Name: enumeration of major peripheral blood leukocyte populations for multicenter clinical trials using a whole blood phenotyping assay
Uploaded: 2012-09-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay at JoVE.com

Nous tenons à remercier Jessica Jones, Erica Clark, Constance Ducar, Donna Smith, Roy Lewis, Lily Apedaile, Joanne Wiesner, Devin Adams, Corey McBain et Stephen Voght pour leur aide dans l&#39;élaboration de cette méthode, manuscrits et vidéo. Ce travail a été soutenu par la Fondation Bill et Melinda Gates CAVD subvention 38 645 (MJM) et les Instituts nationaux de la santé de subventions UM1 AI068618 et AI069481 U01 (MJM). EA-N. est soutenu par des subventions du NIH T32 AI007140. Nous remercions le James B. Pendleton Charitable Trust pour leur don généreux équipement.

Remarque: Pour protéger les anticorps conjugués fluorophore de la lumière, effectuer toutes les étapes d&#39;une armoire de biosécurité avec la lumière éteinte. 1. Préparation du panneau anticorps présentent une coloration <ol><li> Le panneau de coloration des anticorps peuvent être trouvés dans le tableau 1. Concentration d&#39;anticorps doivent être définis par titrage avec du sang total et en utilisant le matériel de cytométrie en flux même et ...

<ol>
	<li>Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cryobiology+of+rat+and+human+dendritic+cells:+preservation+and+destruction+of+membrane+integrity+by+freezing.">The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing.</a> Cryobiology. 27, 269-278 (1990).</li><li>Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+lymphocyte+immunophenotype+and+proliferative+responses+in+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1-infected+donors:+implications+for+multicenter+clinical+trials.+The+ACTG+Immunology+Advanced+Technology+Laboratories.">Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).</li><li>Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+human+granulocytes:+study+of+granulocyte+function+and+ultrastructure.">Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure.</a> Blood. 56, 237-245 (1980).</li><li>Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+assurance+for+polychromatic+flow+cytometry.">Quality assurance for polychromatic flow cytometry.</a> Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).</li><li>Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D'Avanzo, G., D'Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytofluorometric+methods+for+assessing+absolute+numbers+of+cell+subsets+in+blood.+European+Working+Group+on+Clinical+Cell+Analysis.">Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis.</a> Cytometry. 42, 327-346 (2000).</li><li>Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+blood+processing+parameters+for+optimal+detection+of+cryopreserved+antigen-specific+responses+for+HIV+vaccine+trials.">Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials.</a> J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).</li><li>Kantor, A. B., Roederer, M., Herzenberg, L., Blackwell, C., Weir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The handbook of Experimental Immunology. 43, 1-49 (1996).</li><li>Hulspas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+and+the+stability+of+phycoerythrin-tandem+dye+conjugates.">Flow cytometry and the stability of phycoerythrin-tandem dye conjugates.</a> Cytometry A. 75, 966-972 (2009).</li><li>Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+APC-tandem+dyes+are+degraded+through+a+cell-dependent+mechanism.">Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism.</a> Cytometry A. 75, 882-890 (2009).</li><li>Mandy, F., Brando, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+absolute+cell+counts+using+immunophenotypic+techniques.">Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6 (2001).</li><li>Vuckovic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dendritic+cells+in+clinical+practice+using+a+new+whole+blood+single-platform+TruCOUNT+assay.">Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay.</a> J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).</li><li>Lichtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+dendritic+cells+and+interferon-alpha+production+in+patients+with+tuberculosis:+correlation+with+clinical+outcome+and+treatment+response.">Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response.</a> Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).</li><li>Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+analysis+of+dendritic+cell+subsets:+the+dendritogram.">Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram.</a> Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).</li></ol>

Dans ce rapport, nous présentons une méthode basée sur cordon pour le dénombrement des populations de leucocytes dans le sang entier frais par cytométrie en flux et couvrir les paramètres nécessaires à son utilisation dans un essai clinique multicentrique avec analyse de l&#39;échantillon centralisée. Cette méthode s&#39;appuie sur le protocole et optimise BD Trucount et permet son utilisation fiable dans un cadre essai clinique multicentrique. L&#39;essai de coloration est simple et prend environ 45 minutes ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Trucount absolus Tubes de comptage </td><td> BD Biosciences </td><td> 340334 </td></tr><tr><td> FACS 10X solution de lyse </td><td> BD Biosciences </td><td> 349202 </td></tr><tr><td> Catégorie B &amp; système d&#39;expédition exonéré, isolé </td><td> Saf-T-Pak </td><td> STP-320 </td></tr><tr><td> CD45 anticorps monoclonal AmCyan </td><td> BD Biosciences </td><td> 339192 </td></tr><tr><td> CD3 FITC anticorps monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td></tr><tr><td> CD8 PerCP-Cy 5,5 anticorps monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 341051 </td></tr><tr><td> CD4 Alexa Fluor 700 Antibo monoclonaldy </td><td> BD Biosciences </td><td> 557922 </td></tr><tr><td> HLA-DR DPE anticorps monoclonal </td><td> Beckman Coulter </td><td> IM3636 </td></tr><tr><td> CD14 anticorps monoclonal V450 </td><td> BD Biosciences </td><td> 560349 </td></tr><tr><td> CD19 PE anticorps monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 555413 </td></tr><tr><td> CD16 APC-H7 anticorps monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 560195 </td></tr><tr><td> CD56 PE-Cy7 anticorps monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 335791 </td></tr><tr><td> CD11c APC anticorps monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 559877 </td></tr><tr><td> CD123 PE-Cy5 anticorps monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 551065 </td></tr></tbody></table>

enumeration of major peripheral blood leukocyte populations for multicenter clinical trials using a whole blood phenotyping assay

La cryoconservation des leucocytes du sang périphérique est largement utilisé pour conserver des cellules pour les évaluations de la réponse immunitaire dans les essais cliniques et offre de nombreux avantages pour la facilité et la standardisation des évaluations immunologiques, mais les effets néfastes de ce processus ont été observés sur certains sous-ensembles de cellules, telles que les granulocytes, les lymphocytes B , les cellules dendritiques et 1-3. Le dosage de leucocytes frais donne une image plus précise de l&#39;état dans vivo des cellules, mais il est souvent difficile à réaliser dans le cadre de vastes essais cliniques. Dosages de cellules fraîches dépendent des engagements volontaires et des délais, et si de temps, leur application peut être impossible en raison des heures de travail requis du personnel de laboratoire. En outre, lorsque les essais sont effectués dans plusieurs centres, les laboratoires avec les ressources et la formation nécessaires pour effectuer les dosages peuvent ne pas être situé à proximité suffisante de sites cliniques. Pour répondre à ces questions, nous avons développéloppé un panneau 11-couleur anticorps présentent une coloration qui peut être utilisé avec des tubes Trucount (Becton Dickinson, San Jose, CA) au phénotype et énumérer les principales populations de leucocytes dans le sang périphérique, ce qui donne plus robuste de type cellulaire renseignements précis que les tests comme un numération formule sanguine (CBC) ou des tests disponibles dans le commerce avec des panneaux conçus pour les tubes Trucount qui se colorent seulement pour quelques types cellulaires. La procédure de coloration est simple, ne nécessite que 100 ul de sang entier frais, et dure environ 45 minutes, ce qui permettrait aux standards du sang de traitement de laboratoires à effectuer. Il est adapté de la BD du tube Trucount fiche technique ( <a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">la version 8/2010</a> ). Le cocktail d&#39;anticorps coloration peut être préparé à l&#39;avance en vrac à un laboratoire d&#39;analyse central et expédiés aux laboratoires de traitement sur place. Stained tubes peuvent être fixéset congelé pour expédition au laboratoire d&#39;analyse central pour analyse par cytométrie en flux multicolore. Les données générées par ce panneau coloration peut être utilisé pour suivre l&#39;évolution des concentrations de leucocytes dans le temps par rapport à l&#39;intervention et pourrait facilement être développé afin d&#39;évaluer l&#39;état d&#39;activation des types de cellules spécifiques d&#39;intérêt. Dans ce rapport, nous démontrons la procédure utilisée par les techniciens de laboratoire de sang de traitement pour exécuter des taches sur du sang total frais et les mesures pour analyser ces échantillons colorés dans un laboratoire de test central supportant un essai clinique multicentrique. Les détails sur la vidéo de la procédure telle qu&#39;elle est pratiquée dans le cadre d&#39;un prélèvement sanguin essai clinique de vaccin contre le VIH pour les essais Network (HVTN).

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Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Dans ce rapport, nous démontrons les étapes de coloration et de l&#39;analyse d&#39;un test de phénotypage réalisé sur sang total frais d&#39;énumérer les principaux innées et adaptatives des populations leucocytaires. Nous insistons sur des considérations d&#39;effectuer ces procédures dans le cadre d&#39;un essai clinique multicentrique.

Énumération des principales populations de leucocytes périphériques sanguins pour essais cliniques multicentriques en utilisant un test de sang total Phénotypage

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

Appauvrissement des populations de cellules spécifiques par l&#39;épuisement Complément

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Recherche

Immunologie et infection

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansion, purification et d&#39;évaluation fonctionnelle des cellules NK humaines périphérique Sang

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Expansion du sang périphérique humain cellules T γδ utilisant zolédronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Présentation de contrainte de cisaillement dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

Un dosage sanguin fonctionnelle entier pour mesurer la viabilité des mycobactéries, en utilisant Reporter-Gene Tagged BCG ou M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

Évaluation rapide et spécifique de l&#39;halogénation peroxydase Activité dans les échantillons de sang enrichie en leucocytes

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

Utilisation d&#39;un monocytes monocouche Assay pour évaluer phagocytose Fcy Receptor médiée

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextrane augmente l’efficacité de la Transduction des gènes des cellules NK primaires murines et humaines

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Analyse unicellulaires lymphoblastiques et Production de cytokines dans le sang périphérique par cytométrie de flux massique

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Caractérisation des sous-ensembles de Monocyte humain de sang Flow Cytometry analyse

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...