Name: assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes
Uploaded: 2013-01-07T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Diyabet Enstitüsü, Sindirim ve Böbrek Hastalıkları, 2R01DK59558 (GN) bir hibe ile desteklenmiştir. Araştırma Kaynakları hibe UL1 RR029884 Sağlık Ulusal Merkezi Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen UAMS Dönüştürülebilir Araştırma Enstitüsü UAMS az Flow Sitometri Çekirdek kısmi finansmanını sağladı. Biz teşekkür Dr Peipei Ping (Los Angeles California Üniversitesi, Los Angeles, CA) cDNA PKC-ε ve Dr Allen Samarel (Loyola Üniversitesi Tıp Merkezi dominant negatif (inaktif) mutant kodlama taşıyan adenovirüs bir kısım sağlamak için; PKC-ε ve yapısal olarak aktif mutantı kodlayan adenoviral vektör bir alikotu sağlamak için Maywood, IL). Biz de Drs ederim. PKC-ε yapısal olarak aktif cDNA kodlama sağlamak için Peter Parker ve Peter Sugden (Imperial College London, Londra, İngiltere).

1. Birincil Kültür Böbrek proksimal tübüllerde İzolasyonu <ol><li> Tavşan, tüketim hem böbrekleri anestezisi ve bir laminer akış kaputu steril hazırlık tampon (DMEM/F12 orta) ile dolu bir Petri kabı koyun. </li><li> Steril 50 mL ve ardından prep tamponu ve 50 ml her bir böbrek serpmek salin, pH 7.4 (PBS) fosfat-tamponlu, ve PBS-demir oksit çözeltisi (45 ml + 5 ml) eklenmiştir. Böbrekler De-capsulate ve deferoksamin içeren hazırlık tampon aktarabilirsiniz. </li><li> Her böbrek korteksi Harvest. ...

<ol>
	<li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+culture+conditions+stimulate+gluconeogenesis+in+primary+cultures+of+renal+proximal+tubule+cells.">Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells.</a> Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).</li><li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-ascorbic+acid+regulates+growth+and+metabolism+of+renal+cells:+improvements+in+cell+culture.">L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture.</a> Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).</li><li>Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-selective+activation+of+protein+kinase+C+by+nitric+oxide+in+the+heart+of+conscious+rabbits:+a+signaling+mechanism+for+both+nitric+oxide-induced+and+ischemia-induced+preconditioning.">Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning.</a> Circ. Res. 84, 587-604 (1999).</li><li>Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+both+Raf+and+Ras+is+necessary+for+activation+of+transcription+of+the+human+T+cell+receptor+beta+gene+by+protein+kinase+C,+Ras+plays+multiple+roles.">Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles.</a> J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).</li><li>Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#949;+activation+induces+mitochondrial+dysfunction+and+fragmentation+in+renal+proximal+tubules.">Protein kinase C-&#949; activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).</li><li>Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+ERK1/2+pathway+mediates+oxidant-induced+decreases+in+mitochondrial+function+in+renal+cells.">Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).</li><li>Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+activation+improves+oxidative+phosphorylation+in+renal+proximal+tubular+cells+following+nephrotoxicant+injury.">Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).</li><li>Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#945;+and+ERK1/2+mediate+mitochondrial+dysfunction,+decreases+in+active+Na++transport,+and+cisplatin-induced+apoptosis+in+renal+cells.">Protein kinase C-&#945; and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).</li><li>Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-+a+inhibits+the+repair+of+oxidative+phosphorylation+after+S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine+injury+in+renal+cells.">Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).</li><li>Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+a+functional+p21WAF1/CIP1+gene+accelerates+caspase-independent+apoptosis+induced+by+cisplatin+in+renal+cells.">Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+renal+cell+apoptosis:+caspase+3-dependent+and+-independent+pathways.">Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).</li></ol>

Burada sunulan yaklaşım renal proksimal tübül hücrelerinin birincil kültür içinde PKC izozimleri bireysel ekspresyonu için olanak sağlar. Bu yaklaşımın birçok güçlü yanları vardır: 1. Bu çeşitli hakaretler (iskemi, hipoksi, oksidatif stres), ilaçlar ve böbrek içinde nephrotoxicants için birincil hedef hücreler (renal proksimal tübüler hücreler) homojen bir nüfus düzenleyici mekanizmaları araştırmak için izin verir. 2. Iyileştirilmiş koşullarda primer kültür yetiştirilen RPTC in <...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Laminer akış kaputu </td><td> Thermo Electron Corporation </td><td> FORMA 1104 </td></tr><tr><td> 2 ml ve 15 ml Dounce doku öğütücü </td><td> WHEATON </td><td> 989-24607, 357.544 </td></tr><tr><td> 85 ve 235 mikron naylon mesh </td><td> Küçük Parçalar </td><td> CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD </td></tr><tr><td> 50 ml steril santrifüj tüpüne </td><td> BIOLOGIX </td><td> BCT-P 50BS </td></tr><tr><td> 1.5 ml mikro tüp </td><td> Sarstedt </td><td> 72.690.001 </td></tr><tr><td> 35 x 10 mm steril kültür kaplarına </td><td> Corning </td><td> 430165 </td></tr><tr><td> Jouan Santrifüj </td><td> Jouan </td><td> Jouan CR3 11175704 Rotorları: Jouan T40 </td></tr><tr&gt; <td> Ayarlanabilir mikro-santrifüj </td><td> SIGMA </td><td> Model 1 - 15 </td></tr><tr><td> Biyolojik Oksijen Monitörü </td><td> YSI Incorporated </td><td> YSI Model 5300A </td></tr><tr><td> Tek Odası Mikro Oksijen Sistemi </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5356S </td></tr><tr><td> Oksijen Sondası </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5331A </td></tr><tr><td> Banyo Sirkülasyon </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5310 </td></tr><tr><td> KCl ve Standart Membran Takımı </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5775 </td></tr><tr><td> Manyetik Karıştırıcı </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5222 </td></tr><tr><td> Masaüstü Kaydedici </td><td> Kipp &amp; Zonen </td><td> BD 11E </td></tr><tr><td> 48-iyi ve 96-de şeffaf plaka </td><td> Costar </td><td> 3548, 3679 </td></tr><tr><td> Thermomixer R </td><td> Eppendorf </td><td> 5355 21919 </td></tr><tr><td> Orbital çalkalayıcı maxq 2000 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SHKA 2000 </td></tr><tr><td> Spectra FLUOR Plus (absorbans / floresan / ışıldama okuyucu) </td><td> Tecan </td><td> F129005 </td></tr><tr><td> Su Ceketli ABD Autoflow Otomatik CO 2 İnkübatör </td><td> NUAIRE </td><td> NU 4850 </td></tr><tr><td> Akım sitometri için 12x75 mm polistren kültürü test tüpleri </td><td> Fisher Marka </td><td> 14-961-20 </td></tr><tr><td> Axioskop Su immersiyon objektif 63x / 0,90 W </td><td> Carl Zeiss </td><td> 114846 ACHROPLAN 44 00 67 </td></tr><tr><td> DMEM / F12 </td><td> Cellgro </td><td> 99-830 - PB </td></tr><tr><td> DMEM / F12 Ham </td><td> Sigma </td><td> D 2906 - 1L </td></tr><tr><td> Deferoksamin mesilat </td><td> Hospitalra </td><td> D110 </td></tr><tr><td> Kollajenaz Tip I </td><td> Worthington </td><td> 4196 </td></tr><tr><td> Tripsin inhibitörü </td><td> Sigma </td><td> T 6522 - 500mg </td></tr><tr><td> 5,5 &#39;, 6,6&#39;-tetrakloro-1, 1 &#39;, 3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iyodür (JC-1) </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Mitotracker Kırmızı </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 </td></tr><tr><td> ATP Biyoparlaklık Assay Kit HS II </td><td> Roche </td><td> 11 699 709 001 </td></tr><tr><td> Annexin - V FITC çözümü </td><td> BioVision </td><td> 1001 - 200 </td></tr><tr><td> Akış sitometresi </td><td> BD Biosciences </td><td> BD FACSCalibur </td></tr></tbody></table>

assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes

Izozimlerinin protein kinaz C (PKC) ailesi çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçler içinde yer almaktadır. Bizim son veriler PKC mitokondriyal fonksiyon ve hücresel enerji durumunu düzenler göstermektedir. Sayısız raporlar PKC-a ve PKC-ε aktivasyonu iskemik kalp ve aracılık kardiyoproteksiyon mitokondriyal fonksiyonu iyileştirir olduğunu göstermiştir. Buna karşılık olarak, PKC-α ve PKC-ε böbrek hücrelerinde nephrotoxicant bağlı mitokondriyal işlev bozukluğu ve hücre ölümü ile ilgili olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, PKC izozimleri seçici aktive veya oksidatif fosforilasyon ve hücre canlılığı düzenleme rollerini belirlemek için inhibe edilebileceği aktif mitokondrial fonksiyonları koruyarak böbrek hücrelerinin in vitro modeli geliştirmektir. Renal proksimal tübüler hücreler (RPTC) primer kültürlerinde mito mitokondrial solunum ve faaliyet sonucu geliştirilmiş koşullarında kültüre edildiin vivo RPTC ile benzer chondrial enzimler. Geleneksel transfeksiyon teknikleri (lipofektamin, elektroporasyon) primer kültürlerinde verimsiz ve mitokondriyal fonksiyon üzerinde olumsuz etkilere sahip olduğundan, PKC-ε mutant cDNAlarının adenoviral vektörlerin aracılığıyla RPTC teslim edildi. % 90&#39;ın üzerinde kültür RPTC aktarılmasının Bu yaklaşım, sonuç. Burada, PKC-ε rolünü değerlendirmek için yöntemler mevcut: 1. mitokondriyal morfolojisi ve ATP sentezi, ve 2 ile ilişkili fonksiyonların düzenlenmesi. Primer kültür RPTC yaşama. PKC-ε eksprese yapısal olarak aktif PKC-ε mutant tarafından aktive edilir. PKC-ε eksprese tarafından PKC-ε ve inaktif mutant inhibe edilir. Mitokondrial fonksiyonu, solunum kompleksleri ve faaliyetleri solunum zincirinin bütünlüğünü solunum incelenerek değerlendirilir F 0 F 1-ATPaz, ATP üretim hızı ve ATP içeriği. Solunum birhal 3 (fazlalık substrat ve ADP varlığında maksimum solunum) ve bağlantısız olarak solunum digitonin-permeabilize RPTC içinde ssessed. Solunum zinciri bütünlüğü izole mitokondrilerde solunum zincirinin dört komplekslerin faaliyetleri ölçülerek değerlendirilir. Oksidatif fosforilasyon Kapasitesi F 0 F 1-ATPaz ATP üretim hızı ve etkinliği, mitokondrial membran potansiyeli ölçülerek değerlendirilir. RPTC Enerji durum hücre içi ATP içeriğinin belirlenerek değerlendirilir. Canlı hücrelerde mitokondri morfolojisindeki MitoTracker Kırmızı 580, özellikle mitokondri biriken floresan boya ve canlı monolayers bir floresan mikroskop altında incelenir kullanılarak canlandırılmaya çalışılır. RPTC canlılığı Anneksin V / apoptoz ve oncosis belirlemek için flow sitometri ile takip propidium iyodür boyama kullanılarak incelenmiştir. Bu yöntemler, bireysel PKC izozimleri seçici bir aktivasyon / inhibisyonu için izin vermekin vitro olarak çoğaltılabilir fizyolojik ve patolojik durumlarda çeşitli hücresel fonksiyonları rollerini değerlendirmek.

Şekil 1 gösteriyor ki adenoviral teslimat RPTC ve mitokondri PKC-ε önemli ölçüde artmış protein düzeyleri PKC-ε sonuçları yapısal olarak aktif (caPKC-ε) ve inaktif (dnPKC-ε) mutantlar kodların cDNA. Hücreleri inaktif oldu cDNA kodlama dnPKC-ε aşırı ekspresyona PKC-ε (fosforile değil) (Şekil 1) ile enfekte ise caPKC-ε vektörü taşıyan cDNA ile enfekte hücreler PKC-ε ve fosforile (aktif) şeklinde aşırı eksprese. Aktif varlığı, PKC-ε PKC-ε inaktif hi...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes at JoVE.com

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

Solunum ve oksidatif fosforilasyon ile ve hücre canlılığı üzerindeki ilişkili mitokondriyal fonksiyonları üzerinde, protein kinaz C (PKC), izozimlerinin aktivasyon etkisi tarif edilmektedir. Yaklaşım seçici olarak mitokondriyal işlev ve hücre enerji durumunu belirlemek için birincil hücre kültürü deneyleri ve çeşitli PKC izozimleri overexpress için adenoviral teknik uyum sağlar.

Böbrek Hücreleri aşırı eksprese eden protein kinaz C izozimlerinin Mitokondriyal Fonksiyonlar ve Hücre Canlılık Değerlendirilmesi

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Research

JoVE Journal

Biology

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Doku ve Hücre Sayım ve Canlılık Belirlenmesi

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Sitokrom Sitoplazmik Mikroenjeksiyon Apoptoz aktivasyonu C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Tali Görüntü Tabanlı Sitometre kullanarak GFP İfade ve Canlılık Değerlendirilmesi

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Viability Assays for Cells in Culture

Kültür hücreleri için Canlılık Tahliller

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Deneysel Yaklaşımlar Mitokondriyal Yerelleşme ve Nükleer Hücre Döngüsü Kinaz, Cdk1 Fonksiyonu Eğitim için

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Floresan Mikroskopi Canlı hücreler Potansiyel Mitokondriyal Kalsiyum ve Mitokondriyal Membran Eşzamanlı Ölçümü

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

Sıçan Adrenokortikal hücreleri ve deneyleri Steroidogenic fonksiyonların birincil kültür

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Femtosecond lazer tarafından fotostimulasyon hedef hücrelerde Ekstrelüler-sinyal düzenlenmiş kinaz (ERK) sinyalizasyon veya mitokondriyal olayları etkinleştirir

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

Efflux pompaları Inhibisyonu Ile hematopoetik kök ve progenitor hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin akış Cytometrik değerlendirilmesi doğruluğu iyileştirilmesi

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...