Name: assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes
Uploaded: 2013-01-07T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive och njursjukdomar, 2R01DK59558 (till GN). UAMS Translationell Research Institute stöds av National Institutes of Health National Center for Research Resources bidrag UL1 RR029884 som delfinansiering för flödescytometri Core vid UAMS. Vi tackar Dr Peipei Ping (University of California i Los Angeles, Los Angeles, Kalifornien) för att ge en alikvot av adenovirus bär cDNA kodning av dominerande negativa (inaktiv) mutant av PKC-ε och Dr Allen Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) för att åstadkomma en alikvot av adenoviral vektor som kodar den konstitutivt aktiva mutanten av PKC-ε. Vi tackar också Dr. Peter Parker och Peter Sugden (Imperial College London, London, UK) för att ge cDNA kodande konstitutivt aktiva PKC-ε.

1. Isolering av Njurar proximala tubuli för primär kultur <ol><li> Söva kaninen, punktskatter båda njurarna och placera dem i en petriskål fylld med steril prep buffert (DMEM/F12-medium) i ett laminärt flöde huva. </li><li> Perfundera varje njure med 50 ml preparativ buffert följt av 50 ml steril fosfatbuffrad saltlösning, pH 7,4 (PBS), och PBS-järnoxid lösning (45 ml + 5 ml). De-capsulate njurar och överföra dem till prep innehållande deferoxamin. </li><li> Skörda cortex av varje njure. </li><li> Homog...

<ol>
	<li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+culture+conditions+stimulate+gluconeogenesis+in+primary+cultures+of+renal+proximal+tubule+cells.">Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells.</a> Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).</li><li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-ascorbic+acid+regulates+growth+and+metabolism+of+renal+cells:+improvements+in+cell+culture.">L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture.</a> Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).</li><li>Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-selective+activation+of+protein+kinase+C+by+nitric+oxide+in+the+heart+of+conscious+rabbits:+a+signaling+mechanism+for+both+nitric+oxide-induced+and+ischemia-induced+preconditioning.">Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning.</a> Circ. Res. 84, 587-604 (1999).</li><li>Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+both+Raf+and+Ras+is+necessary+for+activation+of+transcription+of+the+human+T+cell+receptor+beta+gene+by+protein+kinase+C,+Ras+plays+multiple+roles.">Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles.</a> J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).</li><li>Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#949;+activation+induces+mitochondrial+dysfunction+and+fragmentation+in+renal+proximal+tubules.">Protein kinase C-&#949; activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).</li><li>Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+ERK1/2+pathway+mediates+oxidant-induced+decreases+in+mitochondrial+function+in+renal+cells.">Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).</li><li>Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+activation+improves+oxidative+phosphorylation+in+renal+proximal+tubular+cells+following+nephrotoxicant+injury.">Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).</li><li>Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#945;+and+ERK1/2+mediate+mitochondrial+dysfunction,+decreases+in+active+Na++transport,+and+cisplatin-induced+apoptosis+in+renal+cells.">Protein kinase C-&#945; and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).</li><li>Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-+a+inhibits+the+repair+of+oxidative+phosphorylation+after+S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine+injury+in+renal+cells.">Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).</li><li>Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+a+functional+p21WAF1/CIP1+gene+accelerates+caspase-independent+apoptosis+induced+by+cisplatin+in+renal+cells.">Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+renal+cell+apoptosis:+caspase+3-dependent+and+-independent+pathways.">Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).</li></ol>

Den metod som presenteras här möjliggör överuttryck av individuella isozymer av PKC i den primära kulturen av renala proximala tubulära celler. Det finns flera styrkor av detta tillvägagångssätt: 1. Det möjliggör att undersöka regleringsmekanismer i en homogen population av celler (renala proximala tubulära celler) som är det primära målet för olika förolämpningar (ischemi, hypoxi, oxidativ stress), läkemedel och nephrotoxicants inom njuren. 2. Mitokondriella funktioner i detta in vitro mode...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Huv med laminärt flöde </td><td> Thermo Electron Corporation </td><td> FORMA 1104 </td></tr><tr><td> 2 ml och 15 ml Dounce vävnadskvarn </td><td> Wheaton </td><td> 989-24607, 357.544 </td></tr><tr><td> 85 och 235 mikron nylonnät </td><td> Små delar </td><td> CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD </td></tr><tr><td> 50 ml sterilt centrifugrör </td><td> BIOLOGIX </td><td> BCT-P 50BS </td></tr><tr><td> 1,5 ml mikro rör </td><td> Sarstedt </td><td> 72.690.001 </td></tr><tr><td> 35 x 10 mm sterila odlingsskålar </td><td> Corning </td><td> 430.165 </td></tr><tr><td> Jouan Centrifugera </td><td> Jouan </td><td> Jouan CR3 11.175.704 Rotorer: Jouan T40 </td></tr><tr&gt; <td> Justerbar mikro-centrifug </td><td> SIGMA </td><td> Modell 1 till 15 </td></tr><tr><td> Biologisk syremonitor </td><td> YSI Incorporated </td><td> YSI Modell 5300A </td></tr><tr><td> Single Chamber Micro syrgassystem </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5356S </td></tr><tr><td> Syresond </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5331A </td></tr><tr><td> Cirkulerande bad </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5310 </td></tr><tr><td> KCl och Standard membran Kit </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5775 </td></tr><tr><td> Magnetomrörare </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5222 </td></tr><tr><td> Flatbädd Recorder </td><td> Kipp &amp; Zonen </td><td> BD 11E </td></tr><tr><td> 48-brunn och 96-brunnars plattor transparenta </td><td> Costar </td><td> 3548, 3679 </td></tr><tr><td> Thermomixer R </td><td> Eppendorf </td><td> 5355 21919 </td></tr><tr><td> Skakapparat MAXQ 2000 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SHKA 2000 </td></tr><tr><td> Spectra FLUOR Plus (absorbans / fluorescens / luminescens läsare) </td><td> Tecan </td><td> F129005 </td></tr><tr><td> Vattenmantlad amerikanska Autoflow Automatisk CO 2 Inkubator </td><td> NUAIRE </td><td> NU 4850 </td></tr><tr><td> 12x75 mm polystyren kultur provrör för flödescytometri </td><td> Fisher Brand </td><td> 14-961-20 </td></tr><tr><td> Axioskop Vattennedsänkningsprovning mål 63x / 0,90 W </td><td> Carl Zeiss </td><td> 114.846 Achroplan 44 00 67 </td></tr><tr><td> DMEM / F12 </td><td> Cellgro </td><td> 99 till 830 - PB </td></tr><tr><td> DMEM / F12 Ham </td><td> Sigma </td><td> D 2906 - 1L </td></tr><tr><td> Deferoxamin mesylat </td><td> Sjukhusra </td><td> D110 </td></tr><tr><td> Kollagenas typ I </td><td> Worthington </td><td> 4196 </td></tr><tr><td> Trypsininhibitor </td><td> Sigma </td><td> T 6522 - 500mg </td></tr><tr><td> 5,5 &#39;, 6,6&#39;-tetrakloro-1, 1 &#39;, 3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine jodid (JC-1) </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> MitoTracker Röd </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 </td></tr><tr><td> ATP-Bioluminescens analyssats HS II </td><td> Roche </td><td> 11 699 709 001 </td></tr><tr><td> Annexin V - FITC-lösning </td><td> BioVision </td><td> 1001 - 200 </td></tr><tr><td> Flödescytometern </td><td> BD Biosciences </td><td> BD FACSCalibur </td></tr></tbody></table>

assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes

Proteinkinas C (PKC) familjen av isozymer är involverad i många fysiologiska och patologiska processer. Våra senaste uppgifter visar att PKC reglerar mitokondriell funktion och cellernas energi status. Talrika rapporter visade att aktiveringen av PKC-a och PKC-ε förbättrar mitokondriell funktion i den ischemiska hjärtat och förmedlar kardioprotektion. I motsats, har vi visat att PKC-α och PKC-ε är involverade i nephrotoxicant-inducerad mitokondriell dysfunktion och celldöd i njurceller. Därför var målet med denna studie att utveckla en in vitro-modell av renala celler upprätthåller aktiva mitokondriella funktioner som PKC-isozymer kan selektivt aktiveras eller hämmas för att fastställa deras roll i regleringen av oxidativ fosforylering och cellöverlevnad. Primära kulturer av renala proximala tubulära celler (RPTC) odlades i förbättrade villkor resulterar i mitokondriell respiration och aktivitet av Mitochondrial enzymer liknande dem i RPTC in vivo. Eftersom traditionella transfektionstekniker (Lipofectamine, elektroporation) är ineffektiva i primära kulturer och har negativa effekter på mitokondriell funktion, var PKC-ε muterade cDNA levereras till RPTC genom adenovirusvektorer. Denna strategi resulterar i transfektion av över 90% odlade RPTC. Här presenterar vi metoder för att bedöma vilken roll PKC-ε i: 1. reglering av mitokondriell morfologi och funktioner i samband med ATP-syntes och 2. överlevnad RPTC i primär kultur. PKC-ε aktiveras av överuttrycker konstitutivt aktiva PKC-ε mutanten. PKC-ε hämmas av överuttryck den inaktiva mutanten av PKC-ε. Mitokondriefunktion bedöms genom att undersöka andning, integritet andningskedjan, aktiviteter respiratoriska komplex och F 0 F 1-ATPas, ATP-produktion hastighet och ATP innehåll. Respiration är enssessed i digitonin-permeabiliserades RPTC som statligt 3 (maximal andning i närvaro av överskott substrat och ADP) och okopplade respirations. Integritet andningskedjan bedöms genom att mäta verksamheten hos alla fyra komplex av andningskedjan i isolerade mitokondrier. Kapacitet av oxidativ fosforylering utvärderas genom mätning av mitokondriell membranpotential, ATP-produktionshastighet, och aktiviteten hos F 0 F 1-ATPas. Energistatus RPTC bedöms genom bestämning av intracellulära ATP-halten. Mitokondriell morfologi i levande celler visualiseras med hjälp MitoTracker Röd 580, en fluorescerande färg som specifikt ackumuleras i mitokondrierna, och levande monolager undersöks under ett fluorescerande mikroskop. RPTC livskraft bedöms med annexin V / propidiumjodidfärgning följt av flödescytometri för att avgöra apoptos och oncosis. Dessa metoder medger en selektiv aktivering / inhibering av individuella PKC isozymeratt bedöma deras roll i cellulära funktioner i olika fysiologiska och patologiska tillstånd som kan reproduceras i in vitro.

Figur 1 visar att adenoviral leverans av cDNA kodande de konstitutivt aktiva (caPKC-ε) och inaktiv (dnPKC-ε) mutanter av PKC-ε resulterar i väsentligt ökade proteinnivåer av PKC-ε i ​​RPTC och i mitokondrier. Celler infekterade med cDNA bär caPKC-ε vektor överuttryckte den fosforylerade (aktiva) formen av PKC-ε medan celler infekterade med cDNA kodande dnPKC-ε överuttryckta PKC-ε som var inaktiv (ej fosforylerad) (Figur 1). Närvaron av aktivt PKC-ε minskade mitokondr...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes at JoVE.com

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

Effekterna av aktivering av proteinkinas C (PKC) isozymer på mitokondriella funktioner förknippade med andning och oxidativ fosforylering och på cellviabilitet beskrivs. Den strategi anpassar adenoviral teknik för att selektivt överuttrycka PKC isozymer i primär cellkultur och en mängd olika analyser för att fastställa mitokondriella funktioner och energistatus i cellen.

Bedömning av Mitokondriella funktioner och cellviabilitet i Renal celler som överuttrycker proteinkinas C-isozymer

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Research

JoVE Journal

Biology

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Räkning och Avgöra genomförbarhet för odlade celler

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Aktivering av apoptos genom cytoplasmiska mikroinjektion av cytokrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Bedömning av GFP uttryck och livskraft Använda Tali bildbaserade flödescytometer

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Viability Assays for Cells in Culture

Bärkraft: Analyser för celler i odling

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Experimentella metoder för att studera mitokondrie Lokalisering och funktion av en kärnteknisk Cell Cycle kinas, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Samtidig mätning av mitokondrie kalcium och mitokondriell membranpotential i levande celler genom fluorescensmikroskopi

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

En grafisk användargränssnitt för programvaruassisterad spårning av proteinkoncentration i dynamiska cellulära protrusioner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

Primära kultur av råtta Adrenokortikal celler och analyser av steroidogena funktioner

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation av Femtosecond laser aktiverar extracellulär-signalreglerade Kinas (ERK) signalering eller mitokondriella händelser i målceller

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

Förbättra noggrannheten i flödescytometrisk bedömning av mitokondriell membran potential i hematopoietiska stamceller och stamceller genom hämning av effluxpumpar

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...