans lequel isoenzymes de PKC pourrait être sélectivement activés ou inhibés afin de déterminer leur rôle dans la régulation de la phosphorylation oxydative et la survie cellulaire. Les cultures primaires de cellules tubulaires proximales rénales (RPTC) ont été cultivées dans de meilleures conditions résultant de la respiration mitochondriale et l&#39;activité des mitochondrial enzymes analogues à celles RPTC in vivo. Parce que les techniques de transfection traditionnels (Lipofectamine, l&#39;électroporation) sont inefficaces dans des cultures primaires et avoir des effets néfastes sur la fonction mitochondriale, PKC-ε ADNc mutants ont été livrés à travers RPTC vecteurs adénoviraux. Cette approche se traduit par la transfection de plus de 90% RPTC culture. Ici, nous présentons les méthodes pour évaluer le rôle de la PKC-ε dans: 1. la régulation de la morphologie des mitochondries et des fonctions associées à la synthèse d&#39;ATP, et 2. survie des RPTC en culture primaire. PKC-ε est activé par surexprimant constitutivement active de la PKC ε-mutant. PKC-ε est inhibée par la surexpression de la mutant inactif de la PKC-ε. La fonction mitochondriale est évaluée en examinant la respiration, de l&#39;intégrité de la chaîne respiratoire, les activités des complexes respiratoires et F 0 F 1-ATPase, le taux de production d&#39;ATP, et la teneur en ATP. La respiration est unssessed dans digitonine-perméabilisées RPTC que l&#39;état 3 (respiration maximale en présence de substrats en excès et ADP) et les respirations découplés. L&#39;intégrité de la chaîne respiratoire est évaluée par la mesure des activités des quatre complexes de la chaîne respiratoire dans les mitochondries isolées. Capacité de phosphorylation oxydative est évaluée par mesure du potentiel de membrane mitochondriale, le taux de production d&#39;ATP, et une activité de F 0 F 1-ATPase. Statut énergétique de RPTC est évaluée par la détermination de la teneur en ATP intracellulaire. Morphologie mitochondriale dans les cellules vivantes est visualisée à l&#39;aide Mitotracker Red 580, un colorant fluorescent qui s&#39;accumule spécifiquement dans les mitochondries, et des monocouches vivants sont examinés sous un microscope à fluorescence. RPTC viabilité est évaluée à l&#39;aide annexine V / iodure de propidium suivie coloration par cytométrie en flux afin de déterminer l&#39;apoptose et oncose. Ces méthodes permettent une activation sélective / inhibition de la PKC individuelle isozymesafin d&#39;évaluer leur rôle dans les fonctions cellulaires dans une variété de conditions physiologiques et pathologiques qui peuvent être reproduits in vitro.

La figure 1 montre que la livraison adénoviral de l&#39;ADNc codant les constitutivement actives (caPKC-ε) et inactifs (dnPKC-ε) des mutants de la PKC-ε aboutit à des niveaux beaucoup plus élevés de la protéine PKC-ε dans RPTC et dans les mitochondries. Les cellules infectées avec le vecteur portant l&#39;ADNc caPKC-ε surexprimé la phosphorylé (actif) sous forme de PKC-ε alors que les cellules infectées avec l&#39;ADNc codant dnPKC-ε-ε surexprimé PKC qui est inactif (pas phosphorylée)...

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Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

Les effets de l&#39;activation de la protéine kinase C (PKC) isozymes de la fonction mitochondriale associés à la respiration et la phosphorylation oxydative et sur la viabilité cellulaire sont décrites. L&#39;approche technique s&#39;adapte adénoviral de façon sélective surexprimer isoenzymes de PKC dans une culture cellulaire primaire et une variété de tests pour déterminer les fonctions mitochondriales et l&#39;état énergétique de la cellule.

Évaluation des fonctions mitochondriales et la viabilité cellulaire dans les cellules rénales surexprimant la protéine kinase C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

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