Name: a simple protocol for platelet-mediated clumping of plasmodium falciparum-infected erythrocytes in a resource poor setting
Uploaded: 2013-05-16T12:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting at JoVE.com

Detta arbete har möjliggjorts genom finansiering från Wellcome Trust. JM (080.964) och SCW (080.948) stöddes av Wellcome Trust, stipendier och DT med Malawi-Liverpool-Wellcome Trust studentship.

Ett. Provtagning Trombocyter kan enkelt aktiveras genom temperatur, agitation eller lagring och därför bör hanteras med försiktighet. Användningen av Vacutainers att samla in blod för blodplättpreparatet är oundviklig i de flesta kliniska situationer, men bör noga övervägas eftersom sug kan potentiellt orsaka blodplättaktivering. På grund av det kliniska protokoll som används på vår forskning sjukhus, är våra prover omsorgsfullt samlas i Vacutainers natriumcitrat. Vi har inte upplevt några problem med för tidig aktivering av trombocyter i detta eller vår tidigare studie 12. Vi samlar in blod för blodplättpreparatet från blodgrupp O + individer att minimera ospecifik blod aggregering grupp antigen. Givarna har också inte tagit medicin under de föregående 7-10 dagar såsom vissa droger är kända för att påverka trombocytfunktionen. 1.1 Beredning av trombocyt-rich plasma (PRP) <ol><li> Samla ca 5 mlhelblod från en malaria naiv värd eller 2,5 ml blod från CM eller svår malaria (SM) patienter i en natriumcitrat vacutainer (BD produktnummer 36276). </li><li> Centrifugera helblodet vid 250 xg under 10 min vid rumstemperatur. Centrifugera inte vid 4 ° C så låga temperaturer kan orsaka blodplättarna att aggregera. </li><li> Försiktigt överföra den molniga supernatanten i en ren 15 ml tub. Trombocyter lätt aktiveras av temperaturvariationer och fysiska stötar och bör därför hanteras med försiktighet. Undvik skakning eller några ryckiga rörelser i röret. </li><li> Använd en Neubauer s haematocytometer att räkna och justera blodplättssuspensionen till&gt; 300 x 10 3 trombocyter / mikroliter för friska donatorer och &lt;150 x 10 3 trombocyter / mikroliter från CM och SM patienter som använder 1X (pH 7,2-7,4, PBS). Se till att välja en hög utspädningsfaktor för att lindra trombocytantalet och garantera dess riktighet. </li></ol> Obs: Malaria patients har ett reducerat antal blodplättar jämfört med friska individer 16,17,18. Därför blodplättar koncentrationer för CM och UM justeras enligt de genomsnittliga blodplättar för patienter inom varje malaria diagnosgrupp. The P. falciparum klumpar fenotyp är vanligt i CM isolat och visar en stark affinitet därför de sänkta trombocyter koncentrationer påverkar inte klumpar storlek eller frekvens eftersom blodplättskoncentration är standardiserad för samtliga CM fall. 1.2 Framställning av trombocytrik plasma (PPP) <ol><li> För att erhålla PPP, centrifugera en del av PRP som erhållits ovan vid 1500 xg under 10 min. Majoriteten av trombocyter pelleteras i botten av röret. </li><li> Både PRP och PPP kan lagras vid 4 ° C i upp till två veckor. Helst använder färska blodplättar för klumpar analysen. Efter 8-10 dagar de flesta av blodplättarna kommer sannolikt att vara inaktiv och förmodligen aggregerade. </li></ol> 2. Parasite Kultur <ol><li> Tvätta de pelleterade PRBC tre gånger med 5-10 ml RPMI 1640 genom centrifugering vid 370 xg under 5 minuter. OBS: I detta protokoll alla kulturer startade från ca 1 ml packad cellvolym (PCV) och hölls vid 5% hematokrit. Kulturer kan startas med en PCV av PRBC och justeras i enlighet med icke-infekterade RBC och medier för att nå önskad hematokrit. </li><li> Placera PRBC i en odlingskolv och komplettera med standard malaria odlingsmedium av RPMI 1640 kompletterat med 25 mM HEPES, 5% Albumax II eller 10% serum och 40 | ig / ml gentamycin för att uppnå en 5% hematokrit. </li><li> Permeat odlingsflaskor med en blandning av 92,5% kväve, 2,5% syre och 5% koldioxid innan förslutning och inkubering. Alternativt kan den lufttäta ljus burk metod för Trager-Jensen användas. </li><li> För PRBC erhålls direkt från patienter, inkubera deras kultur kolv för 24-36 tim i en 37 ° C inkubator i 5% CO 2 för att få mogna parasiter. OBS: MOST laboratorie-och kultur-anpassade linjer är mycket lätta att hålla i odling under normala förhållanden. Det finns enkla tekniker som beskrivs nedan som kan användas för att synkronisera olika parasit stadier att behålla tillväxthastighet. </li><li> Förbered ett tunt blodutstryk som beskrivs nedan och undersöka parasit mognad under ett ljusmikroskop. </li></ol> Tre. Thin blodfilm preparatet <ol><li> Placera ungefär 10-15 pl av blod på en ände av en frostad glasskiva vilar på en plan yta. </li><li> Tryck bloddroppen med kanten av ett andra bilden tills blodet är jämnt spridda över kanten på den andra bilden. </li><li> Håll den andra bilden i 45 ° vinkel, snabbt men varsamt, utan att utöva alltför stor press på den första bilden, skjut blodet över den första bilden för att göra en tunn film av blod som är jämnt spridda. Lufttorka. </li><li> Doppa objektglaset i metanol under 10 sek. Lufttorka. </li><li> Doppa bilden i 2% Giemsa stain i minst 10 min. Skölj flitigt tills vattnet är klart. Lufttorka. </li><li> Undersök bilden med hjälp av en 90-100x objektiv olja emulsion på ett ljusmikroskop </li></ol> 4. Rening och synkronisering av Asexual Stages Reningen av mogna P. falciparum PRBC är ett obligatoriskt steg för klumpar analysen. Ja, bara mogna parasiter kan binda till trombocytreceptorer eftersom det är på denna livscykel stadium att de relevanta ligander uttrycks och skjuta ut från ytan av infekterade erytrocyter. Det finns flera metoder för att rena och synkronisera asexuella stadier av P. falciparum: Sena asexuella stadier kan berikas genom Percoll gradient 19, magnetisk cellsortering 20 eller med hjälp av gelatin sedimentation 21 Protokollet som beskrivs här.. Sorbitol-synkronisering väljer för ring steg 22, varefter ringarna odlas under 24-26 timmar för att få mogna faser (med ingen nBehov som utföra gelatin flotation). 4,1 Plasmagel Flotation Plasmagel flotation använder gelatin-liknande lösning för att selektera för lägre vikt knobbed erytrocyter att förbli i lösning medan de täta ringformer och rosettgivare sjunka till botten. Denna teknik ger upp till 90% renhet av mogen fas-infekterade erytrocyter och kan användas för både fält och isolat laborationer. Men som tidigare nämnts, avlägsnar Plasmagel flotation rosettbildning PRBC samt omogna stadier som kan resultera i en minskad klumpande frekvens i dessa prov med en hög rosetting frekvens. Skulle dock avsaknaden av rosetting PRBC efter Plasmagel flotation påverkar inte klumpar analysen eftersom rosetting är ett samspel av PRBC och infekterade erytrocyter medan klumpar är pRBCs bindande förmedlad av blodplättar. Den ligand inblandade i dessa två egenskaper är annorlunda, med huvudsakligen komplement receptor CR-1 på icke-infekterade erytrocyter förmedlar rosetting.<ol><li> Förvärm Gelofusine lösning och serum / Albumax II-fritt medium till 37 ° C i ett vattenbad. </li><li> Överför kultur till ett rent sterilt 15 ml rör och pellets celler genom centrifugering vid rumstemperatur vid 370 xg under 5 min. </li><li> Försiktigt aspirera supernatanten för att inte störa pelleten och återsuspendera cellerna i en lika volym av Gelofusine och proteinfritt medium. </li><li> Överför blandningen till ett sterilt 15 ml rör och låt stå i 15 till 20 min i en 37 ° C inkubator eller tills en klar avgränsning kan ses mellan en övre och lägre nivå. </li><li> Överför försiktigt det övre skiktet till en ny steril 15 ml rör och tillsätt 10 ml färsk RPMI. </li><li> Centrifugera vid 370 xg under 5 minuter och försiktigt kassera supernatanten. </li><li> Bedöma parasitaemi och utvecklingsstadiet av tunna blodutstryk och undersöka under ett ljusmikroskop som beskrivs i avsnitt 4. </li></ol> OBS: Äldre PRBC intervallet mellan 60-90% av infekterade erytrocyter depending om inledande parasitaemi av kulturen. För hög andel av mogna parasiter, använd kulturer med en initial parasitaemi på ≥ 10%. Fem. Clumping Assay <ol><li> Använd en Neubauer s haematocytometer att räkna och justera PRBC suspension erhålls efter Plasmagel flotation till 1 x 10 8 PRBC / ul. </li><li> I ett nytt 1,5 ml rör, återsuspendera PRBC vid 5% hematokrit, akridinorange vid 20 ^ g / ml slutlig koncentration och PRP vid 10% av den totala volymen. Istället för akridinorange, kan parasit kulturer färgas med 25 ^ g / ml etidiumbromid under 5 min före användning. T.ex. för en 200 ul reaktion mix, tillsätt 10 ul mogna PRBC, 20 ^ 300 x 10 3 blodplättar / l för PRP från friska donatorer eller 150 x 10 3 trombocyter / mikroliter från SM patienter och 170 pl av protein-fritt medium. OBS: Förhållandet mellan trombocyter: PRBC i de slutliga reaktionerna är 20:01. Detta är viktigt eftersom är tillåter maximum clumping frekvens av ett prov som skall bestämmas. Om färre trombocyter tillsätts i kontrollerna då inte alla klumpar pRBCs kanske har chansen att klumpa. </li><li> På samma sätt förbereda följande kontroller, icke infekterade röda blodkroppar och PRP, och PRBC med PPP för att fastställa betydelsen av blodplättar i pRBCs klumpar. </li><li> Flytta suspensionen till en 1,5-2,0 ml konisk skruvkork injektionsflaska. </li><li> Placera flaskan under försiktig omröring genom valsning vid 10-12 rpm vid rumstemperatur. </li><li> Kontrollera om klumpar bildas genom en våt-slide framställd genom pipettering 10 pl PRBC ± blodplättar mix på en glasskiva, täck med ett glas halka och undersöka under fluorescens. </li><li> Provtagningen kan göras på 15 till 20 minuters intervall under totalt 120 min. En klump betraktas som ett aggregat av tre eller flera smittade erytrocyter. </li></ol>

<ol>
	<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li><li>Saul, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+variant+surface+antigens+on+malaria-infected+red+blood+cells.">The role of variant surface antigens on malaria-infected red blood cells.</a> Parasitol. Today. 15, 455-457 (1999).</li><li>Miller, L. H., Good, M. F., Milon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+pathogenesis.">Malaria pathogenesis.</a> Science. 264, 1878-1883 (1994).</li><li>Newbold, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-specific+adhesion+and+clinical+disease+in+Plasmodium+falciparum.">Receptor-specific adhesion and clinical disease in Plasmodium falciparum.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 389-398 (1997).</li><li>Turner, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunohistochemical+study+of+the+pathology+of+fatal+malaria.+Evidence+for+widespread+endothelial+activation+and+a+potential+role+for+intercellular+adhesion+molecule-1+in+cerebral+sequestration.">An immunohistochemical study of the pathology of fatal malaria. Evidence for widespread endothelial activation and a potential role for intercellular adhesion molecule-1 in cerebral sequestration.</a> Am. J. Pathol. 145, 1057-1069 (1994).</li><li>Fried, M., Duffy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherence+of+Plasmodium+falciparum+to+chondroitin+sulfate+A+in+the+human+placenta.">Adherence of Plasmodium falciparum to chondroitin sulfate A in the human placenta.</a> Science. 272, 1502-1504 (1996).</li><li>Rowe, J. A., Moulds, J. M., Newbold, C. I., Miller, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P.+falciparum+rosetting+mediated+by+a+parasite-variant+erythrocyte+membrane+protein+and+complement-receptor+1.">P. falciparum rosetting mediated by a parasite-variant erythrocyte membrane protein and complement-receptor 1.</a> Nature. 388, 292-295 (1997).</li><li>Udomsangpetch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+-infected+erythrocytes+form+spontaneous+erythrocyte+rosettes.">Plasmodium falciparum -infected erythrocytes form spontaneous erythrocyte rosettes.</a> J. Exp. Med. 169, 1835-1840 (1989).</li><li>Rowe, J. A., Kyes, S. A., Rogerson, S. J., Babiker, H. A., Raza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+conserved+Plasmodium+falciparum+var+gene+implicated+in+malaria+in+pregnancy.">Identification of a conserved Plasmodium falciparum var gene implicated in malaria in pregnancy.</a> J. Infect. Dis. 185, 1207-1211 (2002).</li><li>Biswas, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+uses+gC1qR/HABP1/p32+as+a+receptor+to+bind+to+vascular+endothelium+and+for+platelet-mediated+clumping.">Plasmodium falciparum uses gC1qR/HABP1/p32 as a receptor to bind to vascular endothelium and for platelet-mediated clumping.</a> PLoS Pathog. 3, 1271-1280 (2007).</li><li>Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+accumulation+in+brain+microvessels+in+fatal+pediatric+cerebral+malaria.">Platelet accumulation in brain microvessels in fatal pediatric cerebral malaria.</a> J. Infect. Dis. 187, 461-466 (2003).</li><li>Wassmer, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-induced+clumping+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+from+Malawian+patients+with+cerebral+malaria-possible+modulation+in+vivo+by+thrombocytopenia.">Platelet-induced clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes from Malawian patients with cerebral malaria-possible modulation in vivo by thrombocytopenia.</a> J. Infect. Dis. 197, 72-78 (2008).</li><li>Mayor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+severe+malaria+outcomes+with+platelet-mediated+clumping+and+adhesion+to+a+novel+host+receptor.">Association of severe malaria outcomes with platelet-mediated clumping and adhesion to a novel host receptor.</a> PLoS One. 6, e19422 (2011).</li><li>Arman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Mediated+Clumping+of+Plasmodium+falciparum+Infected+Erythrocytes+Is+Associated+with+High+Parasitemia+but+Not+Severe+Clinical+Manifestations+of+Malaria+in+African+Children.">Platelet-Mediated Clumping of Plasmodium falciparum Infected Erythrocytes Is Associated with High Parasitemia but Not Severe Clinical Manifestations of Malaria in African Children.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 77, 943-946 (2007).</li><li>Arman, M., Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+conditions+affect+the+outcome+of+Plasmodium+falciparum+platelet-mediated+clumping+assays.">Experimental conditions affect the outcome of Plasmodium falciparum platelet-mediated clumping assays.</a> Malar. J. 7, 243 (2008).</li><li>Beale, P. J., Cormack, J. D., Oldrey, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombocytopenia+in+malaria+with+immunoglobulin+(IgM)+changes.">Thrombocytopenia in malaria with immunoglobulin (IgM) changes.</a> Br. Med. J. 1, 345-349 (1972).</li><li>Jy, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+aggregates+as+markers+of+platelet+activation:+characterization+of+flow+cytometric+method+suitable+for+clinical+applications.">Platelet aggregates as markers of platelet activation: characterization of flow cytometric method suitable for clinical applications.</a> Am. J. Hematol. 57, 33-42 (1998).</li><li>Wilson, J. J., Neame, P. B., Kelton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection-induced+thrombocytopenia.">Infection-induced thrombocytopenia.</a> Semin. Thromb. Hemost. 8, 217-233 (1982).</li><li>Wahlgren, M., Berzins, K., Perlmann, P., Persson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+humoral+immune+response+in+Plasmodium+falciparum+malaria.+II.+IgG+subclass+levels+of+anti-P.+falciparum+antibodies+in+different+sera.">Characterization of the humoral immune response in Plasmodium falciparum malaria. II. IgG subclass levels of anti-P. falciparum antibodies in different sera.</a> Clin. Exp. Immunol. 54, 135-142 (1983).</li><li>Uhlemann, A. C., Staalsoe, T., Klinkert, M. Q., Hviid, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells.">Analysis of Plasmodium falciparum-infected red blood cells.</a> MACS. 4, 7-8 (2000).</li><li>Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+mature-stage+Plasmodium+falciparum+by+gelatine+flotation.">Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation.</a> Ann. Trop. Med. Parasitol. 88, 209-211 (1994).</li><li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li><li>Chotivanich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-induced+autoagglutination+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells+and+disease+severity+in+Thailand.">Platelet-induced autoagglutination of Plasmodium falciparum-infected red blood cells and disease severity in Thailand.</a> J. Infect. Dis. 189, 1052-1055 (2004).</li><li>Pain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-mediated+clumping+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+is+a+common+adhesive+phenotype+and+is+associated+with+severe+malaria.">Platelet-mediated clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes is a common adhesive phenotype and is associated with severe malaria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 1805-1810 (2001).</li><li>Wallace, M. A., Agarwal, K. C., Garcia-Sainz, J. A., Fain, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-adrenergic+stimulation+of+phosphatidylinositol+synthesis+in+human+platelets+as+an+alpha-2+effect+secondary+to+platelet+aggregation.">Alpha-adrenergic stimulation of phosphatidylinositol synthesis in human platelets as an alpha-2 effect secondary to platelet aggregation.</a> J. Cell Biochem. 18, 213-220 (1982).</li><li>Zhou, L., Schmaier, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+aggregation+testing+in+platelet-rich+plasma:+description+of+procedures+with+the+aim+to+develop+standards+in+the+field.">Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field.</a> Am. J. Clin. Pathol. 123, 172-183 (2005).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Vi har beskrivit en plätt-medierad klumpar analys används för att studera PRBC i kliniska isolat direkt i fält. Trombocyt-medierad klumpar, en karakteristisk beteende i P. falciparum kliniska isolat, har identifierats som en distinkt lim fenotyp, ofta i CD36-bindande isolat 12,23-24. Vi har använt denna analys för att identifiera tre huvudpunkter: 1) En stark in vitro klumpar fenotypen av P. falciparum isolerad från malawiska barn som är associerade med sjukdomens svårighetsgrad och diagnos 2) nya receptor P-selektin mediaties klumpar på blodplättar tillsammans med CD36, 3) graden av trombocytopeni närvarande i tålmodig med CM är tillräcklig för att begränsa ytterligare bildning av PRBC klumpar i vitro 12. Medverkan av blodplättar i klumpar bildas demonstreras genom att undersöka en våt-preparatet som beskrivs i avsnitt 6. Trombocyter kan isoleras från PRP genom centrifugering vid höga hastigheterFör att minimera blod reaktioner grupp antigena, men använde vi hela PRP för att minimera tidig blodplättaktivering från överdriven hantering och från höghastighetscentrifugering. Platelet aktivitet kan mätas genom trombocytaggregation test med användning av svaga trombocyt agonister, epinefrin eller adenosindifosfat (ADP) 25 såsom beskrivs i 26. Det finns flera aspekter av den analys som tidigare har dåligt karakteriserade, en av dem är vikten av att välja PRP källor och effekten av blodgrupper antigen om resultatet av analysen. Vi förberedde PRP från personer som var blodgrupp O + och hade inte tagit någon medicin under de senaste 7-10 dagarna innan blod dras eftersom vissa läkemedel kan påverka trombocyt beteende. Andra faktorer som kan påverka klumpar framgång inkluderar PRBC hematokrit, jämnar parasitaemi och längd klumpar analysen. Använda hög hematokrit och trombocyter coUNT skulle det vara svårt att avgöra om klustret är verkligen en klump eller om alltför många celler bara sitta tillsammans eftersom de är tätt packade 15. Clumping också i allmänhet ökar med längre inkubationstider. Dessa är alla användbara riktlinjer som bör beaktas när man utformar klumpar studier. Vi finner att prover från olika kliniska grupper kan analyseras parallellt med PRP från samma donator om det är möjligt att göra det, men i begränsad resurs inställningar såsom fältstationer transfusionen poolen är i allmänhet begränsad. Det är därför svårt att ha en enda O + donator att standardisera analyserna. Vi identifierade därför flera o + givare för att säkerställa kompatibilitet blodgrupp möjligt. Använda flera givare är också till hjälp i fall av stora prover storlekar så att bördan av blodgivning inte faller på en enda individ. Provtagningspunkter 15-20 min är mycket mer möjligt om en enda person genomför analyserna, vilket möjliggör wet-bildspel preparat och utföra assay kinetik utan provtagning gånger överlappande. De flesta av den mikroskopiska data visuellt och något mål, och därför är det viktigt att cellräkning verifieras av mer än en person. I så fall, kan hantera ett prov taget tillåta fullständig analys av tre till fyra prover per dag beroende på personlig effektivitet. Platelet-medierad klumpning kan utföras med användning av både kliniska och laboratorie-isolat. För laboratorium linjer, rekommenderas det att CD36 bindande parasiter används för att maximera klumpar frekvenser. Analysen kan kopplas med andra agglutinationsanalyser såsom rosettering eller användas i clumping inhiberingsanalyser som skulle göra det möjligt att studera receptorer på blodplättar som kan mediera PRBC bindning, en dåligt känd och undersökt aspekt av denna fenotyp.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>21870-092</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acridine orange</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A3568</td>
 <td>10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gelofusine</td>
 <td>B Braun</td>
 <td>Gelofusine</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M HEPES</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15630</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gentamycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15750045</td>
 <td>50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumax</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>1102-037</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium citrate vacutainer</td>
 <td>BD</td>
 <td>362760</td>
 <td>4 ml capacity</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>MD16000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>EL6000</td>
 <td>Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a simple protocol for platelet-mediated clumping of plasmodium falciparum-infected erythrocytes in a resource poor setting

P. falciparum orsakar majoriteten av svåra infektionerna. De patofysiologiska mekanismerna bakom cerebral malaria (CM) är inte helt klarlagda och flera hypoteser har lagts fram, bland annat mekanisk obstruktion av mikrokärl av P. falciparum-parasiterade röda blodkroppar (PRBC). Faktum är att under den intra-erytrocytiska skede av dess livscykel, P. falciparum har den unika förmågan att modifiera ytan av den infekterade erytrocyter genom att exportera ytantigener med varierande vidhäftande egenskaper på RBC membranet. Detta möjliggör upptag av PRBC i flera vävnader och organ genom adhesion till endotelceller kantar mikrovaskulaturen av post-kapillära venoler 1. Genom att göra så, de mogna formerna av parasiten undvika mjälten clearance av den deformerade infekterade erytrocyter 2 och begränsar deras miljö till en mer gynnsam låg syrehalt tryck 3. Som en konsekvens av denna SEQUESTranson, det är bara omogna asexuella parasiter och gametocyter som kan detekteras i perifert blod. Cytoadherence och upptag av mogna PRBC till de många värd receptorer som uttrycks på mikrovaskulära sängar sker i svår och okomplicerad sjukdom. Men flera rader av bevis tyder på att endast specifika självhäftande fenotyper kommer sannolikt att vara associerad med svåra patologiska resultat av malaria. Ett exempel på sådana specifika värd-parasit interaktioner har påvisats in vitro, där förmågan av intracellulär adhesionsmolekyl-1 att stödja bindning av PRBC med särskilda vidhäftande egenskaper har kopplats till utvecklingen av cerebral malaria 4,5. Moderkakan har också erkänts som ett område av företrädesrätt PRBC ackumulering i malaria-smittade gravida kvinnor, med chondrotin sulfat A uttrycks på syncytiotrophoblasts som kantar moderkakan intervillous utrymmet som den viktigaste receptorn 6. Rosettering av PRBC to infekterade erytrocyter via komplement receptor 1 (CD35) 7,8 har också satts i samband med allvarlig sjukdom 9. En av de senast beskrivna P. falciparum cytoadherence fenotyper är förmågan hos PRBC att bilda trombocyt-medierade klumpar in vitro. Bildningen av sådana PRBC klumpar kräver CD36, ett glykoprotein som uttrycks på ytan av trombocyter. En annan mänsklig receptor, gC1qR/HABP1/p32, uttryckt på olika celltyper inklusive endotelceller och trombocyter, har också visat sig underlätta PRBC vidhäftning på trombocyter att bilda klumpar 10. Vare klumpar uppkommer in vivo är fortfarande oklart, men det kan vara orsaken till den betydande ackumulering av blodplättar beskrivs i hjärnan mikrocirkulation av malawiska barn som dog av CM 11. Dessutom möjligheten för kliniska isolat kulturer att klampa in vitro var direkt kopplade till sjukdomens svårighetsgrad i malawiskt 12 </sup&gt; Och moçambikiska patienter 13, (även om inte i maliska 14). Med flera aspekter av PRBC klampa fenotypen dåligt karakteriserad, har pågående studier i denna fråga inte följt ett standardiserat förfarande. Detta är en viktig fråga på grund av den kända hög variabilitet inneboende i analysen 15. Här presenterar vi en metod för in vitro plätt-medierad klampa av P. falciparum med hopp om att det kommer att ge en plattform för en konsekvent metod för andra grupper och öka medvetenheten om de begränsningar i att undersöka denna fenotyp i framtida studier. Att vara baserade i Malawi, ger vi ett protokoll som utformats särskilt för en begränsad resurs inställning, med den fördelen att nyuppsamlade kliniska isolat kan undersökas fenotyp utan behov av frysförvaring.

Ett exempel på en blodplätt-medierad klump-analys med användning av ca 70% mogna stadier av P. falciparum efter anrikning av Plasmagel flotation visas i figur 2. En klump är en sammanvägning av tre eller flera smittade erytrocyter. Färgning med akridinorange eller etidiumbromid kan visualiseras genom fluorescensmikroskopi. Akridinorange är spektralt liknar fluorescein, med ett excitationsmaximum vid 502 nm och ett emissionsmaximum vid 525 nm (grön), medan etidiumbromid har ett excitationsmaximum vid 493 nm och ett emissionsmaximum vid 620 nm (liknande rodaminfärgämnen, röd ). Klumpar är lätt fläckig under mikroskop som i normalt ljus de visas som cellaggregat och under fluorescens som fläckar av grön eller röd efter att ha färgats med akridinorange eller etidium färgämnen bromid, respektive, såsom visas i fig. 2 (30 min tidpunkt med akridinorange ). Ju större klumpar, desto större cellaggregatet visas under normalt ljus och större fläckar av grönt eller rött under fluorescerar för respektive färgämnen. Eftersom färgämnen mål-DNA och därmed fläcken kärnor, trombocyter och oinfekterade RBC inte upptäcks under fluorescerande mikroskopi grund deras brist av kärnor. Random bildas små PRBC klumpar av 4,7 ± 1,6 pRBCs / klumpar inträffar efter 30 min. Den klumpar storlek ökar betydligt till i genomsnitt&gt; 15 PRBC / klumpar efter inkubation under 120 min med några klumpar som innehåller talrika PRBC / klump som inte kunde visuellt räknas. Frekvensen av klumpar fenotypen beräknas som antalet infekterade celler förekommer i klumpar / 1000 infekterade celler, räknat i dubbla analyser. <img alt="Figur 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1.jpg" /> Figur 1. Arbeta flöde för klumpar experiment. Trombocyter rich och plasma (A) och en P. falciparum-infekterad erytrocyt kultur (B) framställs och kombineras sedan för klumpar assay (C). <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2.jpg" /> Figur 2. Klumpning av erytrocyter infekterade av P. falciparum laboratorium isolat. Klumpar bildas av HB3 vid tiden 0, 30 och 120 min i trombocytrik plasma (A) och dålig klump-bildning i trombocytfattig plasma (B). Assay Begränsningar Det finns begränsningar som specifikt drabbar trombocytfunktionen eller inflytande utfall och de flesta av dessa har redan uppmärksammats av Arman och Rowe 15. Här nämner vi några av de potentiella problem som kan uppkomma vid different stadier av analysen: <ol><li> Anpassning kliniska isolat till in vitro-kultur kan vara en utmaning som ibland längre kultur perioder krävs för att uppnå tillräckligt hög parasitemin för att tillåta bildning av klumpar. Med höga antigenvariation klassar i P. falciparum, kan limmet fenotypen av kulturen anpassad-parasit återspeglar inte den ursprungliga infekterande parasit befolkningen efter långa tider i kultur. </li><li> För att undvika icke-specifik agglutination grund blodgruppsantigener bör plateletoljedoseringar matchas för blodgruppsantigen med kliniska isolat som används i samma analys, eller den universella donor blod antigen grupp O-används. Men personer med blodgrupp O-är sällsynta i afrikanska områden som Malawi och därför Trombocyter används ofta erhålls från blodgrupp O + givare och måste matchas för blodgrupp. </li><li> Räkna klumpar på en våt preparatet är besvärligt och utmanande för bildfångst som cells är i ständig rörelse. Vanligtvis PRBC samlas på kanterna på täckglas eller de tenderar att hålla ihop bildar &quot;falska&quot; klumpar som lätt kan förväxlas med riktiga klumpar. För att minska cellrörelse, tillåta cellerna att sedimentera under 15 min vid rumstemperatur före analys. </li><li> Den klumpar analysen är tidskänsliga och därför bara gör ett prov som skall analyseras per person i taget för optimal precision. Provtagning tidpunkter för två olika prover kan enkelt överlappa, vilket omaka punkter provtagningstid mellan prover om hantering mer än ett prov på samma gång. Under sådana omständigheter skulle sofistikerad kvantitativ programvara beräkna klumpar storlekar eller alternativt cellspecifika antikroppar skulle kunna användas för att analysera sammansättningen av klumpar. Även om dessa tekniker kan avsevärt förbättra betydelsen av uppgifterna, i resurssvaga miljöer där denna analys är sannolikt kommer att användas, sådana tekniker och utrustning är inte lätt tillgänglig. </li></ol>

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting at JoVE.com

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Denna metod undersöker trombocyt-medierad hopklumpning fenotypen av<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Infekterade erytrocyter (PRBC) i kliniska isolat. Detta görs genom att isolera och co-inkubation blodplättsrik plasma och en suspension av PRBC.

Ett enkelt protokoll för trombocyter-medierad klumpande av<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Infekterade erytrocyter i ett resurssvaga inställning

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Protokoll för produktion av en genetisk kors av parasiterna Gnagare Malaria

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypisk Inferens av HIV-1 Tropism Använda Befolkning-sekvensering av V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Ett protokoll för insamling och färgning hemocyter från gula febern Mosquito Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

En enkel Chelex protokoll för DNA-extraktion från<em&gt; Anopheles</em&gt; SPP.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation av<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Sent skede-infekterade erytrocyter genom magnetiska organ

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Ett protokoll för Analysera hepatit C-virus replikering

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Rening av<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoites för användning i opsoniserande Antibody analyser

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

En enkel och snabb protokoll till icke enzymatiskt dissociera Färska mänskliga vävnader för analys av lymfocyter

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Metoder för att undersöka den reglerande roll små RNA och Ribosomalt Beläggning av<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...