Name: assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes
Uploaded: 2013-01-07T12:00:00
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Este trabalho foi financiado por uma doação do Instituto Nacional de Saúde, Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais, 2R01DK59558 (para GN). UAMS Translational Research Institute financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde Centro Nacional de Pesquisa de Recursos concessão UL1 RR029884 financiou parcialmente Núcleo de Citometria de Fluxo no UAMS. Agradecemos ao Dr. Peipei Ping (Universidade da Califórnia em Los Angeles; Los Angeles, CA) para a prestação de uma alíquota de adenovírus carregando cDNA que codifica o negativo dominante (inativo) mutante da PKC-ε e Allen Dr. Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) para proporcionar uma fracção de vector adenoviral que codifica o mutante constitutivamente activo da PKC-ε. Agradecemos também os drs. Peter Parker e Peter Sugden (Imperial College London, London, UK) para a prestação de codificação de cDNA constitutivamente ativos PKC ε.

1. Isolamento de túbulos renais proximais para cultura primária <ol><li> Anestesiar o coelho, consumo de ambos os rins e coloque-os num prato de Petri cheio com o tampão de preparação estéril (meio DMEM/F12) numa câmara de fluxo laminar. </li><li> Perfundir cada rim, com 50 ml de tampão de preparação, seguida de 50 ml de solução estéril tamponada com fosfato, pH 7,4 solução salina (PBS), e PBS-solução de óxido de ferro (45 ml + 5 ml). De-capsulate rins e transferi-los para o buffer de preparação co...

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	<li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+culture+conditions+stimulate+gluconeogenesis+in+primary+cultures+of+renal+proximal+tubule+cells.">Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells.</a> Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).</li><li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-ascorbic+acid+regulates+growth+and+metabolism+of+renal+cells:+improvements+in+cell+culture.">L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture.</a> Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).</li><li>Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-selective+activation+of+protein+kinase+C+by+nitric+oxide+in+the+heart+of+conscious+rabbits:+a+signaling+mechanism+for+both+nitric+oxide-induced+and+ischemia-induced+preconditioning.">Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning.</a> Circ. Res. 84, 587-604 (1999).</li><li>Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+both+Raf+and+Ras+is+necessary+for+activation+of+transcription+of+the+human+T+cell+receptor+beta+gene+by+protein+kinase+C,+Ras+plays+multiple+roles.">Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles.</a> J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).</li><li>Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#949;+activation+induces+mitochondrial+dysfunction+and+fragmentation+in+renal+proximal+tubules.">Protein kinase C-&#949; activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).</li><li>Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+ERK1/2+pathway+mediates+oxidant-induced+decreases+in+mitochondrial+function+in+renal+cells.">Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).</li><li>Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+activation+improves+oxidative+phosphorylation+in+renal+proximal+tubular+cells+following+nephrotoxicant+injury.">Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).</li><li>Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#945;+and+ERK1/2+mediate+mitochondrial+dysfunction,+decreases+in+active+Na++transport,+and+cisplatin-induced+apoptosis+in+renal+cells.">Protein kinase C-&#945; and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).</li><li>Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-+a+inhibits+the+repair+of+oxidative+phosphorylation+after+S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine+injury+in+renal+cells.">Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).</li><li>Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+a+functional+p21WAF1/CIP1+gene+accelerates+caspase-independent+apoptosis+induced+by+cisplatin+in+renal+cells.">Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+renal+cell+apoptosis:+caspase+3-dependent+and+-independent+pathways.">Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).</li></ol>

A abordagem aqui apresentada permite a super-expressão de isoenzimas individuais de PKC na cultura primária de células tubulares proximais renais. Há vários pontos fortes da presente abordagem: 1. Ela permite a investigação de mecanismos de regulação de uma população homogénea de células (células tubulares proximais renais) que são o alvo primário para vários insultos (isquemia, hipóxia, estresse oxidativo), drogas e nephrotoxicants dentro do rim. 2. Funções mitocondriais, neste modelo in vitro d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Câmara de fluxo laminar </td><td> Thermo Electron Corporation </td><td> FORMA 1104 </td></tr><tr><td> 2 ml e 15 ml moinho de tecidos Dounce </td><td> WHEATON </td><td> 989-24607, 357544 </td></tr><tr><td> 85 e 235 mícrons malha de nylon </td><td> Peças pequenas </td><td> CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD </td></tr><tr><td> 50 ml tubo de centrífuga estéril </td><td> BIOLOGIX </td><td> BCT-P 50BS </td></tr><tr><td> 1,5 ml microtubo </td><td> Sarstedt </td><td> 72.690.001 </td></tr><tr><td> 35 x 10 milímetros placas de cultura estéreis </td><td> Corning </td><td> 430165 </td></tr><tr><td> Centrífuga Jouan </td><td> Jouan </td><td> Jouan CR3 11175704 Rotores: Jouan T40 </td></tr><tr&gt; <td> Centrífuga de micro-ajustável </td><td> SIGMA </td><td> Modelo 1-15 </td></tr><tr><td> Monitor de Oxigênio Biológica </td><td> YSI Incorporated </td><td> YSI modelo 5300A </td></tr><tr><td> Único sistema de câmara de oxigênio Micro </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5356S </td></tr><tr><td> Sonda de oxigênio </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5331A </td></tr><tr><td> Circulando Bath </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5310 </td></tr><tr><td> KCl e kit de membrana padrão </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5775 </td></tr><tr><td> Agitador magnético </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5222 </td></tr><tr><td> Gravador de mesa </td><td> Kipp &amp; Zonen </td><td> BD 11E </td></tr><tr><td> De 48 poços e as placas de 96 poços transparentes </td><td> Costar </td><td> 3548, 3679 </td></tr><tr><td> R Thermomixer </td><td> Eppendorf </td><td> 5355 21919 </td></tr><tr><td> Orbital MAXQ 2000 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SHKA 2000 </td></tr><tr><td> Spectra FLUOR Plus (absorbância fluorescência / / luminescência leitor) </td><td> Tecan </td><td> F129005 </td></tr><tr><td> Jaqueta de água EUA Autoflow automática incubadora de CO 2 </td><td> NuAire </td><td> NU 4850 </td></tr><tr><td> Cultura de poliestireno de 12x75 mm para tubos de ensaio de citometria de fluxo </td><td> Fisher Marca </td><td> 14-961-20 </td></tr><tr><td> Axioskop Objetiva de imersão de água 63x / 0,90 W </td><td> Carl Zeiss </td><td> 114846 ACHROPLAN 44 00 67 </td></tr><tr><td> DMEM / F12 </td><td> Cellgro </td><td> 99-830 - PB </td></tr><tr><td> DMEM / Ham F12 </td><td> Sigma </td><td> D 2906 - 1L </td></tr><tr><td> Mesilato deferoxamina </td><td> Hospira </td><td> D110 </td></tr><tr><td> Colagenase tipo I </td><td> Worthington </td><td> 4196 </td></tr><tr><td> Inibidor de tripsina </td><td> Sigma </td><td> T 6522 - 500mg </td></tr><tr><td> 5,5 &#39;, 6,6&#39;-tetracloro-1, 1 &#39;, 3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodeto (JC-1) </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Mitotracker Vermelho </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 </td></tr><tr><td> A bioluminescência ATP Ensaio Kit HS II </td><td> Roche </td><td> 11 699 709 001 </td></tr><tr><td> Anexina V - solução FITC </td><td> BioVision </td><td> 1001 - 200 </td></tr><tr><td> Citómetro </td><td> BD Biosciences </td><td> BD FACSCalibur </td></tr></tbody></table>

assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes

A proteína quinase C de família (PKC) de isoenzimas está envolvido em vários processos fisiológicos e patológicos. Nossos dados recentes demonstram que PKC regula a função mitocondrial e energético celular. Numerosos relatos demonstraram que a activação de PKC-a e PKC-ε melhora a função mitocondrial do coração isquémica e medeia cardioprotecção. Em contraste, nós demonstramos que a PKC-α e PKC-ε estão envolvidos na nephrotoxicant induzida disfunção mitocondrial e morte celular em células de rim. Portanto, o objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo in vitro de células renais mantendo ativa as funções mitocondriais em que isozimas PKC poderia ser seletivamente ativadas ou inibidas para determinar seu papel na regulação da fosforilação oxidativa e sobrevivência celular. As culturas primárias de células tubulares proximais renais (RPTC) foram cultivadas em condições melhoradas, resultando em respiração mitocondrial e atividade de mitoenzimas mitocondrial semelhantes aos descritos no RPTC in vivo. Porque as técnicas de transfecção tradicionais (Lipofectamine, electroporação) são ineficientes em culturas primárias e têm efeitos adversos sobre a função mitocondrial, PKC-ε cDNAs mutantes foram entregues a RPTC através vectores adenovirais. Esta abordagem resulta em transfecção de mais de 90% RPTC culta. Aqui, apresentamos métodos para avaliar o papel da PKC-ε em: 1. regulação da morfologia mitocondrial e funções associadas com a síntese de ATP, e 2. sobrevivência de RPTC em cultura primária. PKC-ε é ativado pela superexpressão da constitutivamente ativa PKC-ε mutante. PKC-ε é inibida por superexpressam o mutante inactivo do ε-PKC. A função mitocondrial é avaliada examinando-se a respiração, a integridade da cadeia respiratória, as actividades dos complexos respiratórios e F 0 F 1-ATPase, a taxa de produção de ATP, e teor de ATP. A respiração é umssessed em digitonina-permeabilizadas RPTC como o estado 3 (respiração máxima na presença de substratos em excesso e ADP) e respiração desacoplados. Integridade da cadeia respiratória é avaliada por medição das actividades de todos os quatro complexos da cadeia respiratória nas mitocôndrias isoladas. Capacidade de fosforilação oxidativa é avaliada através da medição do potencial de membrana mitocondrial, a taxa de produção de ATP, e a actividade de F 0 F 1-ATPase. Estado de energia RPTC é avaliada através da determinação do teor de ATP intracelular. Morfologia mitocondrial em células vivas é visualizada utilizando MitoTracker Red 580, um corante fluorescente que se acumula especificamente nas mitocondrias, e monocamadas vivas são examinados sob um microscópio fluorescente. Viabilidade RPTC é avaliada através de anexina V / coloração com iodeto de propídio seguido por citometria de fluxo para determinar a apoptose e oncose. Estes métodos permitem uma activação selectiva / inibição do indivíduo isozimas PKCpara avaliar o seu papel em funções celulares de uma variedade de condições fisiológicas e patológicas que podem ser reproduzidas em in vitro.

A Figura 1 mostra que a entrega adenoviral de cDNA que codifica os constitutivamente activas (caPKC-ε) e inactivos (dnPKC-ε ε) mutantes de-PKC resulta em níveis significativamente aumentados de proteínas ε-PKC em RPTC e na mitocôndria. As células infectadas com o vector de transporte cDNA caPKC ε-superexpresso a forma (activo) fosforilada da PKC-ε enquanto que as células infectadas com o cDNA que codifica sobreexpressa dnPKC-ε ε-PKC que era inactiva (não fosforilado) (Figura 1).</s...

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Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

Os efeitos da activação da proteína quinase C (PKC) isozimas de funções mitocondriais associadas com a respiração e fosforilação oxidativa e na viabilidade celular são descritos. A abordagem técnica adapta adenoviral para superexpressar selectivamente as isozimas PKC em cultura primária de células e uma variedade de ensaios para determinar as funções mitocondriais e do estado de energia da célula.

Avaliação de funções mitocondriais e viabilidade celular em células renais Proteína Kinase C superexpressão Isozimas

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Research

JoVE Journal

Biology

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Contagem e determinação da viabilidade das células em cultura

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Biologia

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

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Ativação da apoptose por microinjeção citoplasmática de citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Avaliação da GFP Expressão e Viabilidade Usando o Tali Citómetro Baseado na Imagem

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Viability Assays for Cells in Culture

Ensaios de viabilidade para células em cultura

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Abordagens experimentais para estudar mitocondrial Localização e função de um ciclo celular Nuclear Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Medição simultânea de mitocondrial de cálcio e mitocondrial potencial de membrana em células vivas por Microscopia fluorescente

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas

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Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

Cultura primária de células Adrenocortical rato e ensaios das funções reguladora

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Fotoestimulação por Femtosecond laser ativa extracellular-sinal-regulado quinase (ERK) sinalização ou eventos mitocondrial em células-alvo

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

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Melhorando a exatidão da avaliação cytometric do fluxo do potencial mitochondrial da membrana em pilhas hematopoietic da haste e do progenitor através da inibição de bombas do Efflux

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...