Name: enumeration of major peripheral blood leukocyte populations for multicenter clinical trials using a whole blood phenotyping assay
Uploaded: 2012-09-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay at JoVE.com

Vi tackar Jessica Jones, Erica Clark, Constance Ducar, Donna Smith, Roy Lewis, Lily Apedaile, Joanne Wiesner, Devin Adams, Corey McBain och Stephen Voght för deras hjälp i utvecklingen av denna metod manuskript och video. Detta arbete stöddes av Bill och Melinda Gates Foundation CAVD bidrag 38.645 (MJM) och National Institutes of Health bidrag UM1 AI068618 och U01 AI069481 (MJM). EA-N. stöds av NIH Grant T32 AI007140. Vi tackar James B. Pendleton Charitable Trust för deras generösa utrustning donation.

Obs: För att skydda fluoroforen-konjugerade antikroppar från ljus, utföra alla steg i en biosäkerhet skåp med lampan. 1. Antikroppsfärgning Panel Beredning <ol><li> Den antikroppsfärgning Panelen kan hittas i tabell 1. Antikroppskoncentrationen bör fastställas genom titrering med helblod och med samma utrustning flödescytometri och förfaranden som kommer att användas för att förvärva de färgade fenotypning prover. </li><li> När lämpliga färgning...

<ol>
	<li>Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cryobiology+of+rat+and+human+dendritic+cells:+preservation+and+destruction+of+membrane+integrity+by+freezing.">The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing.</a> Cryobiology. 27, 269-278 (1990).</li><li>Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+lymphocyte+immunophenotype+and+proliferative+responses+in+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1-infected+donors:+implications+for+multicenter+clinical+trials.+The+ACTG+Immunology+Advanced+Technology+Laboratories.">Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).</li><li>Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+human+granulocytes:+study+of+granulocyte+function+and+ultrastructure.">Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure.</a> Blood. 56, 237-245 (1980).</li><li>Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+assurance+for+polychromatic+flow+cytometry.">Quality assurance for polychromatic flow cytometry.</a> Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).</li><li>Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D'Avanzo, G., D'Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytofluorometric+methods+for+assessing+absolute+numbers+of+cell+subsets+in+blood.+European+Working+Group+on+Clinical+Cell+Analysis.">Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis.</a> Cytometry. 42, 327-346 (2000).</li><li>Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+blood+processing+parameters+for+optimal+detection+of+cryopreserved+antigen-specific+responses+for+HIV+vaccine+trials.">Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials.</a> J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).</li><li>Kantor, A. B., Roederer, M., Herzenberg, L., Blackwell, C., Weir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The handbook of Experimental Immunology. 43, 1-49 (1996).</li><li>Hulspas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+and+the+stability+of+phycoerythrin-tandem+dye+conjugates.">Flow cytometry and the stability of phycoerythrin-tandem dye conjugates.</a> Cytometry A. 75, 966-972 (2009).</li><li>Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+APC-tandem+dyes+are+degraded+through+a+cell-dependent+mechanism.">Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism.</a> Cytometry A. 75, 882-890 (2009).</li><li>Mandy, F., Brando, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+absolute+cell+counts+using+immunophenotypic+techniques.">Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6 (2001).</li><li>Vuckovic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dendritic+cells+in+clinical+practice+using+a+new+whole+blood+single-platform+TruCOUNT+assay.">Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay.</a> J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).</li><li>Lichtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+dendritic+cells+and+interferon-alpha+production+in+patients+with+tuberculosis:+correlation+with+clinical+outcome+and+treatment+response.">Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response.</a> Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).</li><li>Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+analysis+of+dendritic+cell+subsets:+the+dendritogram.">Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram.</a> Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).</li></ol>

I denna rapport presenterar vi en pärla-baserad metod för att räkna leukocytpopulationer i färskt helblod med flödescytometri och täcka de parametrar som krävs för dess användning i en multicenter klinisk prövning med centraliserad provanalys. Denna metod bygger på och optimerar BD Trucount protokollet och möjliggör dess tillförlitlig användning i en multicenter klinisk prövning inställning. Färgningen analysen är enkel och tar cirka 45 minuter att utföra, vilket gör det möjligt för blod bearbetni...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens Namn </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Trucount Absolute Räkna Rör </td><td> BD Biosciences </td><td> 340.334 </td></tr><tr><td> 10X FACS Lyseringslösning </td><td> BD Biosciences </td><td> 349.202 </td></tr><tr><td> Kategori B &amp; Undantagna Shipping system, Isolerad </td><td> SAF-T-Pak </td><td> STP-320 </td></tr><tr><td> CD45 AmCyan monoklonal antikropp </td><td> BD Biosciences </td><td> 339.192 </td></tr><tr><td> CD3 FITC monoklonal antikropp </td><td> BD Biosciences </td><td> 349.201 </td></tr><tr><td> CD8 PerCP-Cy 5,5 monoklonal antikropp </td><td> BD Biosciences </td><td> 341.051 </td></tr><tr><td> CD4 Alexa Fluor 700 monoklonal Antibody </td><td> BD Biosciences </td><td> 557.922 </td></tr><tr><td> HLA-DR-ECD monoklonal antikropp </td><td> Beckman Coulter </td><td> IM3636 </td></tr><tr><td> CD14 V450 monoklonal antikropp </td><td> BD Biosciences </td><td> 560.349 </td></tr><tr><td> CD19 PE monoklonal antikropp </td><td> BD Biosciences </td><td> 555.413 </td></tr><tr><td> CD16 APC-H7 monoklonal antikropp </td><td> BD Biosciences </td><td> 560.195 </td></tr><tr><td> CD56 PE-Cy7 monoklonal antikropp </td><td> BD Biosciences </td><td> 335.791 </td></tr><tr><td> CD11c APC monoklonal antikropp </td><td> BD Biosciences </td><td> 559.877 </td></tr><tr><td> CD123 PE-Cy5 monoklonal antikropp </td><td> BD Biosciences </td><td> 551.065 </td></tr></tbody></table>

enumeration of major peripheral blood leukocyte populations for multicenter clinical trials using a whole blood phenotyping assay

Frysförvaring av perifert blod leukocyter används flitigt för att bevara celler för immunsvar utvärderingar i kliniska prövningar och erbjuder många fördelar för enkel och standardisering av immunologiska bedömningar, men skadliga effekterna av denna process har observerats på vissa celler undergrupper såsom granulocyter, B-celler , och dendritiska celler 1-3. Analys färska leukocyter ger en mer rättvisande bild av in vivo tillstånd av cellerna, men är ofta svår att genomföra i samband med stora kliniska prövningar. Färska celler analyser är beroende av frivilliga åtaganden och tidsramar och om tidskrävande, kan tillämpningen vara opraktiskt på grund av arbetstiden som krävs av laboratoriepersonal. Dessutom, när prövningar på flera centra, kan laboratorierna med resurser och utbildning som krävs för att utföra analyserna inte placeras i tillräcklig närhet till kliniker. För att ta itu med dessa frågor, har vi utvecklatutvecklat en 11-färgpanelen antikroppsfärgning som kan användas med Trucount rör (Becton Dickinson, San José, CA) till fenotyp och räkna upp de viktigaste leukocytpopulationer inom perifert blod, vilket ger mer robust celltyp specifik information än analyser såsom blodstatus (CBC) eller försök med kommersiellt tillgängliga paneler avsedda för Trucount rör som färgas för bara några celltyper. Färgningsproceduren är enkel, kräver endast 100 pl färskt helblod, och tar cirka 45 minuter, vilket gör det möjligt för vanliga blodbehandlingsapparat laboratorier att utföra. Den är anpassad från BD Trucount röret Technical Data Sheet ( <a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">version 8/2010</a> ). Färgningen antikroppar cocktail kan förberedas i förväg i bulk till ett centralt analys laboratorium och transporteras till labbet webbplatsen bearbetning. Färgade rör kan fästasoch fryses för transport till den centrala analysen laboratorium för multicolor flödescytometrianalys. De data som genereras från denna färgning panelen kan användas för att spåra förändringar i leukocyt koncentrationer över tid i relation till intervention och skulle lätt kunna utvecklas ytterligare för att bedöma aktivering tillstånd av specifika celltyper av intresse. I denna rapport visar vi proceduren som används av blod-labbet tekniker för att utföra färgning på färskt helblod och stegen för att analysera dessa färgade prover på en central analys laboratorium som stöder en multicenter klinisk prövning. Videon detaljerna förfarandet som det utförs i samband med en klinisk prövning blodprovstagning i HIV Vaccine Trials Network (HVTN).

Watch this Scientific Journal Video about Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay at JoVE.com

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

I denna rapport visar vi färgning och analys steg i en fenotypning analys utförd på färskt helblod att räkna stora medfödda och adaptiva leukocytpopulationer. Vi betonar överväganden för att utföra dessa förfaranden inom ramen för en multicenter klinisk prövning.

Räkning av Stora perifera populationer blodleukocyt för kliniska multicenterstudier Använda en hel analys Blood Fenotypning

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

Utarmning av specifika cellpopulationer med Komplettera Utarmning

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansion, rening och Functional Assesment of Human Peripheral Blood NK-celler

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Utbyggnad av Human Peripheral Blood γδ T-celler med hjälp zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introduktion Shear stress i studien av bakteriell vidhäftning

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

En funktionell helblodsanalys att mäta livskraft mykobakterier, med hjälp av Reporter-Gene taggade BCG eller M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

Snabb och särskild bedömning av halogene peroxidasaktiviteten i Leukocyte berikad blodprover

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

Användning av en monocyt Monolayer analys för att utvärdera Fcy-receptor-medierad fagocytos

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran effektiviserar Lentiviral transduktion murina och mänskliga primära NK-celler

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Single-cell analys av Immunophenotype och cytokin produktion i perifera helblod via massa flödescytometri

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Karakterisering av mänskliga monocyt delmängder av helblod Flow flödescytometri analys

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...