Name: assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes
Uploaded: 2013-01-07T12:00:00
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この作品は、米国国立衛生研究所、国立糖尿病の研究所および消化器腎臓病、2R01DK59558（GNへの）からの助成金によってサポートされていました。研究資源助成UL1 RR029884のための健康のナショナルセンターの国立研究所によってサポートUAMSトランスレーショナル·リサーチ研究所がUAMSでフローサイトメトリーコアの部分的な資金を提供した。私たちは感謝博士Peipei平（カリフォルニア大学ロサンゼルス校、ロサンゼルス、カリフォルニア州）のcDNAのPKC-εと博士アレンSamarel（ロヨラ大学医療センターのドミナントネガティブ（非アクティブ）の変異体コーディング運ぶアデノウイルスのアリコートを提供するため; PKC-εの恒常的活性変異体をコードするアデノウイルスベクターのアリコートを提供するためのメイウッド、イリノイ州）。我々はまた、博士に感謝します。 PKC-ε恒常的活性をコードするcDNAを提供するためのピーター·パーカーとピーターサグデン（インペリアル·カレッジ·ロンドン、ロンドン、英国）。

1。初代培養のための腎近位尿細管の単離<ol><li>ウサギ、消費税両方の腎臓を麻酔し、層流フード内の無菌予備校バッファ（DMEM/F12培地）で満たされたペトリ皿の中に置いてください。 </li><li>滅菌リン酸緩衝化生理食塩液、pH7.4（PBS）およびPBS-酸化鉄溶液（45ミリリットル+ 5ミリリットル）の50ミリリットル続い予備校バッファー50mlで各腎臓を灌流。腎臓を脱カプセルに入れるとデフェロキ?...

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	<li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+culture+conditions+stimulate+gluconeogenesis+in+primary+cultures+of+renal+proximal+tubule+cells.">Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells.</a> Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).</li><li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-ascorbic+acid+regulates+growth+and+metabolism+of+renal+cells:+improvements+in+cell+culture.">L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture.</a> Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).</li><li>Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-selective+activation+of+protein+kinase+C+by+nitric+oxide+in+the+heart+of+conscious+rabbits:+a+signaling+mechanism+for+both+nitric+oxide-induced+and+ischemia-induced+preconditioning.">Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning.</a> Circ. Res. 84, 587-604 (1999).</li><li>Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+both+Raf+and+Ras+is+necessary+for+activation+of+transcription+of+the+human+T+cell+receptor+beta+gene+by+protein+kinase+C,+Ras+plays+multiple+roles.">Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles.</a> J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).</li><li>Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#949;+activation+induces+mitochondrial+dysfunction+and+fragmentation+in+renal+proximal+tubules.">Protein kinase C-&#949; activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).</li><li>Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+ERK1/2+pathway+mediates+oxidant-induced+decreases+in+mitochondrial+function+in+renal+cells.">Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).</li><li>Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+activation+improves+oxidative+phosphorylation+in+renal+proximal+tubular+cells+following+nephrotoxicant+injury.">Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).</li><li>Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#945;+and+ERK1/2+mediate+mitochondrial+dysfunction,+decreases+in+active+Na++transport,+and+cisplatin-induced+apoptosis+in+renal+cells.">Protein kinase C-&#945; and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).</li><li>Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-+a+inhibits+the+repair+of+oxidative+phosphorylation+after+S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine+injury+in+renal+cells.">Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).</li><li>Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+a+functional+p21WAF1/CIP1+gene+accelerates+caspase-independent+apoptosis+induced+by+cisplatin+in+renal+cells.">Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+renal+cell+apoptosis:+caspase+3-dependent+and+-independent+pathways.">Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).</li></ol>

ここで紹介する手法は、腎近位尿細管細胞の初代培養におけるPKCの個々のアイソザイムの過剰発現を可能にします。このアプローチにはいくつかの長所があります：1。それは様々な侮辱（虚血、低酸素、酸化ストレス）、薬、腎臓内nephrotoxicantsのための第一の目標である細胞（腎近位尿細管細胞）の均一な集団での調節機構を調査することができます。 2。改良された条件で初代培養で増殖?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>層流フード</td><td>サーモエレクトロン株式会社</td><td> FORMA 1104 </td></tr><tr><td> 2ミリリットルと15ミリリットルのダウンス組織グラインダー</td><td> WHEATON </td><td> 989から24607、357544 </td></tr><tr><td> 85〜235ミクロンのナイロンメッシュ</td><td>小型部品</td><td> CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD </td></tr><tr><td> 50ミリリットル滅菌遠心管</td><td> BIOLOGIX </td><td> BCT-P 50BS </td></tr><tr><td> 1.5 mlマイクロチューブ</td><td>ザルスタット</td><td> 72.690.001 </td></tr><tr><td> 35 x 10 mmの無菌培養皿</td><td>コー​​ニング</td><td> 430165 </td></tr><tr><td>ジョアン遠心機</td><td>ジョアン</td><td>ジョアンCR3 11175704ローター：ジョアンT40 </td></tr><tr&gt; <td>調整可能なマイクロ遠心</td><td> SIGMA </td><td>モデル1から15 </td></tr><tr><td>生物学的酸素モニタ</td><td> YSI Incorporatedの</td><td> YSIモデル5300A </td></tr><tr><td>シングルチャンバマイクロ酸素システム</td><td> YSI Incorporatedの</td><td> 5356S </td></tr><tr><td>酸素プローブ</td><td> YSI Incorporatedの</td><td> 5331A </td></tr><tr><td>循環バス</td><td> YSI Incorporatedの</td><td> 5310 </td></tr><tr><td> KClおよび標準メンブレンキット</td><td> YSI Incorporatedの</td><td> 5775 </td></tr><tr><td>マグネチックスターラー</td><td> YSI Incorporatedの</td><td> 5222 </td></tr><tr><td>フラットベッドレコーダー</td><td>キップ＆Zonen </td><td> BD 11E </td></tr><tr><td> 48ウェルと96ウェル透明板</td><td>コスター</td><td> 3548、3679 </td></tr><tr><td>サーモR </td><td> Eppendorf </td><td> 5355 21919 </td></tr><tr><td>オービタルシェーカーMAXQ 2000 </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> SHKA 2000 </td></tr><tr><td>スペクトルFLUORプラス（吸光/蛍光/発光リーダー） </td><td>テカン</td><td> F129005 </td></tr><tr><td>ウォータージャケット米国オートフロー自動CO 2インキュベーター</td><td> NUAIRE </td><td> NU 4850 </td></tr><tr><td>フローサイトメトリー用の12x75 mmのポリスチレン培養試験管</td><td>フィッシャーブランド</td><td> 14-961-20 </td></tr><tr><td> Axioskop 水浸対物レンズ63X / 0,90 W </td><td>カールツァイス</td><td> 114846 ACHROPLAN 44 00 67 </td></tr><tr><td> DMEM / F12キー</td><td> Cellgro </td><td> 99から830 - PB </td></tr><tr><td> DMEM / F12のハム</td><td>シグマ</td><td> D 2906 - 1L </td></tr><tr><td>メシル酸デフェロキサミン</td><td> HospiRA </td><td> D110 </td></tr><tr><td>コラゲナーゼタイプI </td><td>ワージントン</td><td> 4196 </td></tr><tr><td>トリプシン阻害剤</td><td>シグマ</td><td> T 6522 - 500mgの</td></tr><tr><td> 5,5 &#39;、6,6&#39; - テトラクロロ-1,1 &#39;、3,3&#39; - tetraethylbenzimidazolylcarbocyanineヨウ（JC-1） </td><td>インビトロジェン</td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Mitotracker赤</td><td>インビトロジェン</td><td> M22425 </td></tr><tr><td> ATPの生物発光アッセイキットHS II </td><td>ロッシュ</td><td> 11 699 709 001 </td></tr><tr><td>アネキシンV - FITCソリューション</td><td>バイオビジョン</td><td> 1001 - 200 </td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td> BD Biosciences社</td><td> BD FACSキャリバー</td></tr></tbody></table>

assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes

アイソザイムのプロテインキナーゼC（PKC）ファミリーは多数の生理学的および病理学的プロセスに関与している。我々の最近のデータは、PKCは、ミトコンドリアの機能と細胞のエネルギー状態を調節していることを実証している。多数の報告は、PKC-αおよびPKC-εの活性化は虚血性心とを仲介する心保護におけるミトコンドリア機能を改善することを実証した。対照的に、我々は、PKC-α、PKC-εは腎細胞でnephrotoxicant誘発性ミトコンドリア機能障害や細胞死に関与していることを明らかにした。したがって、本研究の目的は、PKCアイソザイムを選択的に活性化または酸化的リン酸化と細胞生存の制御に果たす役割を決定するために阻害されるおそれのある積極的なミトコンドリアの機能を維持する腎細胞のin vitroモデルを開発することであった。腎近位尿細管細胞（RPTC）の初代培養は水戸のミトコンドリア呼吸と活動の結果改善された条件で培養したin vivoでの RPTCと同様chondrial酵素。伝統的なトランスフェクション技術（リポフェクタミン、エレクトロポレーション）は初代培養において非効率的であり、ミトコンドリアの機能に悪影響を及ぼすので、PKC-ε変異体cDNAをアデノウイルスベクターを介しRPTCに届けられました。 90％を超える培養R​​PTCのトランスフェクションでは、このアプローチは結果。 1：ここでは、におけるPKC-εの役割を評価するための方法を提示します。 ATP合成に関連付けられているミトコンドリアの形態と機能の調節、および2。初代培養におけるRPTCの生存。 PKC-εが過剰発現している恒常的に活性化、PKC-ε突然変異体によって活性化される。 PKC-εは、過剰発現することにより、PKC-εの不活性変異体を阻害される。ミトコンドリア機能は、呼吸、呼吸鎖の完全性、呼吸複合体およびF 0 F 1-ATPアーゼ、ATPの生産速度、およびATP含量の活動を調べることで評価される。呼吸がある状態3（過剰基質およびADPの存在下で最大呼吸）と非結合呼吸としてジギトニン透過性RPTCにssessed。呼吸鎖の完全性は、単離されたミトコンドリアの呼吸鎖のすべての4つの複合体の活性を測定することにより評価される。酸化的リン酸化の容量は、ミトコンドリア膜電位、ATPの生産速度、およびF 0 F 1-ATPaseの活性を測定することによって評価されます。 RPTCのエネルギー状態は、細胞内ATP含量を測定することにより評価されています。生きた細胞内のミトコンドリアの形態はMitoTracker赤580、具体的にミトコンドリアに蓄積蛍光染料、およびライブ単層蛍光顕微鏡で調べたを用いて可視化されています。 RPTC生存率は、アネキシンV /アポトーシスと腫瘍症を決定するために、フローサイトメトリーに続いてヨウ化プロピジウム染色を用いて評価されています。 これらの方法は、個々のPKCアイソザイムの選択的活性化/阻害を可能にin vitroで再生することができる生理学的、病理学的条件の様々な細胞機能における役割を評価した。

Figure 1に示すとおりのアデノウイルスデリバリーRPTCとミトコンドリアにおけるPKC-εの大幅に増加したタンパク質レベルにおけるPKC-ε結果の恒常的活性（caPKC-ε）と非アクティブ（dnPKC - ε）変異体をコードするcDNA。細胞が不活性であったcDNAコードdnPKCを過剰発現- εPKC-ε（リン酸化されていない）（ 図1）に感染したのに対し、caPKC-εベクターを有するcDNAを感染させた?...

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Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

呼吸と酸化的リン酸化により、細胞生存率に関連するミトコンドリア機能に対するプロテインキナーゼC（PKC）アイソザイムの活性化の効果を説明する。アプローチは、選択的に初代細胞培養や細胞のミトコンドリアの機能とエネルギー状態を決定するために種々のアッセイにおけるPKCアイソザイムを過剰発現するアデノウイルスの手法を適応します。

腎細胞内のミトコンドリアの機能と細胞生存率の評価を過剰発現するプロテインキナーゼCアイソザイム

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Research

JoVE Journal

Biology

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

カウントと培養細胞の生存率の決定

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

シトクロムの細胞質マイクロインジェクションによるアポトーシスの活性化 C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

タリイメージベースのメ​​ーターを用いたGFPの発現と生存率の評価

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Viability Assays for Cells in Culture

培養中の細胞のための生存率アッセイ

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

ミトコンドリア局在と原子力細胞周期キナーゼ、Cdk1のの機能を研究するための実験的アプローチ

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

蛍光顕微鏡による生細胞内のミトコンドリアのカルシウムとミトコンドリア膜電位の同時測定

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

初代培養ラット副腎皮質細胞とステロイド ホルモン産生機能の試金

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

フェムトセカンドレーザーによる光刺激は、標的細胞における細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)シグナル伝達またはミトコンドリアイベントを活性化する

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

流出ポンプの阻害による造血幹細胞および前駆細胞におけるミトコンドリア膜電位の流れ細胞測定評価の精度向上

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...