Name: enumeration of major peripheral blood leukocyte populations for multicenter clinical trials using a whole blood phenotyping assay
Uploaded: 2012-09-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay at JoVE.com

Damos las gracias a Jessica Jones, Clark Erica, Ducar Constanza, Donna Smith, Lewis Roy, Apedaile Lily, Wiesner Joanne, Adams Devin, McBain Corey y Voght Stephen por su ayuda en el desarrollo de este método, manuscrito y video. Este trabajo fue financiado por la Fundación Bill y Melinda Gates CAVD subvención 38.645 (MJM) y los Institutos Nacionales de Salud subvenciones UM1 AI068618 y AI069481 U01 (MJM). EA-N. es apoyado por el NIH subvención T32 AI007140. Damos las gracias a la James B. Pendleton Charitable Trust por su donación generosa equipo.

Nota: Para proteger los anticuerpos conjugados con fluorocromo de la luz, realice todos los pasos en un gabinete de bioseguridad con la luz apagada. 1. Tinción de anticuerpos Panel Preparación <ol><li> El panel de tinción de anticuerpos se pueden encontrar en la Tabla 1. La concentración de anticuerpo debe ser definido por titulación con sangre entera y usando el equipo de citometría de flujo mismo y los procedimientos que se utilizarán para adquirir las mu...

<ol>
	<li>Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cryobiology+of+rat+and+human+dendritic+cells:+preservation+and+destruction+of+membrane+integrity+by+freezing.">The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing.</a> Cryobiology. 27, 269-278 (1990).</li><li>Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+lymphocyte+immunophenotype+and+proliferative+responses+in+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1-infected+donors:+implications+for+multicenter+clinical+trials.+The+ACTG+Immunology+Advanced+Technology+Laboratories.">Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).</li><li>Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+human+granulocytes:+study+of+granulocyte+function+and+ultrastructure.">Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure.</a> Blood. 56, 237-245 (1980).</li><li>Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+assurance+for+polychromatic+flow+cytometry.">Quality assurance for polychromatic flow cytometry.</a> Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).</li><li>Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D'Avanzo, G., D'Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytofluorometric+methods+for+assessing+absolute+numbers+of+cell+subsets+in+blood.+European+Working+Group+on+Clinical+Cell+Analysis.">Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis.</a> Cytometry. 42, 327-346 (2000).</li><li>Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+blood+processing+parameters+for+optimal+detection+of+cryopreserved+antigen-specific+responses+for+HIV+vaccine+trials.">Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials.</a> J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).</li><li>Kantor, A. B., Roederer, M., Herzenberg, L., Blackwell, C., Weir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The handbook of Experimental Immunology. 43, 1-49 (1996).</li><li>Hulspas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+and+the+stability+of+phycoerythrin-tandem+dye+conjugates.">Flow cytometry and the stability of phycoerythrin-tandem dye conjugates.</a> Cytometry A. 75, 966-972 (2009).</li><li>Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+APC-tandem+dyes+are+degraded+through+a+cell-dependent+mechanism.">Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism.</a> Cytometry A. 75, 882-890 (2009).</li><li>Mandy, F., Brando, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+absolute+cell+counts+using+immunophenotypic+techniques.">Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6 (2001).</li><li>Vuckovic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dendritic+cells+in+clinical+practice+using+a+new+whole+blood+single-platform+TruCOUNT+assay.">Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay.</a> J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).</li><li>Lichtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+dendritic+cells+and+interferon-alpha+production+in+patients+with+tuberculosis:+correlation+with+clinical+outcome+and+treatment+response.">Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response.</a> Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).</li><li>Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+analysis+of+dendritic+cell+subsets:+the+dendritogram.">Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram.</a> Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).</li></ol>

En este informe se presenta un método basado en perlas para enumerar las poblaciones de leucocitos en sangre entera fresca por citometría de flujo y cubrir los parámetros necesarios para su uso en un ensayo clínico multicéntrico con el análisis de muestras centralizado. Este método se basa en el protocolo y optimiza BD Trucount y permite su uso confiable en un entorno ensayo clínico multicéntrico. El ensayo de tinción es simple y toma aproximadamente 45 minutos para llevar a cabo, por lo que es factible para l...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Trucount absolutos Tubos de conteo </td><td> BD Biosciences </td><td> 340334 </td></tr><tr><td> FACS 10X Solución de lisis </td><td> BD Biosciences </td><td> 349202 </td></tr><tr><td> Categoría B &amp; Sistema de Envío Quito, con aislamiento </td><td> Saf-T-Pak </td><td> STP-320 </td></tr><tr><td> CD45 AmCyan anticuerpo monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 339192 </td></tr><tr><td> CD3 FITC anticuerpo monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td></tr><tr><td> CD8-PerCP Cy 5,5 anticuerpo monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 341051 </td></tr><tr><td> CD4 Alexa Fluor 700 Antibo monoclonaldy </td><td> BD Biosciences </td><td> 557922 </td></tr><tr><td> HLA-DR ECD anticuerpo monoclonal </td><td> Beckman Coulter </td><td> IM3636 </td></tr><tr><td> V450 CD14 anticuerpo monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 560349 </td></tr><tr><td> CD19 PE anticuerpo monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 555413 </td></tr><tr><td> CD16 APC-H7 anticuerpo monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 560195 </td></tr><tr><td> CD56 PE-Cy7 anticuerpo monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 335791 </td></tr><tr><td> CD11c APC anticuerpo monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 559877 </td></tr><tr><td> CD123 PE-Cy5 anticuerpo monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 551065 </td></tr></tbody></table>

enumeration of major peripheral blood leukocyte populations for multicenter clinical trials using a whole blood phenotyping assay

Crioconservación de leucocitos de sangre periférica se utiliza ampliamente para conservar las células para las evaluaciones de la respuesta inmune en los ensayos clínicos y ofrece muchas ventajas para la facilidad y la normalización de las evaluaciones inmunológicas, pero los efectos perjudiciales de este proceso se han observado en algunos subconjuntos de células, tales como los granulocitos, células B , y las células dendríticas 1-3. Ensayo de leucocitos frescas da una imagen más precisa del estado in vivo de las células, pero a menudo es difícil de realizar en el contexto de ensayos clínicos grandes. Los ensayos de células frescas dependen de compromisos voluntarios y los plazos, y si consume tiempo, su aplicación puede ser poco práctico debido a las horas de trabajo necesarias del personal de laboratorio. Además, cuando los ensayos se llevan a cabo en varios centros, laboratorios con los recursos y la capacitación necesarios para llevar a cabo los ensayos no pueden estar situados en la proximidad suficiente a los sitios clínicos. Para abordar estas cuestiones, tenemos que desarrorrollado un panel de anticuerpos 11-tinción de color que se puede utilizar con tubos de Trucount (Becton Dickinson, San Jose, CA) a fenotipo y enumerar las principales poblaciones de leucocitos en la sangre periférica, con un rendimiento más robusto de células de tipo información específica de ensayos tales como un Recuento sanguíneo completo (CSC) o ensayos comercialmente disponibles con paneles diseñados para tubos Trucount que manchan por sólo unos pocos tipos de células. El procedimiento de tinción es simple, requiere sólo 100 l de sangre entera fresca, y tarda aproximadamente 45 minutos, por lo que es factible para el estándar de procesamiento de la sangre para llevar a cabo los laboratorios. Es una adaptación de la hoja BD Trucount tubo técnica de datos ( <a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">versión 8/2010</a> ). El cóctel de anticuerpos de tinción puede ser preparado de antemano a granel en un laboratorio central de ensayo y se envían a los laboratorios de transformación en el lugar. Tubos manchados puede ser fijadoy se congelan para su envío al laboratorio de ensayo central para el análisis multicolor citometría de flujo. Los datos generados a partir de este panel de tinción se puede utilizar para rastrear los cambios en las concentraciones de leucocitos en el tiempo en relación con la intervención y fácilmente podrían ser desarrolladas para evaluar los estados de activación de tipos de células específicas de interés. En este informe, demuestran el procedimiento utilizado por los técnicos de laboratorio de procesamiento de sangre para realizar la tinción de sangre entera fresca y los pasos para analizar estas muestras teñidas en un laboratorio de ensayo de soporte central un ensayo clínico multicéntrico. Los detalles del video del procedimiento, ya que se realiza en el contexto de un proyecto de ensayo clínico de la sangre en la Red de Ensayos de Vacunas contra el VIH (HVTN).

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Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

En este informe, demuestran los pasos de tinción y análisis de un ensayo de fenotipo realiza en la sangre entera fresca para enumerar las principales poblaciones de leucocitos innatos y adaptativos. Hacemos hincapié en las consideraciones para llevar a cabo estos procedimientos en el contexto de un ensayo clínico multicéntrico.

La enumeración de las principales poblaciones de leucocitos de sangre periférica en ensayos clínicos multicéntricos utilizando un ensayo de sangre entera Fenotipado

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

El agotamiento de las poblaciones de células específicas por el agotamiento del complemento

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Investigación

Inmunología e Infección

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansión, purificación y evaluación funcional de la sangre periférica humana células NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Expansión de la sangre periférica humana de células T γδ con zoledronato

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

Un ensayo funcional de sangre completa para medir la viabilidad de las micobacterias, usando Reporter-Gene Tagged BCG o M. tuberculosis (BCG Lux / M. Tb Lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

Evaluación rápida y específica de la peroxidasa Actividad de halogenación en muestras de sangre enriquecida en leucocitos

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

El uso de una monocapa de monocitos Ensayo para evaluar la fagocitosis mediada por el receptor Fc gamma

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextrano mejora la eficiencia de transducción lentivirales de las células NK primaria murinas y humanas

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Análisis unicelular de Immunophenotype y producción de citoquinas en sangre periférica por citometría de masas

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Caracterización de subconjuntos de monocitos humanos de sangre análisis de citometría de flujo

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...