Name: assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes
Uploaded: 2013-01-07T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом Национального института здоровья, Национальный институт диабета, желудочно-кишечных и почечных заболеваний, 2R01DK59558 (для GN). UAMS Поступательное научно-исследовательского института при поддержке Национального института здоровья Национальный научно-исследовательский центр ресурсов гранта UL1 RR029884 при условии частичного финансирования для ядра потока цитометрии в UAMS. Мы благодарим доктора Peipei Пинг (Калифорнийский университет в Лос-Анджелесе, Лос-Анджелес, Калифорния) за предоставление аликвоты аденовирус проведения кДНК, кодирующей доминантно негативной (неактивные) мутант PKC-ε и д-р Аллен Samarel (Университет Лойола Медицинского центра; Maywood, Иллинойс) для обеспечения аликвоты аденовирусных векторов кодирующих конститутивно активный мутант PKC-ε. Мы также благодарим доктора. Питер Паркер и Питер Сагден (Imperial College London, Лондон, Великобритания) для обеспечения кДНК, кодирующей постоянно активный PKC-ε.

1. Выделение почечных проксимальных канальцах для первичной культуры <ol><li> Anesthetize кролика, акцизы обе почки и поместить их в чашку Петри заполнена стерильной буфера подготовки (DMEM/F12 среда) в ламинарном боксе. </li><li> Заливать каждую почку с 50 мл буфера Подготовка затем 50 мл стерильной фос?...

<ol>
	<li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+culture+conditions+stimulate+gluconeogenesis+in+primary+cultures+of+renal+proximal+tubule+cells.">Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells.</a> Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).</li><li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-ascorbic+acid+regulates+growth+and+metabolism+of+renal+cells:+improvements+in+cell+culture.">L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture.</a> Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).</li><li>Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-selective+activation+of+protein+kinase+C+by+nitric+oxide+in+the+heart+of+conscious+rabbits:+a+signaling+mechanism+for+both+nitric+oxide-induced+and+ischemia-induced+preconditioning.">Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning.</a> Circ. Res. 84, 587-604 (1999).</li><li>Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+both+Raf+and+Ras+is+necessary+for+activation+of+transcription+of+the+human+T+cell+receptor+beta+gene+by+protein+kinase+C,+Ras+plays+multiple+roles.">Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles.</a> J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).</li><li>Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#949;+activation+induces+mitochondrial+dysfunction+and+fragmentation+in+renal+proximal+tubules.">Protein kinase C-&#949; activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).</li><li>Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+ERK1/2+pathway+mediates+oxidant-induced+decreases+in+mitochondrial+function+in+renal+cells.">Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).</li><li>Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+activation+improves+oxidative+phosphorylation+in+renal+proximal+tubular+cells+following+nephrotoxicant+injury.">Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).</li><li>Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#945;+and+ERK1/2+mediate+mitochondrial+dysfunction,+decreases+in+active+Na++transport,+and+cisplatin-induced+apoptosis+in+renal+cells.">Protein kinase C-&#945; and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).</li><li>Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-+a+inhibits+the+repair+of+oxidative+phosphorylation+after+S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine+injury+in+renal+cells.">Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).</li><li>Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+a+functional+p21WAF1/CIP1+gene+accelerates+caspase-independent+apoptosis+induced+by+cisplatin+in+renal+cells.">Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+renal+cell+apoptosis:+caspase+3-dependent+and+-independent+pathways.">Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).</li></ol>

Здесь подход позволяет избыточная экспрессия отдельных изоферментов PKC в первичной культуре почечных проксимальных канальцев клеток. Есть несколько сильных сторон этого подхода: 1. Это позволяет для исследования механизмов регулирования в однородной популяции клеток (почечные клетк...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td></tr><tr><td> Ламинарном потоке </td><td> Thermo Electron Corporation </td><td> FORMA 1104 </td></tr><tr><td> 2 мл и 15 мл Dounce ткани мясорубку </td><td> WHEATON </td><td> 989-24607, 357544 </td></tr><tr><td> 85 и 235 микрон нейлоновая сетка </td><td> Мелкие детали </td><td> CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD </td></tr><tr><td> 50 мл стерильной пробирке центрифуги </td><td> BIOLOGIX </td><td> BCT-P 50BS </td></tr><tr><td> 1,5 мл микро труб </td><td> Sarstedt </td><td> 72.690.001 </td></tr><tr><td> 35 х 10 мм, стерильные чашки культуры </td><td> Гранулирование </td><td> 430165 </td></tr><tr><td> Центрифуга Jouan </td><td> Jouan </td><td> Jouan CR3 11175704 Роторы: Jouan T40 </td></tr><tr&gt; <td> Регулируемые микро-центрифуге </td><td> SIGMA </td><td> Модель 1 - 15 </td></tr><tr><td> Биологические Монитор кислорода </td><td> YSI Объединенного </td><td> YSI Model 5300A </td></tr><tr><td> Однокамерные Micro кислородная система </td><td> YSI Объединенного </td><td> 5356S </td></tr><tr><td> Кислородный датчик </td><td> YSI Объединенного </td><td> 5331A </td></tr><tr><td> Циркуляционные ванны </td><td> YSI Объединенного </td><td> 5310 </td></tr><tr><td> KCl и стандартный набор мембранных </td><td> YSI Объединенного </td><td> 5775 </td></tr><tr><td> Магнитная мешалка </td><td> YSI Объединенного </td><td> 5222 </td></tr><tr><td> Планшетный Recorder </td><td> Kipp &amp; Zonen </td><td> BD 11E </td></tr><tr><td> 48-и и 96-и прозрачных пластин </td><td> Costar </td><td> 3548, 3679 </td></tr><tr><td> Thermomixer R </td><td> Миppendorf </td><td> 5355 21919 </td></tr><tr><td> Орбитальный шейкер MAXQ 2000 </td><td> Thermo Scientific </td><td> Шка 2000 </td></tr><tr><td> Spectra FLUOR Plus (поглощение / флуоресценции / люминесценции читателя) </td><td> Tecan </td><td> F129005 </td></tr><tr><td> С водяной рубашкой США Autoflow автоматического CO 2 инкубаторе </td><td> NUAIRE </td><td> NU 4850 </td></tr><tr><td> 12x75 мм полистирола культуры пробирки для проточной цитометрии </td><td> Марка Фишера </td><td> 14-961-20 </td></tr><tr><td> Axioskop Цель воде погружения 63x / 0,90 W </td><td> Carl Zeiss </td><td> 114846 ACHROPLAN 44 00 67 </td></tr><tr><td> DMEM / F12 </td><td> Cellgro </td><td> 99 - 830 - PB </td></tr><tr><td> DMEM / F12 Хэма </td><td> Сигма </td><td> D 2906 - 1л </td></tr><tr><td> Дефероксамин мезилата </td><td> БольницахРА </td><td> D110 </td></tr><tr><td> Коллагеназы типа I </td><td> Worthington </td><td> 4196 </td></tr><tr><td> Ингибитора трипсина </td><td> Сигма </td><td> T 6522 - 500 мг </td></tr><tr><td> 5,5 &#39;, 6,6&#39;-тетрахлор-1, 1 &#39;, 3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine йодида (JC-1) </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Mitotracker красный </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 </td></tr><tr><td> ATP Биолюминесценция набор для анализа HS II </td><td> Roche </td><td> 11 699 709 001 </td></tr><tr><td> Аннексина V - FITC решения </td><td> BioVision </td><td> 1001 - 200 </td></tr><tr><td> Проточный цитометр </td><td> BD Biosciences </td><td> BD FACSCalibur </td></tr></tbody></table>

assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-&epsilon; improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-&alpha; and PKC-&epsilon; are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-&epsilon; mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.
Here, we present methods for assessing the role of PKC-&epsilon; in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-&epsilon; is activated by overexpressing the constitutively active PKC-&epsilon; mutant. PKC-&epsilon; is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-&epsilon;. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F0F1-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F0F1-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.
These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

Рисунок 1 показывает, что аденовирусная доставки кДНК, кодирующих конститутивно активный (caPKC-ε) и неактивных (dnPKC-ε) мутантов PKC-ε приводит к значительно увеличились уровни белка ПКС-ε в РПТС и в митохондриях. Клетки, инфицированные с кДНК проведения caPKC-ε вектор экспрессия фосфо...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes at JoVE.com

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

Эффект активации протеинкиназы С (ПКС) изоферментов на митохондриальной функции, связанные с дыхания и окислительного фосфорилирования и на жизнеспособность клеток описаны. Подход адаптируется аденовирусной техники выборочно сверхэкспрессировать PKC изоферменты в первичной культуре клеток и различные анализы для определения функций митохондрий и энергетический статус клетки.

Оценка митохондриальной функции и жизнеспособности клеток в клетках почек гиперэкспрессией протеинкиназы С Изоферменты

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Research

JoVE Journal

Biology

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Подсчет голосов и определение жизнеспособности культивируемых клеток

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Активация апоптоза Цитоплазматическая Микроинъекция цитохрома С</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Оценка GFP слова и жизнеспособность использование Тали на основе изображения Цитометр

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Viability Assays for Cells in Culture

Жизнеспособность Анализы на клетки в культуре

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Экспериментальные подходы к изучению Митохондриальная локализации и функции цикла ядерных клеток киназа, CDK1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Одновременное измерение митохондриальной кальция и митохондриальной мембраны Потенциал в живых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Графический пользовательский интерфейс для отслеживания концентрации белка в программном сопровождении в динамических клеточных выпячиваниях

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

Основная культура клеток коры надпочечников крыс и анализов стероидогенных функций

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Фотостимуляция Femtosecond Laser активирует внеклеточные сигналы, регулируемые Kinase (ERK) Сигнализация или Митохондриальные События в целевых клетках

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

Улучшение точности потока цитометрической оценки митохондриальной Мембраны потенциал в гематопоитических стволовых и прародителей клеток через ингибирование Efflux насосов

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...