Name: assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes
Uploaded: 2013-01-07T12:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del National Institutes of Health, Istituto Nazionale del Diabete e Malattie Digestive e Renali, 2R01DK59558 (a GN). MSNA Translational Research Institute sostenuto dal National Institutes of Health Centro Nazionale per la Ricerca Risorse concessione UL1 RR029884 fornito un finanziamento parziale per Core Citometria a Flusso di MSNA. Ringraziamo il Dott. Peipei Ping (Università di California a Los Angeles, Los Angeles, CA) per fornire un &#39;aliquota di adenovirus portare cDNA codificante il dominante negativo (inattivo) mutante della PKC-ε e il dottor Allen Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) per fornire una aliquota di vettore adenovirale codificante mutante costitutivamente attivo di PKC-ε. Ringraziamo anche Drs. Peter Parker e Peter Sugden (Imperial College London, Londra, Regno Unito) per la fornitura di cDNA codificante costitutivamente attivi PKC-ε.

1. Isolamento dei tubuli prossimali renali per la cultura primaria <ol><li> Anestetizzare il coniglio, accise entrambi i reni e metterli in una piastra di Petri riempita con tampone di preparazione sterile (DMEM/F12 media) in una cappa a flusso laminare. </li><li> Perfondere ogni rene con 50 ml di tampone prep seguiti da 50 ml di soluzione sterile salina tamponata con fosfato, pH 7,4 (PBS), e la soluzione di PBS-ossido di ferro (45 ml + 5 ml). De-capsulati reni e trasferirli al buffer di preparazione contenente defero...

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	<li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+culture+conditions+stimulate+gluconeogenesis+in+primary+cultures+of+renal+proximal+tubule+cells.">Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells.</a> Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).</li><li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-ascorbic+acid+regulates+growth+and+metabolism+of+renal+cells:+improvements+in+cell+culture.">L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture.</a> Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).</li><li>Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-selective+activation+of+protein+kinase+C+by+nitric+oxide+in+the+heart+of+conscious+rabbits:+a+signaling+mechanism+for+both+nitric+oxide-induced+and+ischemia-induced+preconditioning.">Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning.</a> Circ. Res. 84, 587-604 (1999).</li><li>Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+both+Raf+and+Ras+is+necessary+for+activation+of+transcription+of+the+human+T+cell+receptor+beta+gene+by+protein+kinase+C,+Ras+plays+multiple+roles.">Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles.</a> J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).</li><li>Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#949;+activation+induces+mitochondrial+dysfunction+and+fragmentation+in+renal+proximal+tubules.">Protein kinase C-&#949; activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).</li><li>Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+ERK1/2+pathway+mediates+oxidant-induced+decreases+in+mitochondrial+function+in+renal+cells.">Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).</li><li>Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+activation+improves+oxidative+phosphorylation+in+renal+proximal+tubular+cells+following+nephrotoxicant+injury.">Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).</li><li>Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#945;+and+ERK1/2+mediate+mitochondrial+dysfunction,+decreases+in+active+Na++transport,+and+cisplatin-induced+apoptosis+in+renal+cells.">Protein kinase C-&#945; and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).</li><li>Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-+a+inhibits+the+repair+of+oxidative+phosphorylation+after+S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine+injury+in+renal+cells.">Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).</li><li>Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+a+functional+p21WAF1/CIP1+gene+accelerates+caspase-independent+apoptosis+induced+by+cisplatin+in+renal+cells.">Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+renal+cell+apoptosis:+caspase+3-dependent+and+-independent+pathways.">Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).</li></ol>

L&#39;approccio qui presentato consente di sovraespressione di isoenzimi singoli PKC nella coltura primaria di cellule del tubulo prossimale renale. Ci sono diversi punti di forza di questo approccio: 1. Permette di studiare meccanismi di regolazione in una popolazione omogenea di cellule (cellule del tubulo prossimale renale) che sono l&#39;obiettivo primario per insulti vari (ischemia, ipossia, stress ossidativo), farmaci e nephrotoxicants all&#39;interno del rene. 2. Funzioni mitocondriali in questo modello in vi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Cappa a flusso laminare </td><td> Thermo Electron Corporation </td><td> FORMA 1104 </td></tr><tr><td> 2 ml e 15 ml smerigliatrice Dounce tessuto </td><td> WHEATON </td><td> 989-24607, 357.544 </td></tr><tr><td> 85 e 235 micron maglia di nylon </td><td> Piccole parti </td><td> CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD </td></tr><tr><td> 50 ml provetta sterile </td><td> BIOLOGIX </td><td> BCT-P 50BS </td></tr><tr><td> 1,5 ml micro tubo </td><td> Sarstedt </td><td> 72.690.001 </td></tr><tr><td> 35 x 10 mm piastre di coltura sterili </td><td> Corning </td><td> 430165 </td></tr><tr><td> Jouan Centrifuga </td><td> Jouan </td><td> Jouan CR3 11175704 Rotori: Jouan T40 </td></tr><tr&gt; <td> Regolabile micro-centrifuga </td><td> SIGMA </td><td> Modello 1-15 </td></tr><tr><td> Monitor di ossigeno biologica </td><td> YSI Incorporated </td><td> YSI modello 5300A </td></tr><tr><td> Singolo Ossigeno Sistema Camerale Micro </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5356S </td></tr><tr><td> Sonda di ossigeno </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5331A </td></tr><tr><td> Bagno di circolazione </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5310 </td></tr><tr><td> KCl e Kit membrana standard </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5775 </td></tr><tr><td> Agitatore magnetico </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5222 </td></tr><tr><td> Registratore Flatbed </td><td> Kipp &amp; Zonen </td><td> BD 11E </td></tr><tr><td> 48 pozzetti e piastre da 96 pozzetti trasparenti </td><td> Costar </td><td> 3548, 3679 </td></tr><tr><td> Thermomixer R </td><td> Eppendorf </td><td> 5355 21919 </td></tr><tr><td> Agitatore orbitale MaxQ 2000 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SHKA 2000 </td></tr><tr><td> Spectra FLUOR Plus (assorbanza / fluorescenza / luminescenza lettore) </td><td> Tecan </td><td> F129005 </td></tr><tr><td> Camicia d&#39;acqua degli Stati Uniti Autoflow automatica di CO 2 incubatore </td><td> Nuaire </td><td> NU 4850 </td></tr><tr><td> 12x75 mm in polistirolo Provette di coltura per citometria a flusso </td><td> Fisher Marca </td><td> 14-961-20 </td></tr><tr><td> Axioskop Obiettivo a immersione in acqua 63x / 0,90 W </td><td> Carl Zeiss </td><td> 114846 Achroplan 44 00 67 </td></tr><tr><td> DMEM / F12 </td><td> Cellgro </td><td> 99-830 - PB </td></tr><tr><td> DMEM / Ham F12 </td><td> Sigma </td><td> D 2906 - 1L </td></tr><tr><td> Deferoxamina Mesylate </td><td> Hospira </td><td> D110 </td></tr><tr><td> Collagenasi Tipo I </td><td> Worthington </td><td> 4196 </td></tr><tr><td> Inibitore della tripsina </td><td> Sigma </td><td> T 6522 - 500mg </td></tr><tr><td> 5,5 &#39;, 6,6&#39;-tetracloro-1, 1 &#39;, 3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine ioduro (JC-1) </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Mitotracker Red </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 </td></tr><tr><td> ATP bioluminescenza Assay Kit HS II </td><td> Roche </td><td> 11 699 709 001 </td></tr><tr><td> Annessina V - FITC soluzione </td><td> BioVision </td><td> 1001 - 200 </td></tr><tr><td> Citometro di flusso </td><td> BD Biosciences </td><td> BD FACSCalibur </td></tr></tbody></table>

assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes

La proteina chinasi C (PKC) famiglia di isoenzimi è coinvolta in numerosi processi fisiologici e patologici. I nostri dati recenti dimostrano che la PKC regola la funzione mitocondriale e lo stato di energia cellulare. Numerosi rapporti hanno dimostrato che l&#39;attivazione della PKC-a e PKC-ε migliora la funzione mitocondriale nel cuore ischemico e cardioprotettivo media. Al contrario, abbiamo dimostrato che PKC-α e ε-PKC sono coinvolte in nephrotoxicant indotta disfunzione mitocondriale e morte cellulare in cellule renali. Pertanto, l&#39;obiettivo di questo studio è stato quello di sviluppare un modello in vitro di cellule renali mantenere attive le funzioni mitocondriali in cui isoenzimi PKC potrebbe essere selettivamente attivati ​​o inibiti per determinare il loro ruolo nella regolazione della fosforilazione ossidativa e la sopravvivenza cellulare. Colture primarie di cellule renali del tubulo prossimale (RPTC) sono state coltivate in condizioni migliori con conseguente respirazione mitocondriale e l&#39;attività di mitomitocondriale enzimi simili a quelli in RPTC in vivo. Poiché le tecniche di transfezione tradizionali (Lipofectamine, elettroporazione) sono inefficienti in colture primarie e avere effetti negativi sulla funzione mitocondriale, PKC-ε cDNA mutanti sono state consegnate ai RPTC attraverso vettori adenovirali. Questo approccio risulta in trasfezione di oltre il 90% RPTC colta. Qui, vi presentiamo i metodi per valutare il ruolo della PKC-ε in: 1. regolazione della morfologia mitocondriale e funzioni associate alla sintesi di ATP, e 2. sopravvivenza della RPTC in coltura primaria. PKC-ε viene attivato overesprimono la costitutivamente attivo PKC-ε mutante. PKC-ε è inibita dalla sovraespressione della mutante inattivo di PKC-ε. Funzione mitocondriale viene valutata esaminando la respirazione, l&#39;integrità della catena respiratoria, attività dei complessi respiratori e F 0 F 1-ATPasi, tasso di produzione di ATP, e il contenuto di ATP. La respirazione è unssessed in digitonina permeabilizzate RPTC come stato 3 (respirazione massima in presenza di substrati in eccesso e ADP) e respirazioni disaccoppiati. Integrità della catena respiratoria è valutata misurando attività di tutti e quattro complessi della catena respiratoria nei mitocondri isolati. Capacità di fosforilazione ossidativa viene valutata misurando il potenziale di membrana mitocondriale, tasso di produzione di ATP, e l&#39;attività di F 0 F 1-ATPasi. Stato energetico del RPTC viene valutata determinando il contenuto intracellulare di ATP. Morfologia mitocondriale in cellule vive è visualizzato utilizzando MitoTracker Red 580, un colorante fluorescente che si accumula in particolare nei mitocondri, e monostrati vivi vengono esaminati al microscopio a fluorescenza. Vitalità RPTC è valutato in base annessina V / colorazione ioduro di propidio seguita mediante citometria di flusso per determinare apoptosi e oncosis. Questi metodi consentono di attivazione selettiva / inibizione della PKC individuale isoenzimiper valutare il loro ruolo in funzioni cellulari in una varietà di condizioni fisiologiche e patologiche che possono essere riprodotti in vitro.

La Figura 1 mostra che la consegna adenovirale di cDNA codificante le costitutivamente attivo (caPKC-ε) e inattivi (dnPKC-ε) mutanti di PKC-ε si traduce in livelli di proteine ​​significativamente aumentati di PKC-ε in RPTC e nei mitocondri. Le cellule infettate con cDNA che porta il caPKC-ε vettore sovraespresso il fosforilata (attiva) sotto forma di PKC-ε mentre le cellule infettate con cDNA codificante dnPKC-ε overexpressed PKC-ε che è stato inattivo (non fosforilata) (Figura 1)....

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Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

Gli effetti di attivazione di proteina chinasi C (PKC) isoenzimi sulle funzioni mitocondriali associate respirazione e fosforilazione ossidativa e sulla vitalità cellulare sono descritti. L&#39;approccio si adatta tecnica adenovirale per sovraesprimere selettivamente isoenzimi PKC in coltura primaria e una varietà di saggi per determinare le funzioni mitocondriali e lo stato energetico della cellula.

La valutazione delle funzioni mitocondriali e la vitalità cellulare in cellule renali proteina chinasi C overexpressing isoenzimi

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