Name: assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes
Uploaded: 2013-01-07T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי לבריאות, המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות, 2R01DK59558 (לGN). UAMS Translational מכון מחקר הנתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות המרכז הלאומי לחקר משאבי מענק UL1 RR029884 ספק מימון חלקי לליבת cytometry זרימה ב UAMS. אנו מודים לד&quot;ר Peipei פינג (אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג&#39;לס; לוס אנג&#39;לס, קליפורניה) למתן aliquot של אדנווירוס ביצוע קידוד המוטציה דומיננטית שלילית (לא פעיל) של PKC-ε וד&quot;ר אלן Samarel (אוניברסיטה לויולה מרכז רפואי cDNA; Maywood, אילינוי) למתן aliquot של וקטור adenoviral קידוד מוטצית constitutively הפעילה של PKC-ε. אנו מודים גם לבני זוג. פיטר פארקר ופיטר סאגד (אימפריאל קולג&#39; בלונדון, לונדון, בריטניה) עבור מתן קידוד constitutively PKC-ε פעיל cDNA.

1. בידוד של tubules הפרוקסימלי כליות לתרבות הראשית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם את הארנבת, בלו, שתי הכליות ולמקם אותם בצלחת פטרי מלאה בהכנת חיץ סטרילי (DMEM/F12 בינוני) במכסת מנוע זרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנקב את כל כליה עם 50 מ&quot;ל של ...

<ol>
	<li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+culture+conditions+stimulate+gluconeogenesis+in+primary+cultures+of+renal+proximal+tubule+cells.">Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells.</a> Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).</li><li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-ascorbic+acid+regulates+growth+and+metabolism+of+renal+cells:+improvements+in+cell+culture.">L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture.</a> Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).</li><li>Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-selective+activation+of+protein+kinase+C+by+nitric+oxide+in+the+heart+of+conscious+rabbits:+a+signaling+mechanism+for+both+nitric+oxide-induced+and+ischemia-induced+preconditioning.">Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning.</a> Circ. Res. 84, 587-604 (1999).</li><li>Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+both+Raf+and+Ras+is+necessary+for+activation+of+transcription+of+the+human+T+cell+receptor+beta+gene+by+protein+kinase+C,+Ras+plays+multiple+roles.">Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles.</a> J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).</li><li>Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#949;+activation+induces+mitochondrial+dysfunction+and+fragmentation+in+renal+proximal+tubules.">Protein kinase C-&#949; activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).</li><li>Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+ERK1/2+pathway+mediates+oxidant-induced+decreases+in+mitochondrial+function+in+renal+cells.">Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).</li><li>Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+activation+improves+oxidative+phosphorylation+in+renal+proximal+tubular+cells+following+nephrotoxicant+injury.">Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).</li><li>Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#945;+and+ERK1/2+mediate+mitochondrial+dysfunction,+decreases+in+active+Na++transport,+and+cisplatin-induced+apoptosis+in+renal+cells.">Protein kinase C-&#945; and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).</li><li>Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-+a+inhibits+the+repair+of+oxidative+phosphorylation+after+S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine+injury+in+renal+cells.">Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).</li><li>Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+a+functional+p21WAF1/CIP1+gene+accelerates+caspase-independent+apoptosis+induced+by+cisplatin+in+renal+cells.">Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+renal+cell+apoptosis:+caspase+3-dependent+and+-independent+pathways.">Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).</li></ol>

הגישה שהוצגה כאן מאפשרת לביטוי יתר של isozymes הבודד של PKC בתרבות העיקרית של תאים צינוריים הפרוקסימלי כליה. ישנם מספר יתרונות של גישה זו: 1. זה מאפשר לחקר מנגנוני ויסות באוכלוסייה הומוגנית של תאים (תאים צינוריים הפרוקסימלי כליות) שהמטרה העיקרית לעלבונות שונים (איסכמיה, מת?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> מכסה מנוע זרימה למינרית </td><td> Thermo Electron Corporation </td><td> פורם 1104 </td></tr><tr><td> 2 מ&quot;ל ומטחנת רקמה Dounce מ&quot;ל 15 </td><td> ויטון </td><td> 989-24607, 357544 </td></tr><tr><td> רשת ניילון מיקרון 85 ו 235 </td><td> חלקים קטנים </td><td> CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD </td></tr><tr><td> צינור צנטריפוגות סטרילי 50 מ&quot;ל </td><td> BIOLOGIX </td><td> BCT-P 50BS </td></tr><tr><td> 1.5 צינור מיליליטר מייקרו </td><td> Sarstedt </td><td> 72.690.001 </td></tr><tr><td> 35 10 מנות התרבות סטריליים מ&quot;מ x </td><td> קורנינג </td><td> 430165 </td></tr><tr><td> צנטריפוגה Jouan </td><td> Jouan </td><td> CR3 11175704 רוטורים Jouan: Jouan T40 </td></tr><tr&gt; <td> מייקרו צנטריפוגה מתכוונן </td><td> SIGMA </td><td> דגם 1-15 </td></tr><tr><td> צג חמצן ביולוגי </td><td> YSI Incorporated </td><td> YSI הדגם 5300A </td></tr><tr><td> מערכת חמצן יחידה קאמרית מייקרו </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5356S </td></tr><tr><td> בדיקת חמצן </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5331A </td></tr><tr><td> במחזור האמבטיה </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5310 </td></tr><tr><td> KCl וקיט ממברנה רגיל </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5775 </td></tr><tr><td> Stirrer המגנטי </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5222 </td></tr><tr><td> מקליט משטח אופקי </td><td> קיפ &amp; Zonen </td><td> BD 11E </td></tr><tr><td> 48-96-וכן גם צלחות שקופות </td><td> כוכב משנה </td><td> 3548, 3679 </td></tr><tr><td> Thermomixer R </td><td> Eppendorf </td><td> 5355 21919 </td></tr><tr><td> אורביטל שייקר MAXQ 2000 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SHKA 2000 </td></tr><tr><td> ספקטרה פלואוריד פלוס (קורא ספיגה / פלואורסצנטי / הארה) </td><td> טקאן </td><td> F129005 </td></tr><tr><td> מים במעייל Autoflow האוטומטית CO 2 חממת ארה&quot;ב </td><td> NUAIRE </td><td> נו 4850 </td></tr><tr><td> צינורות 12x75 מ&quot;מ פוליסטירן תרבות בדיקה לזרימה cytometry </td><td> פישר מותג </td><td> 14-961-20 </td></tr><tr><td> Axioskop מטרת טבילה במי 63x / 0,90 ואט </td><td> Carl Zeiss </td><td> 114846 ACHROPLAN 44 00 67 </td></tr><tr><td> DMEM / F12 </td><td> Cellgro </td><td> 99-830 - PB </td></tr><tr><td> DMEM / חם F12 </td><td> סיגמא </td><td> ד 2906 - 1L </td></tr><tr><td> Mesylate Deferoxamine </td><td> Hospira </td><td> D110 </td></tr><tr><td> Collagenase סוג I </td><td> וורטינגטון </td><td> 4196 </td></tr><tr><td> טריפסין מעכב </td><td> סיגמא </td><td> T 6522 - 500 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> 5,5 &quot;, 6,6 &#39;-tetrachloro-1, 1&#39;, 3,3 &#39;-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine יודיד (JC-1) </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Mitotracker אדום </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 </td></tr><tr><td> ATP פליטת אור Assay קיט HS השני </td><td> רוש </td><td> 11 699 709 001 </td></tr><tr><td> Annexin V - פתרון FITC </td><td> BioVision </td><td> 1001 - 200 </td></tr><tr><td> cytometer זרימה </td><td> BD Biosciences </td><td> BD FACSCalibur </td></tr></tbody></table>

assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes

משפחת חלבוני קינאז C (PKC) של isozymes מעורבת בתהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים רבים. הנתונים האחרונים שלנו מראים כי PKC מווסת את התפקוד המיטוכונדריה ומצב אנרגיה בתאים. דיווחים רבים הראו שההפעלה של PKC-PKC-ε ומשפרת את התפקוד המיטוכונדריה בלב איסכמית וcardioprotection המתווך. בניגוד לכך, יש לנו הראו כי PKC-α וPKC-ε מעורב בתפקוד nephrotoxicant מושרה המיטוכונדריה ומוות של תאים בתאי כליה. לכן, מטרתו של מחקר זה הייתה לפתח מודל במבחנה של תאי כלית שמירה על תפקודי המיטוכונדריה פעילים שביכולה להיות מופעלים על isozymes PKC סלקטיבי או עכבות כדי לקבוע את תפקידם ברגולציה של זירחון חמצונים והישרדות תאים. תרבויות העיקריות של תאים צינוריים הפרוקסימלי כליה (RPTC) היו בתרבית בתנאים משופרים וכתוצאה מכך הנשימה ופעילות המיטוכונדריאלי של מיטואנזימים דומים לאלה בRPTC in vivo chondrial. בגלל טכניקות מסורתיות (transfection Lipofectamine, electroporation) אינן יעילות בתרבויות העיקריות ויש לו השפעות שליליות על תפקוד המיטוכונדריה, PKC-ε cDNAs מוטציה נמסר לRPTC באמצעות וקטורי adenoviral. תוצאות גישה זו בtransfection של מעל 90% RPTC התרבותי. כאן, אנו מציגים שיטות להערכת תפקידו של PKC-ε ב: 1. רגולציה של מורפולוגיה ופונקציות הקשורות לסינתזת ATP, ו 2 המיטוכונדריה. הישרדות של RPTC בתרבות העיקרית. PKC-ε מופעל על ידי overexpressing constitutively הפעיל PKC-ε המוטציה. PKC-ε מעוכב מוטציה לא הפעילה של ε-PKC ידי overexpressing. מיטוכונדריה מוערכת על ידי בחינת נשימה, שלמות של שרשרת הנשימה, פעילות של תסביכים ונשימת F נ 0 1-ATPase, קצב ייצור ה-ATP, ותוכן ה-ATP. נשימה היאssessed בdigitonin-permeabilized RPTC כ3 מדינה (נשימה מרבית בנוכחות מצעים וADP עודפים) ונשימות כשהתיר. שלמות של שרשרת הנשימה מוערכת על ידי מדידת פעילותם של כל הארבעה הקומפלקסים של שרשרת הנשימה במיטוכונדריה המבודדת. קיבולת של זירחון חמצונים מחושבת על ידי מדידת פוטנציאל הקרום המיטוכונדריה, קצב ייצור ה-ATP, ופעילות של F נ 0 1-ATPase. מצב אנרגיה של RPTC מוערך על ידי קביעת תוכן ATP התאי. מורפולוגיה מיטוכונדריאלי בתאים חיים היא מדמיינת באמצעות MitoTracker אדום 580, צבע פלואורסצנטי המצטבר במיוחד במיטוכונדריה, וmonolayers החי נבחנים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדאיות RPTC הוערכה באמצעות annexin V / מכתים יודיד propidium אחרי cytometry זרימה לקבוע אפופטוזיס וoncosis. שיטות אלו מאפשרות הפעלה / עיכוב בררנית של PKC isozymes פרטכדי להעריך את תפקידם בתפקודים תאיים במגוון רחב של מצבים פיסיולוגיים ופתולוגיים, שניתן לשכפל במבחנה.

ניתן לראות בתרשים 1, כי מסירת adenoviral של cDNA קידוד (את dnPKC-ε) מוטנטים constitutively הפעילים (caPKC-ε) והפעילים של תוצאות-ε PKC ברמות חלבון מוגבר משמעותי-ε PKC בRPTC ובמיטוכונדריה. תאים נגועים בcDNA ביצוע וקטור caPKC-ε overexpressed צורת phosphorylated (פעיל) של ε PKC בעוד תאים נגועים ב- ε PKC cDNA קידוד d...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes at JoVE.com

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

את ההשפעות של הפעלה של קינאז isozymes חלבון C (PKC) על תפקוד המיטוכונדריה קשורים בנשימה וזרחון חמצונים ועל כדאיויות תא מתוארות. הגישה מסתגלת טכניקת adenoviral סלקטיבי overexpress isozymes PKC בתרבית תאים ראשוניים ומגוון של מבחנים כדי לקבוע פונקציות המיטוכונדריה ומצב אנרגיה של התא.

הערכה של פונקציות מיטוכונדריאלי וכדאיויות תא בתאי כלית overexpressing חלבון קינאז C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Research

JoVE Journal

Biology

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

ספירת ועל קביעת הכדאיות של תאים בתרבית

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

הפעלה של אפופטוזיס על ידי Microinjection cytoplasmic של ציטוכרום ג</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

הערכת הביטוי GFP ואת הכדאיות שימוש Cytometer תמונה מבוסס טלי

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Viability Assays for Cells in Culture

מבחני כדאיות לתאים בתרבית

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

גישות ניסוייות לחקר מיטוכונדריאלי לוקליזציה ותפקוד של מחזור התא הגרעיני קינאז, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

מדידה בו זמנית של סידן מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלית בתאים חיים באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

תרבות העיקרי של תאים Adrenocortical חולדה, מבחני של פונקציות שחלת בקר

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

גירוי התמונה על ידי לייזר מפעיל בלייזר-האות-מוסדרים-קינאז (טיפשה) איתות או האירועים מיטוכונדריאלי בתאי היעד

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

שיפור הדיוק של הערכה להערכת הזרימה של הפוטנציאל לממברנה מיטוכונדריאלי בתאי המטפאות ובתאים באמצעות עיכוב של משאבות אפלוקס

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...