Name: a simple protocol for platelet-mediated clumping of plasmodium falciparum-infected erythrocytes in a resource poor setting
Uploaded: 2013-05-16T12:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting at JoVE.com

Dette arbejde blev muliggjort af støtte fra Wellcome Trust. JM (080.964) og SCW (080.948), blev støttet af Wellcome Trust stipendier og DT af en Malawi-Liverpool-Wellcome Trust studentship.

1.. Sample Collection Blodplader kan nemt aktiveres gennem temperatur, agitation eller oplagring og de bør derfor håndteres med forsigtighed. Brugen af ​​vacutainers at indsamle blod for blodpladepræparatet er uundgåelig i de fleste kliniske situationer, men bør nøje overvejes som suge potentielt kan forårsage trombocyt aktivering. På grund af den kliniske protokol, der bruges på vores forskning hospital, er vores prøver omhyggeligt indsamlet i natriumcitrat vacutainers. Vi har ikke oplevet nogen problemer med for tidlig blodpladeaktivering i dette eller vores tidligere undersøgelse 12.. Vi indsamler blod til blodpladepræparatet fra blodtype O + enkeltpersoner til at minimere uspecifik blodgruppeantigen sammenlægning. Donorerne har heller ikke taget medicin i de foregående 7-10 dage som nogle stoffer er kendt for at påvirke trombocytfunktionen. 1.1 Fremstilling af blodpladerigt plasma (PRP) <ol><li> Saml cirka 5 mlfuldblod fra en malaria naiv vært eller 2,5 ml blod fra CM eller svær malaria (SM) patienter i en natriumcitrat vacutainer (BD Prod. 36276). </li><li> Centrifuger fuldblod ved 250 xg i 10 minutter ved stuetemperatur. Må ikke centrifugeres ved 4 ° C så lave temperaturer kan medføre blodpladerne til aggregat. </li><li> Forsigtigt overføre uklar supernatant i et rent 15 ml rør. Blodplader let aktiveres ved temperaturvariationer og fysiske stød og bør derfor håndteres med forsigtighed. Undgå at ryste eller nogen rykvise bevægelser af røret. </li><li> Brug en Neubauer s haematocytometer at tælle og justere blodpladesuspensionen til&gt; 300 x 10 3 blodplader / ul for raske donorer og &lt;150 x 10 3 blodplader / ul fra CM og SM patienter ved hjælp 1X phosphatbuffer (pH 7,2-7,4, PBS). Sørg for at vælge en høj fortyndingsfaktor at lette blodplader og sikre dens nøjagtighed. </li></ol> Note: Malaria patients har en reduceret blodpladetal i forhold til de raske individer 16,17,18. Derfor trombocyttal koncentrationer for CM og UM er justeret i henhold til de gennemsnitlige blodpladetal for patienter inden for hver malaria diagnostisk gruppe. P. falciparum sammenklumpning fænotype er almindelig i CM isolater og viser en stærk bindingsaffinitet derfor reducerede blodplader koncentrationer påvirker ikke klump størrelse eller hyppighed, da blodpladekoncentrationen er standardiseret for alle CM tilfælde. 1.2 Udarbejdelse af blodpladefattigt plasma (PPP) <ol><li> At opnå PPP, centrifugeres en del af PRP ovenfor opnåede ved 1.500 xg i 10 min. Størstedelen af ​​blodpladerne pelleteres ved bunden af ​​røret. </li><li> Både PRP og PPP kan opbevares ved 4 ° C i op til to uger. Ideelt bruge friske blodplader til sammenklumpning assay. Efter 8-10 dage fleste af blodplader er sandsynligvis at være inaktiv og sandsynligvis aggregeret. </li></ol> 2.. Parasite Culture <ol><li> Vask de pelleterede PRBC tre gange med 5-10 ml RPMI 1640 ved centrifugering ved 370 xg i 5 min. Bemærk: I denne protokol alle kulturer startede fra cirka 1 ml pakkede cellevolumen (PCV) og fastholdes på 5% hæmatokrit. Kulturer kan startes med nogen hæmatokrit på PRBC og justeres med inficerede RBC og medier til at nå den ønskede hæmatokrit. </li><li> Placer PRBC i en kultur kolbe og supplerer med standard malaria dyrkningsmedium RPMI 1640 suppleret med 25 mM HEPES, 5% Albumax II eller 10% serum og 40 pg / ml gentamycin at opnå en 5% hæmatokrit. </li><li> Permeat dyrkningskolberne med en blanding af 92,5% nitrogen, 2,5% oxygen og 5% carbondioxid før forsegling og inkubering. Alternativt kan den lufttætte lys krukke metode Trager-Jensen anvendes. </li><li> For PRBC opnået direkte fra patienter, inkuberes deres kultur kolbe i 24-36 timer i en 37 ° C inkubator i 5% CO 2 for at få modne parasitter. BEMÆRK: Most laboratorie og kultur-tilpassede linjer er meget nemme at vedligeholde i kultur under standardbetingelser. Der er enkle nedenfor beskrevne teknikker, der kan bruges til at synkronisere forskellige parasit stadier at fastholde væksten. </li><li> Forbered en tynd blodudstrygning som beskrevet nedenfor og undersøge parasit modning under et lysmikroskop. </li></ol> 3.. Thin Blood Film Slide Forberedelse <ol><li> Anbring ca 10-15 ul blod på den ene ende af en matteret glasplade hviler på en flad overflade. </li><li> Tryk bloddråben med kanten af ​​en anden dias, indtil blodet er jævnt fordelt over kanten af ​​det andet dias. </li><li> Mens du holder den anden slide i en 45 ° vinkel, hurtigt, men forsigtigt, uden at lægge for meget pres på det første dias, skal du skubbe blodet hen over den første slide til at lave en tynd film af blod, der er jævnt fordelt. Lufttørre. </li><li> Dyp slide i methanol i 10 sek. Lufttørre. </li><li> Dyp dias i 2% Giemsa stain for mindst 10 minutter. Skyl grundigt, indtil vandet er klart. Lufttørre. </li><li> Undersøg dias ved hjælp af en 90-100x olie emulsion linse på et lysmikroskop </li></ol> 4.. Oprensning og synkronisering af Asexual Stages Oprensningen af modent P. falciparum PRBC er en nødvendig skridt for sammenklumpning assay. Faktisk kun modne parasitter er i stand til at binde til blodplade-receptorer, som det er på dette stadie i livscyklussen, at de relevante ligander udtrykkes og stikker ud fra overfladen af ​​inficerede erytrocytter. Der er flere metoder til at rense og synkronisere ukønnede stadier af P. falciparum: Sene ukønnede stadier kan beriges med Percoll gradient 19, magnetisk cellesortering 20 eller ved hjælp af gelatine sedimentering 21 protokollen beskrevet her.. Sorbitol-synkronisering udvælger ring trin 22, hvorefter ringene dyrkes i 24-26 timer til opnåelse af modne stadier (uden need at udføre gelatine flotation). 4.1 Plasmagel Flotation Plasmagel flotation anvender gelatine-lignende løsning at selektere for lavere vægt knobbed erytrocytter til at forblive i opløsning, mens de tætte ringformer og rosetter synke til bunds. Denne teknik giver op til 90% renhed af de modne fase-inficerede erytrocytter og kan bruges til både feltet og laboratorie-isolater. Men som tidligere nævnt, Plasmagel flotation fjerner rosettering PRBC samt umodne stadier, der kan resultere i en reduceret sammenklumpning frekvens i disse prøver med en høj rosettering frekvens. Imidlertid ville fravær af rosettering PRBC efter Plasmagel flotation ikke påvirke sammenklumpning assay fordi rosetterende er en vekselvirkning af PRBC og uinficerede erythrocytter mens sammenklumpning er pRBCs bindende medieret af blodplader. Den ligand involveret i disse to træk er anderledes, med primært supplere receptor CR-1 på inficerede erytrocytter medierende rosettering.<ol><li> Forvarm Gelofusine opløsning og serum / Albumax II-frit medium til 37 ° C i et vandbad. </li><li> Overføre kulturen til en ren steril 15 ml rør og pelletere cellerne ved centrifugering ved stuetemperatur ved 370 xg i 5 min. </li><li> Forsigtigt aspireres supernatanten således ikke at forstyrre pelleten og resuspender celler i et lige volumen Gelofusine og protein-frit medium. </li><li> Overfør blandingen til et sterilt 15 ml glas og lad det stå i 15-20 min i en 37 ° C inkubator, eller indtil en klar afgrænsning kan ses mellem en øvre og nedre niveau. </li><li> Omhyggeligt overføre det øvre lag til et frisk sterilt 15 ml rør, og der tilsættes 10 ml frisk RPMI. </li><li> Centrifuger ved 370 xg i 5 min og omhyggeligt kassere supernatanten. </li><li> Vurdere parasitaemia og udviklingsstadiet af tynd blodudstrygning og undersøges i et lysmikroskop, som beskrevet i afsnit 4. </li></ol> BEMÆRK: Ældre PRBC interval mellem 60-90% af inficerede erytrocytter depending på den oprindelige parasitæmi af kulturen. For høj procentdel af modne parasitter, bruge kulturer med en initial parasitæmi på ≥ 10%. 5.. Sammenklumpning Assay <ol><li> Brug en Neubauer s haematocytometer at tælle og justere PRBC suspensionen opnået efter Plasmagel flotation til 1 x 10 8 PRBC / ul. </li><li> I en frisk 1,5 ml rør. Resuspender PRBC ved 5% hæmatokrit, acridinorange ved 20 ug / ml endelig koncentration og PRP ved 10% af den samlede mængde I stedet for acridinorange, kan parasit kulturer farves med 25 ug / ml ethidiumbromid i 5 minutter før brug. F.eks For en 200 gl reaktion mix, tilsættes 10 ul modne PRBC, 20 ul 300 x 10 3 blodplader / ul for PRP fra raske donorer eller 150 x 10 3 blodplader / mikroliter fra SM patienter og 170 gl af protein-frit medium. BEMÆRK: Forholdet mellem blodplader: PRBC i de afsluttende reaktioner er 20:1. Dette er vigtigt, da der tillader maksimeum sammenklumpning frekvensen af ​​en prøve, der skal bestemmes. Hvis der er færre blodplader er tilføjet i kontrollen, så er ikke alle sammenklumpning pRBCs kunne have en chance for at klumpe. </li><li> På samme måde fremstille følgende kontrol; inficerede røde blodlegemer og PRP, og PRBC med PPP at fastslå rolle af blodplader i pRBCs sammenklumpning. </li><li> Overfør suspensionen til en 1,5-2,0 ml konisk skruelåg hætteglas. </li><li> Placer hætteglasset under forsigtig omrøring ved valsning ved 10-12 rpm ved stuetemperatur. </li><li> Check for klump formation med en våd-slide fremstillet ved pipettering 10 pi PRBC ± trombocyttal mix på en glasplade, dække med et glas glide og undersøges i fluorescens. </li><li> Prøveudtagning kan gøres på 15-20 minutters intervaller i alt 120 min. En klump betragtes som et aggregat af tre eller flere inficerede erytrocytter. </li></ol>

<ol>
	<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li><li>Saul, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+variant+surface+antigens+on+malaria-infected+red+blood+cells.">The role of variant surface antigens on malaria-infected red blood cells.</a> Parasitol. Today. 15, 455-457 (1999).</li><li>Miller, L. H., Good, M. F., Milon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+pathogenesis.">Malaria pathogenesis.</a> Science. 264, 1878-1883 (1994).</li><li>Newbold, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-specific+adhesion+and+clinical+disease+in+Plasmodium+falciparum.">Receptor-specific adhesion and clinical disease in Plasmodium falciparum.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 389-398 (1997).</li><li>Turner, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunohistochemical+study+of+the+pathology+of+fatal+malaria.+Evidence+for+widespread+endothelial+activation+and+a+potential+role+for+intercellular+adhesion+molecule-1+in+cerebral+sequestration.">An immunohistochemical study of the pathology of fatal malaria. Evidence for widespread endothelial activation and a potential role for intercellular adhesion molecule-1 in cerebral sequestration.</a> Am. J. Pathol. 145, 1057-1069 (1994).</li><li>Fried, M., Duffy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherence+of+Plasmodium+falciparum+to+chondroitin+sulfate+A+in+the+human+placenta.">Adherence of Plasmodium falciparum to chondroitin sulfate A in the human placenta.</a> Science. 272, 1502-1504 (1996).</li><li>Rowe, J. A., Moulds, J. M., Newbold, C. I., Miller, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P.+falciparum+rosetting+mediated+by+a+parasite-variant+erythrocyte+membrane+protein+and+complement-receptor+1.">P. falciparum rosetting mediated by a parasite-variant erythrocyte membrane protein and complement-receptor 1.</a> Nature. 388, 292-295 (1997).</li><li>Udomsangpetch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+-infected+erythrocytes+form+spontaneous+erythrocyte+rosettes.">Plasmodium falciparum -infected erythrocytes form spontaneous erythrocyte rosettes.</a> J. Exp. Med. 169, 1835-1840 (1989).</li><li>Rowe, J. A., Kyes, S. A., Rogerson, S. J., Babiker, H. A., Raza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+conserved+Plasmodium+falciparum+var+gene+implicated+in+malaria+in+pregnancy.">Identification of a conserved Plasmodium falciparum var gene implicated in malaria in pregnancy.</a> J. Infect. Dis. 185, 1207-1211 (2002).</li><li>Biswas, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+uses+gC1qR/HABP1/p32+as+a+receptor+to+bind+to+vascular+endothelium+and+for+platelet-mediated+clumping.">Plasmodium falciparum uses gC1qR/HABP1/p32 as a receptor to bind to vascular endothelium and for platelet-mediated clumping.</a> PLoS Pathog. 3, 1271-1280 (2007).</li><li>Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+accumulation+in+brain+microvessels+in+fatal+pediatric+cerebral+malaria.">Platelet accumulation in brain microvessels in fatal pediatric cerebral malaria.</a> J. Infect. Dis. 187, 461-466 (2003).</li><li>Wassmer, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-induced+clumping+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+from+Malawian+patients+with+cerebral+malaria-possible+modulation+in+vivo+by+thrombocytopenia.">Platelet-induced clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes from Malawian patients with cerebral malaria-possible modulation in vivo by thrombocytopenia.</a> J. Infect. Dis. 197, 72-78 (2008).</li><li>Mayor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+severe+malaria+outcomes+with+platelet-mediated+clumping+and+adhesion+to+a+novel+host+receptor.">Association of severe malaria outcomes with platelet-mediated clumping and adhesion to a novel host receptor.</a> PLoS One. 6, e19422 (2011).</li><li>Arman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Mediated+Clumping+of+Plasmodium+falciparum+Infected+Erythrocytes+Is+Associated+with+High+Parasitemia+but+Not+Severe+Clinical+Manifestations+of+Malaria+in+African+Children.">Platelet-Mediated Clumping of Plasmodium falciparum Infected Erythrocytes Is Associated with High Parasitemia but Not Severe Clinical Manifestations of Malaria in African Children.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 77, 943-946 (2007).</li><li>Arman, M., Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+conditions+affect+the+outcome+of+Plasmodium+falciparum+platelet-mediated+clumping+assays.">Experimental conditions affect the outcome of Plasmodium falciparum platelet-mediated clumping assays.</a> Malar. J. 7, 243 (2008).</li><li>Beale, P. J., Cormack, J. D., Oldrey, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombocytopenia+in+malaria+with+immunoglobulin+(IgM)+changes.">Thrombocytopenia in malaria with immunoglobulin (IgM) changes.</a> Br. Med. J. 1, 345-349 (1972).</li><li>Jy, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+aggregates+as+markers+of+platelet+activation:+characterization+of+flow+cytometric+method+suitable+for+clinical+applications.">Platelet aggregates as markers of platelet activation: characterization of flow cytometric method suitable for clinical applications.</a> Am. J. Hematol. 57, 33-42 (1998).</li><li>Wilson, J. J., Neame, P. B., Kelton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection-induced+thrombocytopenia.">Infection-induced thrombocytopenia.</a> Semin. Thromb. Hemost. 8, 217-233 (1982).</li><li>Wahlgren, M., Berzins, K., Perlmann, P., Persson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+humoral+immune+response+in+Plasmodium+falciparum+malaria.+II.+IgG+subclass+levels+of+anti-P.+falciparum+antibodies+in+different+sera.">Characterization of the humoral immune response in Plasmodium falciparum malaria. II. IgG subclass levels of anti-P. falciparum antibodies in different sera.</a> Clin. Exp. Immunol. 54, 135-142 (1983).</li><li>Uhlemann, A. C., Staalsoe, T., Klinkert, M. Q., Hviid, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells.">Analysis of Plasmodium falciparum-infected red blood cells.</a> MACS. 4, 7-8 (2000).</li><li>Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+mature-stage+Plasmodium+falciparum+by+gelatine+flotation.">Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation.</a> Ann. Trop. Med. Parasitol. 88, 209-211 (1994).</li><li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li><li>Chotivanich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-induced+autoagglutination+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells+and+disease+severity+in+Thailand.">Platelet-induced autoagglutination of Plasmodium falciparum-infected red blood cells and disease severity in Thailand.</a> J. Infect. Dis. 189, 1052-1055 (2004).</li><li>Pain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-mediated+clumping+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+is+a+common+adhesive+phenotype+and+is+associated+with+severe+malaria.">Platelet-mediated clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes is a common adhesive phenotype and is associated with severe malaria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 1805-1810 (2001).</li><li>Wallace, M. A., Agarwal, K. C., Garcia-Sainz, J. A., Fain, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-adrenergic+stimulation+of+phosphatidylinositol+synthesis+in+human+platelets+as+an+alpha-2+effect+secondary+to+platelet+aggregation.">Alpha-adrenergic stimulation of phosphatidylinositol synthesis in human platelets as an alpha-2 effect secondary to platelet aggregation.</a> J. Cell Biochem. 18, 213-220 (1982).</li><li>Zhou, L., Schmaier, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+aggregation+testing+in+platelet-rich+plasma:+description+of+procedures+with+the+aim+to+develop+standards+in+the+field.">Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field.</a> Am. J. Clin. Pathol. 123, 172-183 (2005).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

Vi har beskrevet en blodplade-medieret sammenklumpning assay anvendes til at studere PRBC i kliniske isolater direkte i marken. Blodplade-medieret sammenklumpning, en karakteristisk opførsel i P. falciparum kliniske isolater, er blevet identificeret som en særskilt klæbende fænotype hyppige i CD36-bindende isolater 12,23-24. Vi har brugt denne analyse til at identificere tre hovedpunkter: 1) en stærk in vitro sammenklumpning fænotype af P. falciparum isoleret fra Malawi børn, der er forbundet med sygdommens sværhedsgrad og diagnosticering 2) hidtil ukendte receptor P-selectin mediaties sammenklumpning på blodplader sammen med CD36, 3) graden af trombocytopeni stede hos patienter med CM er tilstrækkelig til at begrænse yderligere dannelse af PRBC klumper i vitro 12.. Inddragelsen af ​​blodplader i klump formation demonstreres ved at undersøge en våd-slide præparat som beskrevet i afsnit 6. Blodplader kan isoleres fra PRP ved centrifugering ved høje hastighederfor at minimere blodgruppe antigene reaktioner, men vi brugte hele PRP for at minimere for tidlig blodpladeaktivering fra overdreven håndtering og fra højhastigheds-centrifugering. Blodplade aktivitet kan måles ved blodpladeaggregering test med svage blodplade agonister epinephrin eller adenosindiphosphat (ADP) 25 som beskrevet i 26.. Der er flere aspekter af analysen, der tidligere har været dårligt karakteriserede, en af ​​dem er vigtigheden af ​​at vælge PRP kilder og effekten af ​​blod antigen grupper om resultatet af analysen. Vi forberedte PRP fra personer, der var blodtype O + og ikke havde taget nogen medicin i de sidste 7-10 dage, før der trækkes blod, da nogle lægemidler kan påvirke blodplader adfærd. Andre faktorer, der kan påvirke sammenklumpning succes omfatte PRBC hæmatokrit, parasitæmi niveauer, og længden af ​​den sammenklumpning analysen. Ved hjælp af high hæmatokrit og blodplader coUNT ville det være vanskeligt at sige, om klyngen er virkelig en klump, eller om for mange celler blot sidder sammen, fordi de tætbefolkede er pakket 15.. Sammenklumpning også generelt stiger med længere inkubationstider. Disse er alle nyttige retningslinjer, der bør overvejes, når designe sammenklumpning studier. Vi finder, at prøver fra forskellige kliniske grupper kan analyseres parallelt med PRP fra samme donor, hvis det er muligt at gøre det, men i begrænset ressource indstillinger såsom marken sites transfusion puljen er generelt begrænset. Det er derfor vanskeligt at have en enkelt O + donor at standardisere assays. Vi har derfor identificeret flere O + donorer for at sikre blodtype kompatibilitet muligt. Brug af flere donorer er også nyttigt i tilfælde af store prøver størrelser, så byrden af ​​bloddonation ikke falder på kun én person. Prøvetagningssteder på 15-20 min er langt mere realistisk, hvis en enkelt person udfører analyserne, der giver mulighed for wet-præparede og udførelse assay kinetik uden prøvetagningstidsrum overlappende. De fleste af de mikroskopiske data visuel og noget mål; derfor er det vigtigt, at celletælling verificeres ved mere end én person. I så fald kan håndtere en prøve på et tidspunkt tillader komplet analyse på tre til fire prøver om dagen, afhængigt af personlig effektivitet. Blodplade-medieret sammenklumpning kan udføres ved hjælp af både kliniske og laboratoriemæssige isolater. Til laboratorie linjer, anbefales det, at CD36 bindende parasitter bruges til at maksimere sammenklumpning frekvenser. Assayet kan kobles med andre agglutineringsassays såsom rosettering eller anvendes i sammenklumpning inhiberingsassays som kan muliggøre studiet af receptorer på blodpladerne, der kan mediere PRBC binding, en dårligt forstået og undersøgt aspekt af denne fænotype.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>21870-092</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acridine orange</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A3568</td>
 <td>10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gelofusine</td>
 <td>B Braun</td>
 <td>Gelofusine</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M HEPES</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15630</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gentamycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15750045</td>
 <td>50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumax</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>1102-037</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium citrate vacutainer</td>
 <td>BD</td>
 <td>362760</td>
 <td>4 ml capacity</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>MD16000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>EL6000</td>
 <td>Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a simple protocol for platelet-mediated clumping of plasmodium falciparum-infected erythrocytes in a resource poor setting

P. falciparum forårsager de fleste alvorlige malariainfektioner. De patofysiologiske mekanismer bag cerebral malaria (CM) er ikke fuldt forstået, og flere hypoteser er blevet fremsat, herunder mekanisk obstruktion af mikrokar af P. falciparum-parasitized røde blodlegemer (PRBC). I løbet af de intra-erythrocytiske stadie af sin livscyklus, P. falciparum har den unikke evne til at modificere overfladen af den inficerede erythrocyt ved at eksportere overfladeantigener med varierende klæbende egenskaber på RBC membranen. Dette tillader beslaglæggelse af PRBC i flere væv og organer ved adhæsion til endotelceller foring microvasculature af post-kapillære venules 1.. Ved at gøre dette, undgå de modne former af parasitten milten clearance af de deforme inficerede erytrocytter 2 og begrænser deres omgivelser til et gunstigere lavt ilt tryk 3.. Som en konsekvens af denne sequestration, er det kun umodne ukønnede parasitter og gametocytter, som kan påvises i det perifere blod. Cytoadherence og binding af modne PRBC til de mange vært receptorer udtrykt på mikrovaskulære senge forekommer i svær og ukompliceret sygdom. Men flere linjer af beviser tyder på, at kun specifikke klæbende fænotyper vil sandsynligvis være forbundet med alvorlige patologiske resultater af malaria. Et eksempel på sådanne specifikke vært-parasit interaktioner er blevet påvist in vitro, hvor evnen af intercellulært adhæsionsmolekyle-1 at støtte binding af PRBC med bestemte klæbeegenskaber har været knyttet til udviklingen af cerebral malaria 4,5. Moderkagen er også blevet anerkendt som en lokalitet af præferentiel PRBC akkumulering i malaria-inficerede gravide kvinder med chondrotin sulfat A udtrykt på syncytiotrophoblasts som linje placenta intervillous plads som den vigtigste receptor 6.. Rosetdannelse af PRBC to inficerede erytrocytter via komplement-receptor 1 (CD35) 7,8 er også blevet forbundet med alvorlig sygdom 9.. En af de mest nyligt beskrevet P. falciparum cytoadherence fænotyper er evnen til PRBC til dannelse blodplade-medierede klumper in vitro. Dannelsen af ​​sådanne PRBC klumper kræver CD36, et glycoprotein udtrykt på overfladen af ​​blodplader. Andet humane receptor, gC1qR/HABP1/p32, udtrykkes på forskellige celletyper, herunder endotelceller og blodplader, har også vist sig at lette PRBC vedhæftning på blodplader at danne klumper 10. Hvorvidt sammenklumpning sker in vivo er fortsat uklart, men det kan tage højde for den betydelige akkumulering af blodplader er beskrevet i hjernen microvasculature af Malawi børn, der døde fra CM 11. Desuden isolere evne kliniske kulturer til at klumpe in vitro var direkte forbundet med sygdommens alvorlighed i malawianske 12 </sup&gt; Og mozambiquiske patienter 13, (men ikke i malisisk 14). Med flere aspekter af PRBC sammenklumpning fænotype dårligt karakteriseret har igangværende undersøgelser om dette emne ikke fulgt en standardiseret procedure. Dette er et vigtigt problem på grund af den kendte høje variabilitet iboende i assayet 15.. Her præsenterer vi en metode til in vitro trombocyt-medieret sammenklumpning af P. falciparum med håber, at det vil give en platform for en konsekvent metode til andre grupper og øge kendskabet til de begrænsninger i at undersøge denne fænotype i fremtidige studier. Være baseret i Malawi, leverer vi en protokol specielt designet til en begrænset ressource indstilling, med den fordel, at frisk indsamlede kliniske isolater kan undersøges for fænotype uden behov for nedfrysning.

Et eksempel på en blodplade-medieret klump assay under anvendelse cirka 70% modne stadier af P. falciparum efter tilsætning af Plasmagel flotation er vist i figur 2.. En klump er et aggregat af tre eller flere inficerede erytrocytter. Farvning med acridinorange eller ethidiumbromid kan visualiseres ved fluorescensmikroskopi. Acridinorange er spektralt svarer til fluorescein, med et excitationsmaksimum ved 502 nm og en emissionsbølgelængde maksimum ved 525 nm (grøn), mens ethidiumbromid har et excitationsmaksimum ved 493 nm og en emissionsbølgelængde maksimum ved 620 nm (svarende til rhodamin farvestoffer, rød ). Klumper let opdaget under mikroskop som i normalt lys de fremstår som celleaggregater og under fluorescens som pletter af grønt eller rødt, når farves med acridinorange eller ethidiumbromid farvestoffer, henholdsvis, som vist i figur 2 (30 min tidspunkt ved hjælp af acridinorange ). Jo større klumper, jo større celleaggregatudvikling vises under normalt lys og større pletter af grønt eller rødt under fluorescerer de respektive farvestoffer. Da farvestoffer mål-DNA og derfor pletten kerner, blodplader og ikke-inficerede RBC ikke detekteres under fluorescerende mikroskopi grund af deres mangel på kerner. Random dannelse af små PRBC klumper af 4,7 ± 1,6 pRBCs / klump opstå efter 30 min. Klump størrelse øger til et gennemsnit på&gt; 15 PRBC / klumper efter inkubation i 120 min med nogle klumper indeholdende talrige PRBC / klump, der ikke kunne visuelt tælles. Frekvensen af ​​den sammenklumpning fænotype beregnes som antallet af inficerede celler til stede i klumper / 1.000 inficerede celler, tælles i dublerede assays. <img alt="Figur 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1.jpg" /> Figur 1. Arbejde flow for sammenklumpning eksperiment. Trombocyt rICH og fattige plasma (A) og en P. falciparum-inficerede erythrocyt kultur (B) fremstilles og kombineres derefter for sammenklumpning assay (C). <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2.jpg" /> Figur 2. Sammenklumpning af erythrocytter inficeret med P. falciparum laboratorieisolat. Klumper dannet af HB3 til tiden 0, 30 og 120 minutter i blodpladerigt plasma (A) og dårlig klump dannelse i blodpladefattigt plasma (B). Assay Begrænsninger Der er begrænsninger, der specifikt berører trombocytfunktionen eller indflydelse udfald og de ​​fleste af dem er allerede blevet fremhævet af Arman og Rowe 15.. Her nævner vi nogle af de potentielle problemer, der kan opstå ved Forskelnt faser af assayet: <ol><li> Tilpasning kliniske isolater in vitro kultur kan være en udfordring, som undertiden længere kultur perioder er nødvendige for at opnå en høj nok parasitæmia at tillade dannelse af klumper. Med høje antigene variation satser i P. falciparum, vil limen fænotype af kulturen tilpasset parasit ikke afspejle den oprindelige inficerende parasit befolkning efter lange tider i kultur. </li><li> For at undgå ikke-specifik agglutination grund blodtypeantigener, bør trombocyt donorer blive matchet til blodgruppeantigen med kliniske isolater, der anvendes i det samme assay, eller den universelle donorblod antigen gruppe O-brugt. Men personer med blodtype O-er sjældne i afrikanske steder såsom Malawi og derfor blodplader almindeligt anvendt opnås fra blodtype O + donorer, og er nødt til at blive matchet til blodtype. </li><li> Optælling klumper på en våd slide forberedelse er besværligt og udfordrende for billedoptagelse som calen er i konstant bevægelse. Normalt PRBC ophobes på kanterne af dækglasset eller de har tendens til at klæbe sammen danne &quot;falske&quot; klumper, der let kan forveksles med virkelige klumper. For at reducere celle bevægelse, tillader cellerne at bundfælde i 15 minutter ved stuetemperatur før analyse. </li><li> Den sammenklumpning analysen er tidsfølsomme, og derfor tillader kun én prøve, der skal analyseres per person ad gangen for optimal nøjagtighed. Sampling tidspunkter for to forskellige prøver kan let overlapper hinanden, hvilket resulterer forkerte prøvetagningstid points mellem prøverne, hvis håndterer mere end én prøve på samme tid. Under sådanne omstændigheder kan en avanceret kvantitativ software beregne klump størrelser eller alternativt celle-specifikke antistoffer kan anvendes til at analysere sammensætningen af ​​klumper. Mens disse teknikker i høj grad kunne forbedre betydningen af ​​dataene i ressourcefattige miljøer, hvor denne test er sandsynligvis vil blive anvendt, sådanne teknikker og udstyr, er ikke let tilgængelige. </li></ol>

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting at JoVE.com

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Denne metode undersøger blodplade-medieret sammenklumpning fænotype<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Inficerede erytrocytter (PRBC) i kliniske isolater. Dette udføres ved at isolere og co-inkubere blodpladerigt plasma og en suspension af PRBC.

A Simple Protokol for Platelet-medieret sammenklumpning af<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Smittede Erythrocytes i en ressource Poor indstilling

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex protokol til DNA-ekstraktion fra<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

En protokol til at analysere Hepatitis C virus Replication

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Oprensning af<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoites Til brug i opsoniserende antistofanalyser

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

En enkel og hurtig protokol til ikke-enzymatisk dissociere frisk humant væv til analyse af lymfocytter

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Metoder til undersøgelse af Regulatory rolle små RNA og Ribosomal Belægning af<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...