Name: assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes
Uploaded: 2013-01-07T12:00:00
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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, 2R01DK59558 (GN) unterstützt. UAMS Translational Research Institute der National Institutes of Health National Center for Research Resources Gewährung UL1 RR029884 abstützt Teilfinanzierung für die Durchflusszytometrie Core bei UAMS. Wir danken Dr. Peipei Ping (University of California in Los Angeles, Los Angeles, CA) zur Bereitstellung eines aliquoten von Adenovirus trägt codierende cDNA der dominant negative (inaktiv) Mutante von PKC-ε und Dr. Allen Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) zum Bereitstellen eines Aliquots Adenovirusvektor Codieren des konstitutiv aktiven Mutanten von PKC-ε. Wir danken auch Drs. Peter Parker und Peter Sugden (Imperial College London, London, UK) für die Bereitstellung von cDNA konstitutiv aktive PKC-ε.

Ein. Isolation der proximalen Nierentubuli für primäre Kultur <ol><li> Anesthetize das Kaninchen, Verbrauchssteuern beide Nieren und legen Sie sie in einer Petrischale mit sterilem prep Puffer (DMEM/F12-Medium) in einer Laminarströmungshaube gefüllt. </li><li> Perfundieren jeder Niere mit 50 ml Puffer durch prep 50 ml sterilem gefolgt phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4 (PBS) und PBS-Eisenoxid-Lösung (45 ml + 5 ml). De-kapseln Nieren und übergeben sie an die prep Puffer mit Deferoxamin. </li><li> Ernten ...

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	<li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+culture+conditions+stimulate+gluconeogenesis+in+primary+cultures+of+renal+proximal+tubule+cells.">Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells.</a> Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).</li><li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-ascorbic+acid+regulates+growth+and+metabolism+of+renal+cells:+improvements+in+cell+culture.">L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture.</a> Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).</li><li>Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-selective+activation+of+protein+kinase+C+by+nitric+oxide+in+the+heart+of+conscious+rabbits:+a+signaling+mechanism+for+both+nitric+oxide-induced+and+ischemia-induced+preconditioning.">Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning.</a> Circ. Res. 84, 587-604 (1999).</li><li>Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+both+Raf+and+Ras+is+necessary+for+activation+of+transcription+of+the+human+T+cell+receptor+beta+gene+by+protein+kinase+C,+Ras+plays+multiple+roles.">Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles.</a> J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).</li><li>Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#949;+activation+induces+mitochondrial+dysfunction+and+fragmentation+in+renal+proximal+tubules.">Protein kinase C-&#949; activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).</li><li>Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+ERK1/2+pathway+mediates+oxidant-induced+decreases+in+mitochondrial+function+in+renal+cells.">Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).</li><li>Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+activation+improves+oxidative+phosphorylation+in+renal+proximal+tubular+cells+following+nephrotoxicant+injury.">Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).</li><li>Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#945;+and+ERK1/2+mediate+mitochondrial+dysfunction,+decreases+in+active+Na++transport,+and+cisplatin-induced+apoptosis+in+renal+cells.">Protein kinase C-&#945; and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).</li><li>Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-+a+inhibits+the+repair+of+oxidative+phosphorylation+after+S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine+injury+in+renal+cells.">Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).</li><li>Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+a+functional+p21WAF1/CIP1+gene+accelerates+caspase-independent+apoptosis+induced+by+cisplatin+in+renal+cells.">Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+renal+cell+apoptosis:+caspase+3-dependent+and+-independent+pathways.">Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).</li></ol>

Der hier vorgestellte Ansatz ermöglicht Überexpression einzelner Isoenzyme der PKC in der primären Kultur der renalen proximalen Tubuluszellen. Es gibt mehrere Stärken dieses Ansatzes: 1. Es erlaubt zum Untersuchen Regulationsmechanismen in einer homogenen Population von Zellen (renalen proximalen röhrenförmigen Zellen), die das primäre Ziel für verschiedene Beleidigungen (Ischämie, Hypoxie, oxidativem Stress), Drogen und nephrotoxicants innerhalb der Niere befinden. 2. Mitochondrialen Funktionen in di...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Laminarströmungshaube </td><td> Thermo Electron Corporation </td><td> FORMA 1104 </td></tr><tr><td> 2 ml und 15 ml Dounce Gewebemühle </td><td> WHEATON </td><td> 989-24607, 357544 </td></tr><tr><td> 85 und 235 micron Nylonnetz </td><td> Kleinteile </td><td> CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD </td></tr><tr><td> 50 ml sterile Zentrifugenröhrchen </td><td> Biologix </td><td> BCT-P 50BS </td></tr><tr><td> 1,5 ml Mikro-Schlauch </td><td> Sarstedt </td><td> 72.690.001 </td></tr><tr><td> 35 x 10 mm sterile Kulturschalen </td><td> Corning </td><td> 430165 </td></tr><tr><td> Jouan Zentrifuge </td><td> Jouan </td><td> Jouan CR3 11175704 Rotoren: Jouan T40 </td></tr><tr&gt; <td> Einstellbare Mikro-Zentrifuge </td><td> SIGMA </td><td> Modell 1 bis 15 </td></tr><tr><td> Biologischer Sauerstoffbedarf Überwachung </td><td> YSI Incorporated </td><td> YSI Modell 5300A </td></tr><tr><td> Einkammer Micro Oxygen System </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5356S </td></tr><tr><td> Sauerstoffsonde </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5331A </td></tr><tr><td> Zirkulierende Bath </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5310 </td></tr><tr><td> KCl und Standard Membrane Kit </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5775 </td></tr><tr><td> Magnetrührer </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5222 </td></tr><tr><td> Flatbed Recorder </td><td> Kipp &amp; Zonen </td><td> BD 11E </td></tr><tr><td> 48-well und 96-well transparenten Platten </td><td> Costar </td><td> 3548, 3679 </td></tr><tr><td> Thermomixer R </td><td> Eppendorf </td><td> 5355 21919 </td></tr><tr><td> Kreisschüttler MAXQ 2000 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SHKA 2000 </td></tr><tr><td> Spectra FLUOR Plus (Absorption / Fluoreszenz / Lumineszenz-Reader) </td><td> Tecan </td><td> F129005 </td></tr><tr><td> Water-Jacketed US Autoflow Automatische CO 2-Inkubator </td><td> NUAIRE </td><td> NU 4850 </td></tr><tr><td> 12x75 mm Polystyrol Kultur Reagenzgläser für die Durchflusszytometrie </td><td> Fisher Marke </td><td> 14-961-20 </td></tr><tr><td> Axioskop Wasser Immersionsobjektiv 63x / 0,90 W </td><td> Carl Zeiss </td><td> 114846 ACHROPLAN 44 00 67 </td></tr><tr><td> DMEM / F12 </td><td> Cellgro </td><td> 99 bis 830 - PB </td></tr><tr><td> DMEM / F12 Ham </td><td> Sigma </td><td> D 2906 - 1L </td></tr><tr><td> Deferoxaminmesylat </td><td> Hospira </td><td> D110 </td></tr><tr><td> Collagenase Typ I </td><td> Worthington </td><td> 4196 </td></tr><tr><td> Trypsin-Inhibitor </td><td> Sigma </td><td> T 6522 - 500mg </td></tr><tr><td> 5,5 &#39;, 6,6&#39;-Tetrachlor-1, 1 &#39;, 3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine Iodid (JC-1) </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Mitotracker Red </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 </td></tr><tr><td> ATP-Biolumineszenz-Assay-Kit HS II </td><td> Roche </td><td> 11 699 709 001 </td></tr><tr><td> Annexin V - FITC-Lösung </td><td> BioVision </td><td> 1001 - 200 </td></tr><tr><td> Durchflusszytometer </td><td> BD Biosciences </td><td> BD FACSCalibur </td></tr></tbody></table>

assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes

Die Proteinkinase C (PKC)-Familie von Isozymen sind in zahlreichen physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt. Unsere jüngsten Daten zeigen, dass PKC Funktion der Mitochondrien und zellulärer Energie-Status regelt. Zahlreiche Berichte zeigten, dass die Aktivierung von PKC-a und PKC-ε mitochondrialen Funktion im ischämischen Herz und vermittelt Kardioprotektion verbessert. Im Gegensatz dazu haben wir gezeigt, dass PKC-α und PKC-ε in nephrotoxicant-induzierte mitochondriale Dysfunktion und Zelltod in Nierenzellen beteiligt sind. Daher war das Ziel dieser Studie, um eine In-vitro-Modell der Nierenzellen erhalten aktive mitochondriale Funktionen, in denen PKC Isoenzyme selektiv aktiviert werden könnten oder gehemmt, um ihre Rolle in der Regulation der oxidativen Phosphorylierung und das Überleben der Zelle zu bestimmen entwickeln. Primäre Kulturen der renalen proximalen Tubuluszellen (RPTC) in verbesserten Bedingungen, die die mitochondriale Atmung und die Aktivität der mito kultiviertmitochondrialen Enzyme ähnlich denen in RPTC in vivo. Da herkömmliche Transfektionstechniken (Lipofectamin, Elektroporation) ineffizient primären Kulturen und haben negative Auswirkungen auf die Funktion der Mitochondrien, wurden PKC-ε mutierten cDNAs RPTC durch adenovirale Vektoren geliefert. Dieser Ansatz führt zu Transfektion von über 90% kultivierten RPTC. Hier präsentieren wir Methoden für die Beurteilung der Rolle von PKC-ε in: 1. Regulation der mitochondrialen Morphologie und Funktionen mit ATP-Synthese und 2 zugeordnet. Überleben RPTC in Primärkultur. PKC-ε wird durch Überexpression der konstitutiv aktiven PKC-ε-Mutante aktiviert. PKC-ε wird durch Überexpression inhibiert die inaktive Mutante von PKC-ε. Mitochondriale Funktion wird durch die Untersuchung der Atmung, Integrität der Atmungskette, Aktivitäten der Atemwege Komplexe und beurteilt F 0 F 1-ATPase, ATP Produktionsrate und ATP-Gehalt. Atmung ist einssessed in Digitonin-permeabilisierten RPTC als Zustand 3 (maximal Atmung in Gegenwart eines Überschusses an Substraten und ADP) und entkoppelt Atmung. Integrität der Atmungskette wird durch Messen Aktivitäten aller vier Komplexe der Atmungskette in isolierten Mitochondrien beurteilt. Kapazität der oxidativen Phosphorylierung wird durch Messen des mitochondrialen Membranpotentials ausgewertet, ATP Produktionsrate und Aktivität von F 0 F 1-ATPase. Energiezustand RPTC wird durch Bestimmung der intrazellulären ATP-Gehalt untersucht. Mitochondrienmorphologie in lebenden Zellen visualisiert MitoTracker Red 580, ein fluoreszierender Farbstoff, der spezifisch akkumuliert in Mitochondrien und Live-Monoschichten sind unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. RPTC Lebensfähigkeit wird anhand Annexin V / Propidiumiodid-Färbung durchflusszytometrisch gefolgt, um Apoptose und oncosis bestimmen. Diese Methoden ermöglichen eine selektive Aktivierung / Hemmung der einzelnen PKC-Isozymeum ihre Rolle in der zellulären Funktionen in einer Vielzahl von physiologischen und pathologischen Zuständen, die in in vitro reproduzieren lässt beurteilen.

Abbildung 1 zeigt, dass adenoviralen Lieferung von cDNA, welche die konstitutiv aktiv (caPKC-ε) und inaktiv (dnPKC-ε) Mutanten von PKC-ε zu einer signifikant erhöhten Proteingehalt von PKC-ε in RPTC und in Mitochondrien. Zellen mit cDNA tragenden caPKC-ε Vektor infiziert überexprimiert das phosphorylierte (aktiver) Form von PKC-ε während Zellen mit cDNA kodierenden dnPKC-ε überexprimierte PKC-ε die inaktiv war (nicht phosphoryliert) (Abbildung 1) infiziert. Die Anwesenheit v...

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Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

Die Wirkungen der Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) Isozyme auf die mitochondriale Atmung und Funktionen mit oxidativen Phosphorylierung und auf Lebensfähigkeit der Zellen assoziiert werden beschrieben. Der Ansatz paßt adenoviralen Technik, um selektiv überexprimieren PKC-Isozyme in primären Zellkultur und einer Vielzahl von Assays, um mitochondriale Funktionen und Energiezustand der Zelle zu bestimmen.

Beurteilung der mitochondrialen Funktionen und Zellviabilität in Renal Überexpression Protein Kinase C-Isoenzyme

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Research

JoVE Journal

Biology

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Zählen und Bestimmung der Lebensfähigkeit von kultivierten Zellen

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Forschung

Biologie

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Die Aktivierung der Apoptose durch cytoplasmatische Mikroinjektion von Cytochrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Beurteilung der GFP Expression und Lebensfähigkeit Mit der Tali Image-Based Cytometer

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Viability Assays for Cells in Culture

Die Lebensfähigkeit Assays für Zellen in Kultur

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Experimentelle Ansätze zur Untersuchung Mitochondriale Lokalisation und Funktion eines Kernzellzyklus-Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

Primärkultur von Ratte Nebennierenrindeninsuffizienz Zellen und Assays Steroidogenic Funktionen

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation durch Femtosecond Laser aktiviert extrazellulär-signalregulierte Kinase (ERK) Signalisierung oder Mitochondrienereignisse in Zielzellen

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

Verbesserung der Genauigkeit der zytometrischen Bewertung des mitochondrialen Membranpotenzials in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen durch die Hemmung von Efflux-Pumpen

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...