Name: a simple protocol for platelet-mediated clumping of plasmodium falciparum-infected erythrocytes in a resource poor setting
Uploaded: 2013-05-16T12:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting at JoVE.com

Dit werk werd mogelijk gemaakt door financiële steun van de Wellcome Trust. JM (080.964) en SCW (080.948) werden ondersteund door Wellcome Trust beurzen en DT door een Malawi-Liverpool-Wellcome Trust studententijd.

1. Monsterneming Bloedplaatjes kunnen eenvoudig worden geactiveerd door middel van temperatuur, agitatie of opslag en daarom moeten ze met zorg worden behandeld. Het gebruik van vacutainers om bloed in te zamelen voor bloedplaatjes voorbereiding is onvermijdelijk in de meeste klinische situaties, maar moet zorgvuldig worden overwogen als zuigkracht kan mogelijk leiden tot activering van bloedplaatjes. Vanwege het klinische protocol dat wordt gebruikt in ons onderzoek het ziekenhuis, zijn onze monsters zorgvuldig verzamelde in natriumcitraat vacutainers. We hebben geen problemen met vroegtijdige activering van plaatjes in deze of onze vorige studie 12 meegemaakt. Wij verzamelen van bloed voor bloedplaatjes voorbereiding van bloedgroep O + individuen om niet-specifieke bloedgroep antigen aggregatie minimaliseren. Donoren ook niet opgenomen geneesmiddel in de voorafgaande 7-10 dagen omdat sommige geneesmiddelen is bekend bloedplaatjesfunctie beïnvloeden. 1.1 Bereiding van bloedplaatjes-rijk plasma (PRP) <ol><li> Verzamel ongeveer 5 mlvan volbloed van een malaria-naïeve gastheer of 2,5 ml bloed uit CM of ernstige malaria (SM) patiënten in een natriumcitraat vacutainer (BD productnummer 36276). </li><li> Centrifugeer de volbloed bij 250 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Niet centrifugeren bij 4 ° C zo lage temperaturen de bloedplaatjes aggregatie veroorzaken. </li><li> Overdracht zorgvuldig de bewolkte supernatant in een schone 15 ml buis. Bloedplaatjes zijn gemakkelijk geactiveerd door temperatuurschommelingen en schokken en moet daarom met zorg worden behandeld. Vermijd schudden of schokkerige bewegingen van de buis. </li><li> Gebruik een Neubauer haematocytometer de bloedplaatjessuspensie tellen en aanpassen&gt; 300 x 10 3 bloedplaatjes / ul voor gezonde donors en &lt;150 x 10 3 bloedplaatjes / gl van GH en SM patiënten die 1X fosfaatbuffer (pH 7,2-7,4, PBS). Zorg ervoor dat u kiest voor een hoge verdunningsfactor om het aantal bloedplaatjes te verminderen en de juistheid ervan te waarborgen. </li></ol> Opmerking: Malaria patients hebben een verminderd aantal bloedplaatjes in vergelijking met de gezonde individuen 16,17,18. Daarom bloedplaatjes concentraties voor CM en de UM worden aangepast op basis van tellingen van de gemiddelde bloedplaatjes van patiënten binnen elke malaria diagnostische groep. De P. falciparum samenklontering fenotype is gebruikelijk in CM isolaten en toont een sterke bindingsaffiniteit dus de verminderde bloedplaatjes concentraties heeft geen invloed klonteren omvang of frequentie sinds concentratie van bloedplaatjes is gestandaardiseerd voor alle CM gevallen. 1.2 Voorbereiding van de bloedplaatjes-arm plasma (PPP) <ol><li> PPP verkrijgen centrifugeren een gedeelte van de PRP hierboven verkregen bij 1500 xg gedurende 10 minuten. De meerderheid van bloedplaatjes pellets op de bodem van de buis. </li><li> Zowel PRP en PPP kunnen bij 4 ° C gedurende twee weken opgeslagen. Idealiter gebruik verse plaatjes voor de klonteren assay. Na 8-10 dagen meeste bloedplaatjes waarschijnlijk inactief en waarschijnlijk geaggregeerd. </li></ol> 2. Parasite Cultuur <ol><li> De gepelleteerde PRBC driemaal uit met 5-10 ml RPMI 1640 door centrifugatie bij 370 xg gedurende 5 minuten. Opmerking: in dit protocol alle culturen begon vanaf ongeveer 1 ml packed cell volume (PCV) en gehandhaafd op 5% hematocriet. Culturen kan worden gestart met een PCV van PRBC en aangepast met geïnfecteerde RBC en media om de gewenste hematocriet te bereiken. </li><li> Plaats de PRBC in een kolf en supplement met standaard malaria kweekmedium RPMI 1640 gesupplementeerd met 25 mM HEPES, 5% Albumax II of 10% serum en 40 ug / ml gentamycine een 5% hematocriet bereiken. </li><li> Permeaat cultuur kolven met een mengsel van 92,5% stikstof, 2,5% zuurstof en 5% kooldioxide voor het afdichten en incuberen. Als alternatief kan de luchtdichte kaarsenfles methode Trager-Jensen worden gebruikt. </li><li> Voor PRBC rechtstreeks verkregen van patiënten, incubeer hun cultuur kolf gedurende 24-36 uur in een 37 ° C incubator in 5% CO 2 tot volwassen parasieten te krijgen. OPMERKING: Most laboratorium-en cultuur-aangepaste lijnen zijn zeer gemakkelijk te onderhouden in de cultuur onder standaard omstandigheden. Er zijn eenvoudig hieronder beschreven technieken die kunnen worden gebruikt om verschillende parasietstadia synchroniseren groei te behouden. </li><li> Bereid een dunne bloeduitstrijkje zoals hieronder beschreven en onderzocht parasiet rijping onder een lichtmicroscoop. </li></ol> 3. Dunne Bloed Film Slide Voorbereiding <ol><li> Plaats ongeveer 10-15 ul van bloed aan het ene uiteinde van een matglazen dia rusten op een plat oppervlak. </li><li> Raak de bloeddruppel met de rand van een tweede schuif totdat het bloed gelijkmatig wordt verdeeld over de rand van de tweede schuif. </li><li> Terwijl de tweede dia in een hoek van 45 °, snel maar voorzichtig, zonder zelf te veel druk op de eerste dia, schuift het bloed over de eerste dia om een ​​dunne film van het bloed, dat gelijkmatig wordt verspreid maken. Lucht drogen. </li><li> Dompel de dia in methanol gedurende 10 sec. Lucht drogen. </li><li> Dompel de dia in 2% Giemsa stain gedurende tenminste 10 minuten. Spoel uitgebreid totdat het water helder is. Lucht drogen. </li><li> Onderzoeken dia met behulp van een 90-100x olie-emulsie lens op een lichtmicroscoop </li></ol> 4. Zuivering en Synchronisatie van Ongeslachtelijke Stages De zuivering van volwassen P. falciparum PRBC is een verplichte stap voor het klonteren assay. Inderdaad, alleen volwassen parasieten kunnen binden aan bloedplaatjes receptoren is in dit levensstadium dat de desbetreffende liganden expressie en steken uit het oppervlak van geïnfecteerde erythrocyten. Er zijn verschillende methoden om te zuiveren en te synchroniseren aseksuele fasen van P. falciparum: Late aseksuele stadia kan worden verrijkt door Percoll gradiënt 19; magnetische celsortering 20 of via de gelatine sedimentatie 21 hier beschreven protocol.. Sorbitol-synchronisatie selecteren voor ring fasen 22, waarna de ringen worden gedurende 24-26 uur bij een latere fase te verkrijgen (zonder nBehoefte aan gelatine beursgang voeren). 4.1 Plasmagel Flotation Plasmagel flotatie gebruikt gelatine-achtige oplossing te selecteren op lager gewicht knobbed erytrocyten in oplossing blijft terwijl de dichte ring vormen en rozetten naar de bodem zinken. Deze techniek geeft tot 90% zuiverheid van het volwassen stadium geïnfecteerde erytrocyten en kan worden gebruikt voor zowel veld en laboratorium isolaten. Zoals eerder vermeld, plasmagel flotatie verwijderd rosette PRBC en onvolwassen stadia die kunnen resulteren in een verminderde klontering frequentie in monsters met een hoge frequentie rosetting. Echter, zou de afwezigheid van de rosette PRBC na plasmagel beursgang geen invloed op de samenklontering assay omdat rosetting is een interactie van PRBC en niet-geïnfecteerde erytrocyten terwijl klonteren is pRBCs bindend gemedieerd door bloedplaatjes. De ligand betrokken bij deze twee eigenschappen is anders, met voornamelijk een aanvulling receptor CR-1 op geïnfecteerde erytrocyten bemiddelen rosetting.<ol><li> Voorverwarmen gelofusine oplossing en serum / Albumax II-vrij medium tot 37 C in een waterbad. </li><li> Overdracht cultuur een schone steriele 15 ml buis en pellet cellen door centrifugeren bij kamertemperatuur bij 370 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Zorgvuldig aspireren supernatant om niet de pellet en resuspendeer cellen verstoren in een gelijk volume gelofusine en eiwitvrij medium. </li><li> Breng het mengsel in een steriele 15 ml buis en toe gedurende 15-20 minuten in een 37 ° C incubator of totdat een duidelijk onderscheid te zien tussen een bovenste en onderste niveau. </li><li> Overdracht zorgvuldig de bovenste laag om een ​​frisse steriele 15 ml buis en voeg 10 ml vers RPMI. </li><li> Centrifugeer bij 370 xg gedurende 5 minuten en zorgvuldig gooi supernatant. </li><li> Beoordelen parasitemie en het ontwikkelingsstadium door dunne bloeduitstrijkje en te onderzoeken onder een lichtmicroscoop zoals beschreven in paragraaf 4. </li></ol> OPMERKING: Mature PRBC bereik tussen 60-90% van de geïnfecteerde erytrocyten depending op de eerste parasitemie van de cultuur. Voor hoog percentage van de volwassen parasieten, gebruik culturen met een initiële parasitaemie van ≥ 10%. 5. Klonteren Assay <ol><li> Gebruik een Neubauer haematocytometer aan de PRBC suspensie verkregen na plasmagel beursgang tellen en aanpassen aan 1 x 10 8 PRBC / ul. </li><li> In een nieuwe 1,5 ml buis, resuspendeer PRBC bij 5% hematocriet, acridine oranje aan 20 ug / ml eindconcentratie en PRP op 10% van het totale volume. In plaats van acridine oranje, kan parasiet culturen worden gekleurd met 25 ug / ml ethidiumbromide gedurende 5 minuten vóór gebruik. Bijvoorbeeld voor een 200 ul reactiemengsel, voeg 10 ul volwassen PRBC, 20 ui 300 x 10 3 bloedplaatjes / ul voor PRP van gezonde donors of 150 x 10 3 bloedplaatjes / ul van SM patiënten en 170 gl eiwitvrij medium. OPMERKING: De verhouding van bloedplaatjes: PRBC in de uiteindelijke reacties is 20:01. Dit is belangrijk, en kan de maximum samenklontering frequentie van een monster te bepalen. Als er minder bloedplaatjes worden toegevoegd bij de controles dan niet alle klonteren pRBCs misschien de kans om klonteren te hebben. </li><li> Op dezelfde manier bereiden de volgende controles; niet-geïnfecteerde rode bloedcellen en PRP en PRBC met PPP om de rol van bloedplaatjes in de pRBCs klonteren vergewissen. </li><li> Breng de suspensie over een 1,5-2,0 ml conische schroefdop flacon. </li><li> Plaats het flesje onder zacht schudden door walsen bij 10-12 rpm bij kamertemperatuur. </li><li> Controleer vorming clump een nat-dia bereid door pipetteren 10 ui PRBC ± bloedplaatjes mix op een glasplaatje, bedekken met een glas slip en onderzoek onder fluorescentie. </li><li> Bemonstering kan worden gedaan op 15-20 min. intervallen voor een totaal van 120 minuten. Een klomp wordt beschouwd als een aggregaat van drie of meer geïnfecteerde erytrocyten. </li></ol>

<ol>
	<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li><li>Saul, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+variant+surface+antigens+on+malaria-infected+red+blood+cells.">The role of variant surface antigens on malaria-infected red blood cells.</a> Parasitol. Today. 15, 455-457 (1999).</li><li>Miller, L. H., Good, M. F., Milon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+pathogenesis.">Malaria pathogenesis.</a> Science. 264, 1878-1883 (1994).</li><li>Newbold, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-specific+adhesion+and+clinical+disease+in+Plasmodium+falciparum.">Receptor-specific adhesion and clinical disease in Plasmodium falciparum.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 389-398 (1997).</li><li>Turner, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunohistochemical+study+of+the+pathology+of+fatal+malaria.+Evidence+for+widespread+endothelial+activation+and+a+potential+role+for+intercellular+adhesion+molecule-1+in+cerebral+sequestration.">An immunohistochemical study of the pathology of fatal malaria. Evidence for widespread endothelial activation and a potential role for intercellular adhesion molecule-1 in cerebral sequestration.</a> Am. J. Pathol. 145, 1057-1069 (1994).</li><li>Fried, M., Duffy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherence+of+Plasmodium+falciparum+to+chondroitin+sulfate+A+in+the+human+placenta.">Adherence of Plasmodium falciparum to chondroitin sulfate A in the human placenta.</a> Science. 272, 1502-1504 (1996).</li><li>Rowe, J. A., Moulds, J. M., Newbold, C. I., Miller, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P.+falciparum+rosetting+mediated+by+a+parasite-variant+erythrocyte+membrane+protein+and+complement-receptor+1.">P. falciparum rosetting mediated by a parasite-variant erythrocyte membrane protein and complement-receptor 1.</a> Nature. 388, 292-295 (1997).</li><li>Udomsangpetch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+-infected+erythrocytes+form+spontaneous+erythrocyte+rosettes.">Plasmodium falciparum -infected erythrocytes form spontaneous erythrocyte rosettes.</a> J. Exp. Med. 169, 1835-1840 (1989).</li><li>Rowe, J. A., Kyes, S. A., Rogerson, S. J., Babiker, H. A., Raza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+conserved+Plasmodium+falciparum+var+gene+implicated+in+malaria+in+pregnancy.">Identification of a conserved Plasmodium falciparum var gene implicated in malaria in pregnancy.</a> J. Infect. Dis. 185, 1207-1211 (2002).</li><li>Biswas, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+uses+gC1qR/HABP1/p32+as+a+receptor+to+bind+to+vascular+endothelium+and+for+platelet-mediated+clumping.">Plasmodium falciparum uses gC1qR/HABP1/p32 as a receptor to bind to vascular endothelium and for platelet-mediated clumping.</a> PLoS Pathog. 3, 1271-1280 (2007).</li><li>Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+accumulation+in+brain+microvessels+in+fatal+pediatric+cerebral+malaria.">Platelet accumulation in brain microvessels in fatal pediatric cerebral malaria.</a> J. Infect. Dis. 187, 461-466 (2003).</li><li>Wassmer, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-induced+clumping+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+from+Malawian+patients+with+cerebral+malaria-possible+modulation+in+vivo+by+thrombocytopenia.">Platelet-induced clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes from Malawian patients with cerebral malaria-possible modulation in vivo by thrombocytopenia.</a> J. Infect. Dis. 197, 72-78 (2008).</li><li>Mayor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+severe+malaria+outcomes+with+platelet-mediated+clumping+and+adhesion+to+a+novel+host+receptor.">Association of severe malaria outcomes with platelet-mediated clumping and adhesion to a novel host receptor.</a> PLoS One. 6, e19422 (2011).</li><li>Arman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Mediated+Clumping+of+Plasmodium+falciparum+Infected+Erythrocytes+Is+Associated+with+High+Parasitemia+but+Not+Severe+Clinical+Manifestations+of+Malaria+in+African+Children.">Platelet-Mediated Clumping of Plasmodium falciparum Infected Erythrocytes Is Associated with High Parasitemia but Not Severe Clinical Manifestations of Malaria in African Children.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 77, 943-946 (2007).</li><li>Arman, M., Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+conditions+affect+the+outcome+of+Plasmodium+falciparum+platelet-mediated+clumping+assays.">Experimental conditions affect the outcome of Plasmodium falciparum platelet-mediated clumping assays.</a> Malar. J. 7, 243 (2008).</li><li>Beale, P. J., Cormack, J. D., Oldrey, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombocytopenia+in+malaria+with+immunoglobulin+(IgM)+changes.">Thrombocytopenia in malaria with immunoglobulin (IgM) changes.</a> Br. Med. J. 1, 345-349 (1972).</li><li>Jy, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+aggregates+as+markers+of+platelet+activation:+characterization+of+flow+cytometric+method+suitable+for+clinical+applications.">Platelet aggregates as markers of platelet activation: characterization of flow cytometric method suitable for clinical applications.</a> Am. J. Hematol. 57, 33-42 (1998).</li><li>Wilson, J. J., Neame, P. B., Kelton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection-induced+thrombocytopenia.">Infection-induced thrombocytopenia.</a> Semin. Thromb. Hemost. 8, 217-233 (1982).</li><li>Wahlgren, M., Berzins, K., Perlmann, P., Persson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+humoral+immune+response+in+Plasmodium+falciparum+malaria.+II.+IgG+subclass+levels+of+anti-P.+falciparum+antibodies+in+different+sera.">Characterization of the humoral immune response in Plasmodium falciparum malaria. II. IgG subclass levels of anti-P. falciparum antibodies in different sera.</a> Clin. Exp. Immunol. 54, 135-142 (1983).</li><li>Uhlemann, A. C., Staalsoe, T., Klinkert, M. Q., Hviid, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells.">Analysis of Plasmodium falciparum-infected red blood cells.</a> MACS. 4, 7-8 (2000).</li><li>Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+mature-stage+Plasmodium+falciparum+by+gelatine+flotation.">Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation.</a> Ann. Trop. Med. Parasitol. 88, 209-211 (1994).</li><li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li><li>Chotivanich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-induced+autoagglutination+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells+and+disease+severity+in+Thailand.">Platelet-induced autoagglutination of Plasmodium falciparum-infected red blood cells and disease severity in Thailand.</a> J. Infect. Dis. 189, 1052-1055 (2004).</li><li>Pain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-mediated+clumping+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+is+a+common+adhesive+phenotype+and+is+associated+with+severe+malaria.">Platelet-mediated clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes is a common adhesive phenotype and is associated with severe malaria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 1805-1810 (2001).</li><li>Wallace, M. A., Agarwal, K. C., Garcia-Sainz, J. A., Fain, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-adrenergic+stimulation+of+phosphatidylinositol+synthesis+in+human+platelets+as+an+alpha-2+effect+secondary+to+platelet+aggregation.">Alpha-adrenergic stimulation of phosphatidylinositol synthesis in human platelets as an alpha-2 effect secondary to platelet aggregation.</a> J. Cell Biochem. 18, 213-220 (1982).</li><li>Zhou, L., Schmaier, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+aggregation+testing+in+platelet-rich+plasma:+description+of+procedures+with+the+aim+to+develop+standards+in+the+field.">Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field.</a> Am. J. Clin. Pathol. 123, 172-183 (2005).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We hebben beschreven een bloedplaatjes-gemedieerde samenklontering assay gebruikt voor het bestuderen PRBC in klinische isolaten direct in het veld. Bloedplaatjes-gemedieerde klonterende karakteristiek gedrag P. falciparum klinische isolaten is geïdentificeerd als een aparte kleefstof fenotype, vaak in CD36-bindende isolaten 12,23-24. We hebben gebruik gemaakt van deze test om drie belangrijke punten te identificeren: 1) een sterke in vitro klonteren fenotype van P. falciparum geïsoleerd van Malawi kinderen die is geassocieerd met de ziekte ernst en diagnose 2) nieuwe receptor P-selectine mediaties klonteren van bloedplaatjes met CD36, 3) de mate van trombocytopenie aanwezig bij patiënten met CM volstaat om de verdere vorming van klonten in PRBC beperken 12 vitro. De betrokkenheid van bloedplaatjes in formatie klomp wordt aangetoond door de behandeling van een natte-dia preparaat zoals beschreven in hoofdstuk 6. Bloedplaatjes kunnen van PRP worden geïsoleerd door centrifugeren bij hoge snelhedenom de bloedgroep antigene reacties te minimaliseren, maar gebruikten we hele PRP om voortijdige activering van plaatjes van overmatig gebruik en van de hoge snelheid centrifugeren minimaliseren. Bloedplaatjes activiteit kan worden gemeten door de plaatjesaggregatie beproeving met zwakke bloedplaatjes agonisten, epinefrine of adenosine difosfaat (ADP) 25 zoals beschreven in 26. Er zijn verschillende aspecten van de test die eerder zijn slecht gekarakteriseerd, een daarvan is het belang van het selecteren PRP bronnen en het effect van bloed antigen groepen op de uitkomst van de assay. We bereidden PRP van personen die bloedgroep O + waren en had geen medicatie in de laatste 7-10 dagen niet genomen voordat bloed wordt getekend als sommige geneesmiddelen kunnen bloedplaatjes gedrag beïnvloeden. Andere factoren die van invloed kunnen klonteren succes omvatten PRBC hematocriet parasitemie niveau en lengte van het klonteren assay. Met behulp van hoge hematocriet en bloedplaatjes count het moeilijk zou zijn om te zeggen of het cluster is echt een klomp of dat er te veel cellen zijn alleen bij elkaar zitten, omdat ze dicht op elkaar gepakt 15. Klontvormende ook algemeen toe met langere incubatietijden. Dit zijn allemaal nuttige richtlijnen die moeten worden overwogen bij het ontwerpen klonteren studies. We vinden dat monsters van verschillende klinische groepen kunnen parallel geanalyseerd met PRP van dezelfde donor als het mogelijk zou zijn, maar in beperkte broninstellingen zoals veldsites transfusie zwembad het algemeen beperkt. Het is derhalve moeilijk om een ​​enkele O + donor tot assays standaardiseren zijn. Daarom hebben we een aantal O + donoren geïdentificeerd om bloedgroep compatibiliteit te garanderen waar mogelijk. Het gebruik van meerdere donoren is ook nuttig in gevallen van grote steekproeven maten zodat last van bloeddonatie niet op slechts een persoon vallen. Bemonsteringspunten 15-20 min zijn veel meer haalbaar als een person is het uitvoeren van de tests, waardoor voor natte-preparaten, en het uitvoeren van test kinetiek zonder bemonsteringstijden overlappen. De meeste van de microscopische gegevens visueel en enigszins objectief, daarom is het belangrijk dat celtelling wordt geverifieerd door meerdere personen. In dat geval kan hanteren een monster tegelijkertijd gebruiken volledige analyse van 3-4 monsters per dag, afhankelijk van persoonlijke efficiency. Bloedplaatjes-gemedieerde samenklontering kan worden uitgevoerd met zowel klinische en laboratorium isolaten. Voor laboratorium-lijnen, is het aanbevolen dat CD36 bindende parasieten worden gebruikt om klonteren frequenties te maximaliseren. De assay kan worden gekoppeld met andere agglutinatie assays zoals rosette of in klonteren inhibitie assays die de studie van receptoren op de bloedplaatjes die PRBC binding, een slecht begrepen en onderzocht aspect van dit fenotype kunnen bemiddelen zou stellen.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>21870-092</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acridine orange</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A3568</td>
 <td>10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gelofusine</td>
 <td>B Braun</td>
 <td>Gelofusine</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M HEPES</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15630</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gentamycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15750045</td>
 <td>50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumax</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>1102-037</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium citrate vacutainer</td>
 <td>BD</td>
 <td>362760</td>
 <td>4 ml capacity</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>MD16000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>EL6000</td>
 <td>Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a simple protocol for platelet-mediated clumping of plasmodium falciparum-infected erythrocytes in a resource poor setting

P. falciparum zorgt ervoor dat de meerderheid van de ernstige malaria infecties. De pathofysiologische mechanismen die ten grondslag liggen aan cerebrale malaria (CM) zijn niet volledig begrepen en verscheidene hypothesen naar voren gebracht, met inbegrip van mechanische obstructie van kleine bloedvaten door P. falciparum-geparasiteerde rode bloedcellen (PRBC). Sterker nog, tijdens de intra-erytrocytaire fase van zijn levenscyclus, P. falciparum heeft het unieke vermogen om het oppervlak van de geïnfecteerde erytrocyten wijzigt exporteren oppervlakteantigenen met verschillende kleefeigenschappen op de RBC membraan. Hierdoor kan de beslaglegging op PRBC in meerdere weefsels en organen door adhesie aan endotheelcellen die de microvasculatuur van post-capillaire venules 1. Door dit te doen, de rijpe vormen van de parasiet te voorkomen milt goedkeuring van de misvormde geïnfecteerde erytrocyten 2 en beperken hun omgeving om een gunstiger lage zuurstofdruk 3. Als gevolg van deze Sequestrantsoen is slechts onvolwassen ongeslachtelijke parasieten en gameten die in het perifere bloed worden gedetecteerd. Cytoadherence en opslag van volwassen PRBC aan de talrijke gastheer receptoren tot expressie gebracht op microvasculaire bedden optreedt bij ernstige en ongecompliceerde ziekte. Echter, verscheidene lijnen van bewijs suggereren dat alleen specifieke lijm fenotypes waarschijnlijk gepaard gaan met ernstige pathologische uitkomsten van malaria. Een voorbeeld van dergelijke specifieke gastheer-parasiet interacties aangetoond in vitro, waarbij het ​​vermogen van de intercellulaire adhesiemolecuul-1 binding van PRBC ondersteunen met bijzondere hechtingseigenschappen is gekoppeld aan de ontwikkeling van cerebrale malaria 4,5. De placenta is ook erkend als gebied van preferentiële PRBC accumulatie in malaria-geïnfecteerde zwangere vrouwen, met chondrotinesulfaat A geuit op syncytiotrophoblasts die lijn de placenta intervilleuze ruimte als de belangrijkste receptor 6. Rosette van PRBC to geïnfecteerde erytrocyten via complement receptor 1 (CD35) 7,8 is ook geassocieerd met ernstige ziekte 9. Een van de meest recent beschreven P. falciparum cytoadherence fenotypen is het vermogen van de PRBC van bloedplaatjes-gemedieerde klonten in vitro. Deze vorming van klonten PRBC vereist CD36, een glycoproteïne op het oppervlak van bloedplaatjes. Andere menselijke receptor, gC1qR/HABP1/p32, uitgedrukt op diverse celtypen waaronder endotheelcellen en bloedplaatjes, is ook aangetoond dat PRBC hechting op bloedplaatjes tot klonten 10 vergemakkelijken. Of klonten ontstaan ​​in vivo blijft onduidelijk, maar kan verklaren de significante accumulatie van bloedplaatjes in de hersenen microvasculatuur van Malawi kinderen die stierven CM 11 beschreven. Bovendien is het vermogen van klinisch isolaat culturen te klonteren in vitro werd direct verbonden met de ernst van de ziekte in 12 Malawian </sup&gt; En Mozambikaanse patiënten 13, (hoewel niet in de Malinese 14). Met verschillende aspecten van de PRBC klonteren fenotype slecht gekarakteriseerd, hebben de huidige studies over dit onderwerp niet gevolgd een gestandaardiseerde procedure. Dit is een belangrijke kwestie als gevolg van de bekende hoge variabiliteit inherent in de test 15. Hier presenteren we een werkwijze voor het in vitro bloedplaatjes-gemedieerde kluiten P. falciparum met de hoop dat een platform voorziet in een consistente werkwijze van andere groepen en bewustzijn van de beperkingen verhogen onderzoeken dit fenotype in toekomstige studies. Wordt gevestigd in Malawi, bieden wij een protocol speciaal ontworpen voor een beperkte omgeving hulpbron, met het voordeel dat vers verzameld klinische isolaten kunnen worden onderzocht op fenotype zonder noodzaak van cryopreservatie.

Een voorbeeld van een bloedplaatjes-gemedieerde klomp assay met ongeveer 70% volwassen stadia van P. falciparum na verrijking door plasmagel beursgang is weergegeven in figuur 2. Een klomp is een aggregaat van drie of meer geïnfecteerde erytrocyten. Kleuring met acridine oranje of ethidiumbromide kan worden gevisualiseerd door fluorescentie microscopie. Acridine oranje spectraal vergelijkbaar met fluoresceïne, een excitatie maximum bij 502 nm en een emissiemaximum bij 525 nm (groen), terwijl ethidium bromide heeft een excitatie-maximum bij 493 nm en een emissiemaximum bij 620 nm (vergelijkbaar met rhodamine kleurstoffen, red ). Klontjes zijn makkelijk te herkennen onder de microscoop zoals onder normaal licht ze als celaggregaten en onder fluorescentie als puntjes met groen of rood na kleuring met acridine oranje en ethidiumbromide kleurstoffen, respectievelijk, zoals weergegeven in figuur 2 (30 min tijdstip met acridine oranje ). Hoe groter de massa, hoe groter de cel aggregaat weergegeven under normaal licht en hoe groter de vlekken van groene of rode fluorescentie onder de respectievelijke kleurstoffen. Aangezien de kleurstoffen doelwit DNA en daarom vlek kernen, bloedplaatjes en niet-geïnfecteerde RBC niet worden gedetecteerd onder fluorescentie microscopie vanwege hun gebrek aan kernen. Willekeurige vorming van kleine PRBC groepjes van 4,7 ± 1,6 pRBCs / klonteren optreden na 30 minuten. De clump maat verhoogt tot gemiddeld&gt; 15 PRBC / massa na incubatie gedurende 120 min met enige klonten met tientallen PRBC / massa die niet visueel kunnen worden geteld. De frequentie van het klonteren fenotype wordt berekend als het aantal geïnfecteerde cellen aanwezig in groepjes / 1000 geïnfecteerde cellen, geteld in duplo assays. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1.jpg" /> Figuur 1. Werken flow voor klonteren experiment. Bloedplaatjes rich en arm plasma (A) en een P. falciparum-geïnfecteerde erytrocyten cultuur (B) worden bereid en vervolgens gecombineerd om het klonteren assay (C). <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2.jpg" /> Figuur 2. Samenklontering van erytrocyten geïnfecteerd door P. falciparum laboratorium isoleren. Clumps gevormd door HB3 op tijdstip 0, 30 en 120 min in bloedplaatjes-rijk plasma (A) en slechte klonteren vorming in bloedplaatjes arm plasma (B). Assay Beperkingen Er zijn beperkingen die specifiek van invloed zijn functie van de bloedplaatjes of invloed uitkomst en de meeste daarvan zijn al benadrukt door Arman en Rowe 15. Hier noemen we enkele van de mogelijke problemen die zouden kunnen optreden bij different stadia van de assay: <ol><li> Aanpassing klinische isolaten in vitro cultuur kan een uitdaging soms langere tijd kweek nodig om voldoende hoge parasitemie bereiken om de vorming van klonten mogelijk te maken. Met hoge antigene variatie tarieven in P. falciparum, de lijm fenotype van de cultuur-aangepaste parasiet misschien niet overeen met de oorspronkelijke infecterende parasiet populatie na langdurige tijd in cultuur. </li><li> Teneinde niet-specifieke agglutinatie door bloedgroep antigenen voorkomen moet bloedplaatjesdonoren overeenkomen voor bloedgroep antigeen klinische isolaten in dezelfde assay of de universele donorbloed antigen O gebruikt. Echter, mensen met bloedgroep O-zijn zeldzaam in Afrikaanse sites zoals Malawi en bloedplaatjes daarom vaak gebruikt worden verkregen van bloedgroep O + donoren en moeten worden afgestemd voor bloedgroep. </li><li> Tellen klonten op een nat preparaat glijbaan is lastig en uitdagend voor het vastleggen van beelden als de cellen zijn constant in beweging. Meestal PRBC ophopen op de randen van het dekglaasje of zij de neiging aan elkaar te kleven vorming &quot;false&quot; klonten die gemakkelijk kunnen worden verward met echte massa. Om celbeweging verminderen, zodat de cellen te sedimenteren gedurende 15 min bij kamertemperatuur voorafgaand aan de analyse. </li><li> De samenklontering test is tijdgevoelige en derhalve alleen tot een monster per persoon te analyseren op een tijdstip voor een optimale nauwkeurigheid. Bemonsteringstijd punten twee verschillende monsters gemakkelijk overlappen, resulteert verkeerde monsternemingstijdstippen tussen monsters bij gevaar meer dan een monster tegelijk. In dergelijke omstandigheden kan geavanceerde kwantitatieve software klonteren afmetingen bepalen of alternatief cel-specifieke antilichamen worden gebruikt om de samenstelling van de klonten te analyseren. Hoewel deze technieken kan sterk verbeteren van de betekenis van de gegevens, in arme omgevingen waar deze test waarschijnlijk zal worden gebruikt, zoals technieken en apparatuur zijn niet direct beschikbaar. </li></ol>

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting at JoVE.com

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Deze werkwijze onderzoekt de bloedplaatjes-gemedieerde samenklontering fenotype<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Geïnfecteerde erytrocyten (PRBC) in klinische isolaten. Dit wordt uitgevoerd door het isoleren en co-incubatie van bloedplaatjes-rijk plasma en een opschorting van PRBC.

A Simple Protocol voor bloedplaatjes-gemedieerde Klontvormende van<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Geïnfecteerde erytrocyten in een Slechte Setting Resource

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Protocol voor de productie van een genetische Kruis van het knaagdieren malariaparasieten

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypische Inferentie van HIV-1 tropisme de populatie-gebaseerde Sequencing van V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Een protocol voor het verzamelen en Kleuring Hemocytes uit de Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Een eenvoudige Chelex protocol voor DNA-extractie van<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Scheiding van<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Late Stage-geïnfecteerde erythrocyten met magnetische middelen

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Een protocol voor het analyseren van hepatitis C virus replicatie

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Zuivering van<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoïeten Voor gebruik in opsoniserende antilichaamassays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

Een eenvoudige en snelle protocol bij niet-enzymatisch distantiëren Verse menselijke weefsels voor de Analyse van Infiltrating Lymfocyten

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methoden om de regulerende rol van kleine RNA&#39;s en Ribosomaal bezetting van Onderzoek<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...