Name: assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes
Uploaded: 2013-01-07T12:00:00
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이 작품은 국립 보건원, 국립 당뇨병 연구소와 소화기 및 신장병, 2R01DK59558 (GN까지)에서 보조금에 의해 지원되었다. 연구 자료 보조금 UL1 RR029884을위한 건강 국립 센터의 국립 연구소에 의해 지원 UAMS 병진 연구소 UAMS에서 유동 세포 계측법 코어의 일부 자금을 제공했습니다. 우리가 고마워 박사 Peipei 핑 (로스 앤젤레스 캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스, CA) cDNA PKC-ε 박사 알렌 Samarel (로욜라 메리 대학 의료 센터의 지배적 부정적 (비활성) 돌연변이 코딩 휴대 아데노 바이러스의 나누어지는를 제공, PKC-ε의 constitutively 활성화 돌연변이 코딩 adenoviral 벡터의 나누어지는를 제공 Maywood, IL). 우리는 또한 Drs 감사드립니다. PKC-ε constitutively 활성화 cDNA 코딩을 제공하는 피터 파커와 피터 Sugden (임페리얼 칼리지 런던, 런던, 영국).

1. 차 문화 신장 근위 Tubules의 절연 <ol><li> 토끼, 소비세 모두 신장을 마취하고 층류 후드의 무균 시험을 치루 버퍼 (DMEM/F12 매체)로 가득 찬 페트리 접시에 배치합니다. </li><li> 멸균 50 ML에 이어 사립 버퍼의 50 ML 각 신장을 Perfuse 생리, 산도에게 7.4 (PBS)를 인산염은 버퍼, 그리고 PBS 철 산화물 솔루션 (45 ML + 5 ML). 신장을 드 - capsulate와 deferoxamine를 포함하는 사립 버퍼로 전송할 수 있습니다. </li><li> 각...

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	<li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+culture+conditions+stimulate+gluconeogenesis+in+primary+cultures+of+renal+proximal+tubule+cells.">Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells.</a> Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).</li><li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-ascorbic+acid+regulates+growth+and+metabolism+of+renal+cells:+improvements+in+cell+culture.">L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture.</a> Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).</li><li>Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-selective+activation+of+protein+kinase+C+by+nitric+oxide+in+the+heart+of+conscious+rabbits:+a+signaling+mechanism+for+both+nitric+oxide-induced+and+ischemia-induced+preconditioning.">Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning.</a> Circ. Res. 84, 587-604 (1999).</li><li>Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+both+Raf+and+Ras+is+necessary+for+activation+of+transcription+of+the+human+T+cell+receptor+beta+gene+by+protein+kinase+C,+Ras+plays+multiple+roles.">Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles.</a> J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).</li><li>Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#949;+activation+induces+mitochondrial+dysfunction+and+fragmentation+in+renal+proximal+tubules.">Protein kinase C-&#949; activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).</li><li>Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+ERK1/2+pathway+mediates+oxidant-induced+decreases+in+mitochondrial+function+in+renal+cells.">Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).</li><li>Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+activation+improves+oxidative+phosphorylation+in+renal+proximal+tubular+cells+following+nephrotoxicant+injury.">Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).</li><li>Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#945;+and+ERK1/2+mediate+mitochondrial+dysfunction,+decreases+in+active+Na++transport,+and+cisplatin-induced+apoptosis+in+renal+cells.">Protein kinase C-&#945; and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).</li><li>Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-+a+inhibits+the+repair+of+oxidative+phosphorylation+after+S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine+injury+in+renal+cells.">Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).</li><li>Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+a+functional+p21WAF1/CIP1+gene+accelerates+caspase-independent+apoptosis+induced+by+cisplatin+in+renal+cells.">Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+renal+cell+apoptosis:+caspase+3-dependent+and+-independent+pathways.">Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).</li></ol>

여기에 제시된 방법은 신장 근위 관 세포의 주요 문화에 PKC의 개별 isozymes의 overexpression 할 수 있습니다. 이 방법의 몇 가지 장점이 있습니다 : 1. 그것은 다양한 모욕 (국소 빈혈, hypoxia, 산화 스트레스), 약물, 그리고 신장에서 nephrotoxicants의 기본 목표 아르 셀 (신장 근위 관 세포)의 동질적인 인구 규제 메커니즘을 조사 할 수 있습니다. 2. 개선 된 조건에서 차 문화에서 자란 RPTC의 체외 모델에서?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 층류 흐름 후드 </td><td> 열 전자 주식회사 </td><td> 견적 1,104 </td></tr><tr><td> 2 ML 15 ML의 다운스 호 모지 조직 연삭기 </td><td> 휘튼 </td><td> 989-24607, 357,544 </td></tr><tr><td> 85 235 마이크론 나일론 메쉬 </td><td> 소형 부품 </td><td> CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD </td></tr><tr><td> 50 ML 멸균 원심 분리기 관 </td><td> BIOLOGIX </td><td> BCT-P 50BS </td></tr><tr><td> 1.5 ML 마이크로 튜브 </td><td> Sarstedt </td><td> 72.690.001 </td></tr><tr><td> 35 X 10mm 멸균 문화 요리 </td><td> 코닝 </td><td> 430165 </td></tr><tr><td> 주앙의 원심 분리기 </td><td> 주앙 </td><td> 주앙 CR3 11,175,704 회 전자 : 주앙 T40 </td></tr><tr&gt; <td> 조절 마이크로 원심 분리기 </td><td> 시그마 </td><td> 모델 1-15 </td></tr><tr><td> 생물 산소 모니터 </td><td> 어떡하지 주식회사 </td><td> 어떡 모델 5300A </td></tr><tr><td> 싱글 상공 회의소 마이크로 산소 시스템 </td><td> 어떡하지 주식회사 </td><td> 5356S </td></tr><tr><td> 산소 프로브 </td><td> 어떡하지 주식회사 </td><td> 5331A </td></tr><tr><td> 목욕을 순환 </td><td> 어떡하지 주식회사 </td><td> 5310 </td></tr><tr><td> KCl과 표준 막 키트 </td><td> 어떡하지 주식회사 </td><td> 5775 </td></tr><tr><td> 자기 교반기 </td><td> 어떡하지 주식회사 </td><td> 5222 </td></tr><tr><td> 평판 레코더 </td><td> Kipp &amp; Zonen </td><td> BD 11E </td></tr><tr><td> 48 우물과 96도 투명 판 </td><td> Costar </td><td> 3548, 3679 </td></tr><tr><td> Thermomixer R </td><td> Eppendorf </td><td> 5355 21919 </td></tr><tr><td> 궤도 흔드는 MAXQ 2000 </td><td> 열 과학 </td><td> SHKA 2000 </td></tr><tr><td> 스펙트럼 형석 플러스 (흡광도 / 형광 / 발광 리더) </td><td> Tecan </td><td> F129005 </td></tr><tr><td> 물 외피 미국 Autoflow 자동 CO 2 인큐베이터 </td><td> NUAIRE </td><td> NU 4850 </td></tr><tr><td> 유동 세포 계측법에 대한 12x75 mm의 폴리스티렌 문화 테스트 튜브 </td><td> 피셔 브랜드 </td><td> 14-961-20 </td></tr><tr><td> Axioskop 물 침지 목표 63x / 0,90 W </td><td> 칼 Zeiss </td><td> 114846 ACHROPLAN 44 00 67 </td></tr><tr><td> DMEM / F12 </td><td> Cellgro </td><td> 99-830 - PB </td></tr><tr><td> DMEM / F12 햄 </td><td> 시그마 </td><td> D 2906 - 1L </td></tr><tr><td> Deferoxamine의 Mesylate </td><td> HospiRA </td><td> D110 </td></tr><tr><td> Collagenase 유형 I </td><td> 워싱턴 </td><td> 4196 </td></tr><tr><td> 트립신 억제제 </td><td> 시그마 </td><td> T 6522 - 500mg </td></tr><tr><td> 5,5 &#39;, 6,6&#39;- tetrachloro-1, 1 &#39;, 3,3&#39;이 - tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine 요오드화물 (JC-1) </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Mitotracker 레드 </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 </td></tr><tr><td> ATP Bioluminescence 검정 키트 HS II </td><td> 로슈 </td><td> 11 699 709 001 </td></tr><tr><td> Annexin V - FITC 솔루션 </td><td> BioVision </td><td> 1001-200 </td></tr><tr><td> 흐름 cytometer </td><td> BD Biosciences </td><td> BD FACSCalibur </td></tr></tbody></table>

assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes

isozymes의 단백질 키나제 C (PKC) 가족 여러 생리 학적 및 병리학 과정에 참여하고 있습니다. 최근 데이터는 PKC는 mitochondrial 기능과 세포의 에너지 상태를 조절하는 보여줍니다. 많은 보고서는 PKC-a와 PKC-ε의 활성화는 허혈성 심장과 mediates의 cardioprotection에서 mitochondrial 기능을 향상 보여 주었다. 반면에, 우리는 PKC-α와 PKC-ε은 신장 세포에서 nephrotoxicant 유발 mitochondrial 장애 및 세포 죽음에 연루되어 보여주고 있습니다. 따라서, 본 연구의 목표는 PKC의 isozymes가 선택적으로 활성화 또는 산화 인산화와 세포 생존의 규정에서 자신의 역할을 결정하기 위해 저해 할 수있는 활성 mitochondrial 기능을 유지하는 신장 세포의 체외 모델을 개발하는 것이 었습니다. 신장 근위 관 세포 (RPTC)의 기본 문화는 미토의 mitochondrial 호흡과 활동의 결과로 개선 된 조건에서 배양 된생체 내 RPTC에서 비슷한 chondrial 효소. 전통 transfection 기술 (Lipofectamine, electroporation)가 기본 문화에 비효율적이며, mitochondrial 기능에 부정적 영향을 미칠 때문에, PKC-ε 돌연변이 cDNAs가 adenoviral 벡터를 통해 RPTC에게 전달했다. % 90 교양 RPTC의 transfection에있는이 방법은 결과를 표시합니다. 여기, 우리는에서 PKC-ε의 역할을 평가하기위한 방법을 제시 1. mitochondrial 형태와 ATP 합성, 2와 관련된 기능을 규제. 차 문화에 RPTC의 생존. PKC-ε는 overexpressing constitutively 활성화 PKC-ε 돌연변이에 의해 활성화됩니다. PKC-ε는 overexpressing에 의해 PKC-ε의 비활성 돌연변이를 억제하고 있습니다. Mitochondrial 기능, 호흡 단지 및 활동을 호흡기 체인의 무결성을 호흡을 검토하여 평가된다 F 0 F 1 ATPase, ATP 생산 속도, 및 ATP의 콘텐츠입니다. 호흡은주 3 일 (초과 기판과 ADP의 존재의 최대 호흡)와 uncoupled 호흡으로 digitonin-permeabilized RPTC에 ssessed. 호흡기 체인의 무결성은 절연 된 미토콘드리아의 호흡 체인의 네 가지 단지의 활동을 측정하여 평가된다. 산화 인산화의 용량은 F 0 F 1 ATPase의 ATP 생산 속도, 활동, mitochondrial 막 잠재력을 측정하여 평가됩니다. RPTC의 에너지 상태가 세포 내 ATP 내용을 결정함으로써 평가된다. 라이브 셀의 Mitochondrial 형태는 MitoTracker 레드 580, 특히 미토콘드리아에 축적 형광 염료, 라이브 monolayers 형광 현미경으로 검사 아르를 사용하여 시각화합니다. RPTC 가능성은 annexin V / apoptosis 및 oncosis을 결정하는 유동 세포 계측법에 이어 propidium의 요오드화물 착색를 사용하여 평가된다. 이러한 방법은 각각의 PKC isozymes의 선택적 활성화 / 억제 할 수 있도록체외의에 복제 할 수 있습니다 생리학 및 병리학 조건 다양한 세포 기능에서 자신의 역할을 평가합니다.

그림 1 프로그램 그 adenoviral 전달 RPTC와 미토콘드리아에서 PKC-ε의 크게 증가 단백질 수준에서 PKC-ε 결과의 constitutively 활성 (caPKC-ε)과 비활성 (dnPKC-ε) 뮤턴트 코딩 cDNA. 세포가 비활성화했습니다 cDNA 코딩 dnPKC을 ε overexpressed PKC-ε (phosphorylated되지 않음) (그림 1)에 감염된 반면 caPKC-ε 벡터를 들고 cDNA에 감염된 세포는 PKC-ε의 phosphorylated (활성) 양식을 overexpressed. 활성의 존재...

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Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

호흡과 산화 인산화와와 세포 생존에 관련된 mitochondrial 기능에 단백질 키나제 C (PKC) isozymes의 활성화 효과가 설명되어 있습니다. 접근 방식은 선택적으로 mitochondrial 기능과 세포의 에너지 상태를 결정하는 주요 세포 배양 및 assays의 다양한 PKC isozymes을 overexpress하는 adenoviral 기술을 적응.

신장 세포 Overexpressing 단백질 키나제 C Isozymes에 Mitochondrial 기능 및 세포 생존 능력의 평가

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Research

JoVE Journal

Biology

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

카운팅 및 교양 세포의 생존을 결정

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

연구

생물학

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

시토크롬의 세포질 Microinjection 의한 Apoptosis의 활성화 C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Tali 이미지 기반 Cytometer를 사용하여 GFP의 표현과 생존 능력의 평가

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Viability Assays for Cells in Culture

문화의 세포에 대한 생존 분석 실험

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

실험 접근법은 미토콘드리아 현지화 및 핵 세포주기 키나제,는 Cdk1의 기능을 연구하는

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

동적 세포 돌출부에서 소프트웨어를 이용한 단백질 농도 추적을위한 그래픽 사용자 인터페이스

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

쥐 Adrenocortical 셀 및 Steroidogenic 기능의 분석 실험의 기본 문화

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

펨토초 레이저에 의한 광자극은 대상 세포에서 세포외 신호 조절 키나아제(ERK) 신호 또는 미토콘드리아 이벤트를 활성화합니다.

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

에플로프 펌프 억제를 통해 조혈 줄기 및 전조 세포에서 미토콘드리아 막 전위성 유동 세포 측정 평가의 정확도 향상

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...