Name: assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes
Uploaded: 2013-01-07T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Institutes of Health, National Institute of Diabetes og Digestive og nyre sykdommer, 2R01DK59558 (til GN). UAMS translasjonsforskning Research Institute støttet av National Institutes of Health National Center for Research Resources stipend UL1 RR029884 gitt delfinansiering for flowcytometri Kjerne på UAMS. Vi takker Dr. Peipei Ping (University of California i Los Angeles, Los Angeles, CA) for å gi en delmengde av adenovirus bærer cDNA koding den dominerende negative (inaktive) mutant av PKC-ε og Dr. Allen Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) for å tilveiebringe en porsjon av adenovirusvektor koding konstitutivt aktiv mutant av PKC-ε. Vi vil også takke Drs. Peter Parker og Peter Sugden (Imperial College London, London, UK) for å gi cDNA som koder konstitutivt aktive PKC-ε.

1. Isolering av nyre proksimale tubuli for Primary Kultur <ol><li> Anesthetize kaninen, avgiftsdirektoratet begge nyrer og plassere dem i en petriskål fylt med sterilt prep buffer (DMEM/F12 medium) i en laminær hette. </li><li> Perfuse hver nyre med 50 ml prep buffer etterfulgt av 50 ml av steril fosfatbufret saltløsning, pH 7,4 (PBS), og PBS-jernoksid løsning (45 ml + 5 ml). De-capsulate nyrer og overføre dem til prep buffer som inneholder deferoksamin. </li><li> Høste cortex av hver nyre. </li><li> Homogeniser...

<ol>
	<li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+culture+conditions+stimulate+gluconeogenesis+in+primary+cultures+of+renal+proximal+tubule+cells.">Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells.</a> Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).</li><li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-ascorbic+acid+regulates+growth+and+metabolism+of+renal+cells:+improvements+in+cell+culture.">L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture.</a> Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).</li><li>Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-selective+activation+of+protein+kinase+C+by+nitric+oxide+in+the+heart+of+conscious+rabbits:+a+signaling+mechanism+for+both+nitric+oxide-induced+and+ischemia-induced+preconditioning.">Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning.</a> Circ. Res. 84, 587-604 (1999).</li><li>Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+both+Raf+and+Ras+is+necessary+for+activation+of+transcription+of+the+human+T+cell+receptor+beta+gene+by+protein+kinase+C,+Ras+plays+multiple+roles.">Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles.</a> J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).</li><li>Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#949;+activation+induces+mitochondrial+dysfunction+and+fragmentation+in+renal+proximal+tubules.">Protein kinase C-&#949; activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).</li><li>Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+ERK1/2+pathway+mediates+oxidant-induced+decreases+in+mitochondrial+function+in+renal+cells.">Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).</li><li>Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+activation+improves+oxidative+phosphorylation+in+renal+proximal+tubular+cells+following+nephrotoxicant+injury.">Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).</li><li>Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#945;+and+ERK1/2+mediate+mitochondrial+dysfunction,+decreases+in+active+Na++transport,+and+cisplatin-induced+apoptosis+in+renal+cells.">Protein kinase C-&#945; and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).</li><li>Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-+a+inhibits+the+repair+of+oxidative+phosphorylation+after+S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine+injury+in+renal+cells.">Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).</li><li>Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+a+functional+p21WAF1/CIP1+gene+accelerates+caspase-independent+apoptosis+induced+by+cisplatin+in+renal+cells.">Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+renal+cell+apoptosis:+caspase+3-dependent+and+-independent+pathways.">Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).</li></ol>

Tilnærmingen presenteres her muliggjør overekspresjon av individuelle isozymer av PKC i primær kultur av renale proksimale tubulære celler. Det er flere styrker av denne tilnærmingen: 1. Det gir mulighet for å undersøke reguleringsmekanismer i en homogen befolkning av celler (renal proksimale tubulære celler) som er det primære målet for ulike fornærmelser (iskemi, hypoksi, oksidativt stress), narkotika og nephrotoxicants innenfor nyrene. 2. Mitokondrielle funksjoner i denne in vitro modell av RPTC d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navnet på reagensen </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Laminær hette </td><td> Thermo Electron Corporation </td><td> FORMA 1104 </td></tr><tr><td> 2 ml og 15 ml Dounce vev jeksel </td><td> Wheaton </td><td> 989-24607, 357544 </td></tr><tr><td> 85 og 235 micron nylon mesh </td><td> Små deler </td><td> CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD </td></tr><tr><td> 50 ml sterilt sentrifugerør </td><td> BIOLOGIX </td><td> BCT-P 50BS </td></tr><tr><td> 1,5 ml micro tube </td><td> Sarstedt </td><td> 72.690.001 </td></tr><tr><td> 35 x 10 mm sterile kultur retter </td><td> Corning </td><td> 430165 </td></tr><tr><td> Jouan Centrifuge </td><td> Jouan </td><td> Jouan CR3 11175704 Rotorer: Jouan T40 </td></tr><tr&gt; <td> Justerbar mikro-sentrifuge </td><td> SIGMA </td><td> Modell 1-15 </td></tr><tr><td> Biologisk Oxygen Monitor </td><td> YSI Incorporated </td><td> YSI Model 5300A </td></tr><tr><td> Enkelt Chamber Micro Oxygen System </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5356S </td></tr><tr><td> Oksygen Probe </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5331A </td></tr><tr><td> Sirkulerende Bath </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5310 </td></tr><tr><td> KCl og Standard Membran Kit </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5775 </td></tr><tr><td> Magnetrører </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5222 </td></tr><tr><td> Flatbed Recorder </td><td> Kipp &amp; Zonen </td><td> BD 11E </td></tr><tr><td> 48-brønn og 96-brønns gjennomsiktige plater </td><td> Costar </td><td> 3548, 3679 </td></tr><tr><td> Thermomixer R </td><td> Eppendorf </td><td> 5355 21919 </td></tr><tr><td> Orbital shaker MAXQ 2000 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SHKA 2000 </td></tr><tr><td> Spectra FLUOR Plus (absorbans / fluorescens / luminescence leser) </td><td> Tecan </td><td> F129005 </td></tr><tr><td> Vann-kappe amerikanske Autoflyt Automatisk CO 2 inkubator </td><td> NUAIRE </td><td> NU 4850 </td></tr><tr><td> 12x75 mm polystyren kultur reagensglass for flowcytometri </td><td> Fisher Brand </td><td> 14-961-20 </td></tr><tr><td> Axioskop Nedsenking i vann mål 63x / 0,90 W </td><td> Carl Zeiss </td><td> 114846 ACHROPLAN 44 00 67 </td></tr><tr><td> DMEM / F12 </td><td> Cellgro </td><td> 99-830 - PB </td></tr><tr><td> DMEM / F12 Ham </td><td> Sigma </td><td> D 2906 - 1L </td></tr><tr><td> Deferoksamin mesylat </td><td> Sykehusra </td><td> D110 </td></tr><tr><td> Kollagenase Type I </td><td> Worthington </td><td> 4196 </td></tr><tr><td> Trypsin inhibitor </td><td> Sigma </td><td> T 6522 - 500mg </td></tr><tr><td> 5,5 &#39;, 6,6&#39;-tetraklor-1, 1 &#39;, 3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine jodid (JC-1) </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Mitotracker Red </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 </td></tr><tr><td> ATP Bioluminescens Assay Kit HS II </td><td> Roche </td><td> 11 699 709 001 </td></tr><tr><td> Annexin V - FITC løsning </td><td> BioVision </td><td> 1001 - 200 </td></tr><tr><td> Flowcytometer </td><td> BD Biosciences </td><td> BD FACSCalibur </td></tr></tbody></table>

assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes

Proteinkinase C (PKC) familie av isoenzymer er involvert i en rekke fysiologiske og patologiske prosesser. Våre siste data viser at PKC regulerer mitokondriefunksjon og cellulær energi status. Tallrike rapporter viste at aktiveringen av PKC-a og PKC-ε forbedrer mitokondriell funksjon i iskemisk hjertesykdom og medierer kardioproteksjon. Derimot har vi vist at PKC-α og PKC-ε er involvert i nephrotoxicant-indusert mitokondriell dysfunksjon og celledød i nyre celler. Derfor var målet med denne studien å utvikle en in vitro modell av renale celler opprettholde aktive mitokondrie funksjoner som PKC isozymer kunne selektivt aktivert eller hemmet å bestemme sin rolle i regulering av oksidativ fosforylering og celle overlevelse. Primære kulturer av renale proksimale tubulære celler (RPTC) ble dyrket i bedre forhold som resulterer i mitokondrie åndedrett og aktivitet av Mitochondrial enzymer ligner på dem i RPTC in vivo. Fordi tradisjonelle transfeksjon teknikker (Lipofectamine, electroporation) er ineffektive i grunnskolen kulturer og ha negative effekter på mitokondrienes funksjon, ble PKC-ε mutant cDNA&#39;ene levert til RPTC gjennom adenovirale vektorer. Denne tilnærmingen fører transfeksjon av over 90% kultivert RPTC. Her presenterer vi metoder for å vurdere rollen som PKC-ε i: 1. regulering av mitokondriell morfologi og funksjoner knyttet ATP syntese, og 2. overlevelse av RPTC i primær kultur. PKC-ε aktiveres av overekspresjon den konstitutivt aktiv PKC-ε mutant. PKC-ε hemmes av overekspresjon den inaktive mutant av PKC-ε. Mitokondriefunksjon vurderes ved å undersøke åndedrett, integritet respiratoriske kjeden, aktiviteter respiratoriske komplekser og F 0 F 1-ATPase, ATP produksjonsrate, og ATP innhold. Respirasjon er enssessed i digitonin-permeabilized RPTC som stat 3 (maksimum åndedrett i nærvær av overflødig underlag og ADP) og uncoupled respirations. Integritet respiratoriske kjeden vurderes ved å måle aktiviteter av alle fire komplekser av respiratoriske kjeden i isolerte mitokondrier. Kapasitet på oksidativ fosforylering blir evaluert ved å måle mitokondrie membran potensial, ATP produksjonsrate, og aktiviteten F 0 F 1-ATPase. Energi status RPTC vurderes ved å bestemme den intracellulære ATP innhold. Mitokondrie morfologi i levende celler er visualisert ved hjelp av MitoTracker 580 Rød, et fluorescerende fargestoff som spesifikt akkumuleres i mitokondriene, og live monolayers er undersøkt under et fluorescerende mikroskop. RPTC levedyktighet blir vurdert ved Annexin V / propidium iodide flekker etterfulgt av flowcytometri å bestemme apoptose og oncosis. Disse metodene tillater en selektiv aktivering / inhibering av individuelle PKC isozymerå vurdere deres rolle i cellulære funksjoner i en rekke fysiologiske og patologiske tilstander som kan reproduseres in vitro.

Figur 1 viser at adenoviral levering av cDNA koding konstitutivt aktive (caPKC-ε) og inaktive (dnPKC-ε) mutanter av PKC-ε resulterer i betydelig økt protein nivåer av PKC-ε i ​​RPTC og i mitokondriene. Celler infisert med cDNA bærer caPKC-ε vektor overexpressed den fosforylert (aktiv) form av PKC-ε mens celler infisert med cDNA koding dnPKC-ε overexpressed PKC-ε som var inaktive (ikke fosforylert) (figur 1). Tilstedeværelsen av aktiv PKC-ε redusert mitokondrie respirasj...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes at JoVE.com

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

Virkningene av aktivering av proteinkinase C (PKC)-isozymene på mitokondrielle funksjoner knyttet respirasjon og oksidativ fosforylering og på cellelevedyktighet beskrives. Tilnærmingen tilpasser adenovirale teknikk for selektivt overuttrykker PKC isozymer i primær cellekultur og en rekke analyser for å bestemme mitokondrielle funksjoner og energi status av cellen.

Vurdering av Mitokondrielle funksjoner og celleviabilitet i nyre celler ved overuttrykk Protein C isozymer

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Research

JoVE Journal

Biology

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Vurdering av GFP Expression og Livskraftig Bruke Tali Bilde-Based cytometeret

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Viability Assays for Cells in Culture

Levedyktighet Analyser for celler i kultur

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Eksperimentelle tilnærminger til å studere mitokondrie lokalisering og funksjon for en kjernefysisk Cell Cycle Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Samtidig Måling av mitokondrie Kalsium og Mitokondriell membranpotensialet i levende celler med fluorescerende mikros

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Et grafisk brukergrensesnitt for programvareassistert sporing av proteinkonsentrasjon i dynamiske cellulære protrusjoner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

Primære kultur av rotte Adrenocortical celler og analyser av Steroidogenic funksjoner

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation av femtosecond laser aktiverer ekstracellulære-signal-regulert kinase (ERK) signalering eller mitokondrie hendelser i målceller

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

Forbedre nøyaktigheten av Flow analytiske vurdering av mitokondrie membran potensialet i blodkreft stem og stamceller gjennom hemming av utstrømming pumper

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...