Name: a simple protocol for platelet-mediated clumping of plasmodium falciparum-infected erythrocytes in a resource poor setting
Uploaded: 2013-05-16T12:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting at JoVE.com

Bu çalışma Wellcome Trust fon ile mümkün olmuştur. JM (080.964) ve SCW (080.948) bir Malavi-Fenerbahçe-Wellcome Trust öğrencilik tarafından Wellcome Trust burs ve DT tarafından desteklenmiştir.

1. Örnek Toplama Trombositler kolayca sıcaklık, ajitasyon veya depolama ile aktif hale getirilebilir ve bu yüzden dikkatle ele alınmalıdır. Trombosit hazırlanması için kan toplamak için vacutainers, bir çok klinik durumlarda kaçınılmazdır, ama emme potansiyel olarak trombosit aktivasyonu neden olabilir dikkatle düşünülmelidir. Araştırma hastanede kullanılan klinik protokol, bizim örnekleri dikkatle sodyum sitrat vacutainers toplanır. Bu ya da önceki çalışmada 12 erken trombosit aktivasyonu ile herhangi bir sorun yaşamamış. Biz spesifik olmayan kan grubu antijen toplama en aza indirmek için kan grubu O + kişilerden trombosit hazırlanması için kan toplamak. Bağış ayrıca bazı ilaçlar trombosit fonksiyonu etkilediği bilinmektedir bir önceki 7-10 gün içinde ilaç almamış. Trombosit açısından zengin plazma 1.1 hazırlanması (PRP) <ol><li> Yaklaşık 5 ml arasındaCM veya ağır sıtma (SM) bir sodyum sitrat Vacutainer hasta (BD ürün numarası 36276) bir sıtma saf bir ana ya da kan 2.5 ml tam kan. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüj tam kan. Düşük sıcaklıklarda agrega için trombositlerin neden olabilir ° C 4 de santrifüj yok. </li><li> Dikkatlice temiz bir 15 ml tüp bulutlu süpernatant aktarın. Trombositler kolayca sıcaklık değişimleri ve fiziksel darbelere tarafından aktive edilir ve bu nedenle dikkatle ele alınmalıdır. Sallayarak veya tüp herhangi bir ani kalkış yapmayın. </li><li> &gt; 300 trombosit süspansiyonu saymak ve ayarlamak için bir Neubauer en haematocytometer kullanarak x 10 3 trombosit / sağlıklı donörlerden için ul ve &lt;150 x 10 3 trombosit / CM ve 1X fosfat tampon (pH 7.2-7.4; PBS) kullanılarak SM hastaların ul. Trombosit sayısı kolaylığı ve doğruluğunu sağlamak için yüksek seyreltme faktörü seçtiğinizden emin olun. </li></ol> Not: Sıtma patients sağlıklı bireyler 16,17,18 ile karşılaştırıldığında daha düşük bir trombosit sayısı vardır. CM ve UM Bu nedenle trombosit konsantrasyonları her sıtma tanı grubu içinde hastalar için ortalama trombosit sayısına göre ayarlanır. S. falciparum topaklanma fenotip CM izole yaygındır ve trombosit konsantrasyonu tüm CM durumlar için standart olduğu için küme boyutu veya sıklığı etkilemez güçlü bir bağlanma afinitesi bu nedenle düşük trombosit konsantrasyonları görüntüler. Trombosit bakımından yoksul plazma, 1.2 hazırlanması (PPP) <ol><li> PPP elde etmek için, 10 dakika boyunca 1500 x g&#39;de Yukarıda elde edilen PRP bir bölümü santrifüj. Trombosit çoğunluğu tüpün altındaki pellet haline getirilir. </li><li> PRP ve PPP ikisi de iki haftaya kadar 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. İdeal olarak, topaklanma tahlil için taze trombosit kullanın. 8-10 gün sonra trombosit en aktif ve muhtemelen toplu olması muhtemeldir. </li></ol> 2. Parasite Kültür <ol><li> 5 dakika boyunca 370 x g&#39;de santrifüj ile 5-10 ml RPMI 1640 pelet pRBC üç kez yıkayın. Not: bu protokoldeki tüm kültürlerde yaklaşık 1 ml dolu hücre hacmi (PCV) başladı ve 5% hematokrit tutulur. Kültürler pRBC herhangi PCV ile başladı ve istenilen hematokrit ulaşmak için bulaşmamış RBC ve medya ile buna göre ayarlanabilir. </li><li> 25 mM HEPES,% 5 Albumax II ya da% 10 serum ve 40 ug /% 5 hematokrit elde etmek ml gentamisin ile takviye edilmiş RPMI 1640 sıtma standart kültür ortamı ile bir kültür şişesi ve ek olarak pRBC yerleştirin. </li><li> Mühürleme ve inkübasyondan önce,% 92.5 azot,% 2.5 oksijen ve% 5 karbon dioksit karışımı ile kültür şişeleri nüfuz. Alternatif olarak, Trager-Jensen hava geçirmez bir mum kavanozu yöntem kullanılabilir. </li><li> PRBC hastalar doğrudan elde için, olgun parazitleri almak için% 5 CO 2 bir 37 ° C inkübatör 24-36 saat kendi kültürü şişesi kuluçkaya yatmaktadır. NOT: Most laboratuar ve kültür adapte hatları standart koşullar altında kültür bakımı çok kolaydır. Büyüme oranını korumak için farklı parazit aşamaları senkronize etmek için kullanılabilecek aşağıda tarif edildiği basit bir teknik vardır. </li><li> Aşağıda açıklandığı gibi ince bir kan yayma hazırlayın ve bir ışık mikroskobu altında parazit olgunlaşma inceleyin. </li></ol> 3. İnce Kan Film Slayt Hazırlama <ol><li> Düz bir yüzeye oturan bir buzlu cam slayt bir ucunda kan yaklaşık 10-15 ul yerleştirin. </li><li> Kan eşit ikinci slayt kenarına yayılmış kadar ikinci bir slayt kenarı ile kan damla dokunun. </li><li> Ilk slayt üzerinde çok fazla baskı uygulamadan, hızlı fakat nazikçe, açısı 45 ° de ikinci slayt tutarken, eşit yayılır kan ince bir film yapmak için ilk slayt boyunca kan kaydırın. Hava kuru. </li><li> 10 saniye metanol içinde slayt batırın. Hava kuru. </li><li> 2% Giemsa st slayt DipEn az 10 dakika boyunca Ain. Su temiz çalışır kadar yoğun durulayın. Hava kuru. </li><li> Bir ışık mikroskobu üzerinde 90-100x yağ emülsiyonu lens kullanarak slayt inceleyin </li></ol> 4. Aseksüel Aşamaları saflaştırılması ve Senkronizasyon Olgun P. arıtma falciparum pRBC topaklanma testi için gerekli bir adımdır. Gerçekten de, sadece olgun parazitler ilgili ligandları ifade edilen ve enfekte olan eritrositlerin yüzeyinden çıkıntı vardır, bu yaşam döngüsü aşamada olduğu gibi trombosit reseptörlerine bağlanma yeteneğine sahiptir. P. eşeysiz aşamaları arındırmak ve senkronize etmek için çeşitli yöntemler vardır falciparum: Geç eşeysiz aşamalarında Percoll degrade 19 ile zenginleştirilmiş olabilir; 20 sıralama veya jelatin sedimantasyon 21 protokolünü kullanarak manyetik hücre burada açıklanan.. Sorbitol-senkronizasyon (hiçbir n halkaları olgun aşamalarında elde etmek için 24-26 saat kültüre sonra, halka aşamaları 22 için seçer) jelatin yüzdürme gerçekleştirmek için eed. 4.1 Plasmagel Flotasyon Plasmagel flotasyon yoğun halka formları ve rozet dibine çöker ise daha düşük ağırlık çözüm kalmasını eritrositler knobbed seçmek için jelatin benzeri çözüm kullanır. Bu teknik, olgun bir sahne-enfekte olan eritrositlerin% 90 saflıkta kadar verir ve alan ve laboratuar izolatlarının her ikisi için de kullanılabilir. Bununla birlikte, daha önce belirtildiği gibi, yüzdürme plasmagel rozetleme pRBC yanı sıra, yüksek frekanslı rozetleme ile bu örneklerde daha düşük bir topaklanma frekans neden immatür aşamalarını ortadan kaldırır. Topaklanma trombositler tarafından nakline bağlama aracılı ise rozetlenmesini pRBC ve enfekte olmayan eritrositlerin bir etkileşim olduğundan, ancak, plasmagel flotasyon sonra rozetleme pRBC yokluğunda topaklanma testi etkilemez. Bu iki özellikleri dahil ligand farklıdır; özellikle rozetlenmesini aracılık bulaşmamış eritrositler üzerinde reseptör CR-1 tamamlayacak ile.<ol><li> ° C bir su banyosunda 37 ön ısıtılması Gelofusine çözeltisi ve serum / Albumax II içermeyen aracı. </li><li> 5 dakika boyunca 370 x g&#39;de oda sıcaklığında santrifüj ile temiz bir steril 15 ml tüp ve pelet hücreleri kültürü aktarın. </li><li> Süpernatan dikkatle aspire şekilde Gelofusine ve proteinsiz ortamda bir eşit hacmi içinde pelet ve süspansiyon hücreleri bozmamaya. </li><li> Steril bir 15 ml tüp karışımı aktarın ve net bir sınır bir üst ve alt düzeyi arasında görülebilir kadar 37 ° C inkübatör 15-20 dakika veya bekletin. </li><li> Dikkatlice yeni bir steril 15 ml tüp üst katman aktarmak ve taze RPMI 10 ml ekleyin. </li><li> 5 dakika boyunca 370 x g santrifüj ve dikkatle supernatant atın. </li><li> Ince kan smear ile parasitaemia ve gelişimsel aşamada değerlendirmek ve bölüm 4 açıklandığı gibi bir ışık mikroskobu altında inceleyin. </li></ol> NOT: enfekte eritrosit dependi 60-90% arasında Olgun pRBC aralığıkültürünün ilk parasitaemia üzerinde ng. Olgun parazitler yüksek oranda için, ≥ 10% bir başlangıç ​​parasitaemia ile kültürler kullanın. 5. Testi topaklanma <ol><li> 1 plasmagel yüzdürme sonra elde pRBC süspansiyon saymak ve ayarlamak için bir Neubauer en haematocytometer kullanın x 10 8 ul / pRBC. </li><li> Yeni bir 1.5 ml&#39;lik bir tüp içinde, 20 mg / toplam hacminin% 10 ml son konsantrasyon ile PRP% 5 hematokrit, akridin de tekrar süspansiyon pRBC. Bunun yerine akridin portakal, parazit kültürleri kullanımdan önce 5 dakika boyunca 25 mg / ml etidyum bromür ile boyanmış olabilir. 200 ul reaksiyon karışımı örneğin, 10 ul olgun pRBC, 300 x 10 3 trombosit / sağlıklı donörler ya da 150 x 10 3 trombosit / SM hastaların ul ve proteinsiz ortamda 170 ul ikinci PRP ul 20 ul ekle. NOT: trombosit oranı: pRBC son reaksiyonlar olarak 20:1 olduğunu. Maxim izin verir gibi bu önemlidirum bir numunenin topaklanma frekansı tespit edilmesi. Daha az trombosit kontrollerde eklenirse o zaman tüm topaklanma nakline gelme şansına sahip olabilir değil. </li><li> Nakline topaklanma trombositlerin rolünü tespit etmek için enfekte olmamış kırmızı kan hücreleri ve PRP ve PPP ile pRBC, aynı şekilde aşağıdaki kontrolleri hazırlamak. </li><li> Bir 1.5-2.0 ml konik vidalı kapaklı flakon süspansiyonu aktarın. </li><li> Oda sıcaklığında 10-12 rpm&#39;de haddeleme ile nazik çalkalama altında şişe yerleştirin. </li><li> Bir bardak kayma ve floresan altında incelemek ile kaplayın, pRBC 10 ul pipetleme tarafından hazırlanan ıslak-slayt ± bir cam slayt trombosit karışımı ile küme oluşumu olup olmadığını kontrol edin. </li><li> Numune 120 dakikalık bir toplam 15-20 dakika aralıklarla yapılabilir. Bir yığın üç veya daha fazla enfekte eritrositlerin bir toplam olarak kabul edilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li><li>Saul, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+variant+surface+antigens+on+malaria-infected+red+blood+cells.">The role of variant surface antigens on malaria-infected red blood cells.</a> Parasitol. Today. 15, 455-457 (1999).</li><li>Miller, L. H., Good, M. F., Milon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+pathogenesis.">Malaria pathogenesis.</a> Science. 264, 1878-1883 (1994).</li><li>Newbold, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-specific+adhesion+and+clinical+disease+in+Plasmodium+falciparum.">Receptor-specific adhesion and clinical disease in Plasmodium falciparum.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 389-398 (1997).</li><li>Turner, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunohistochemical+study+of+the+pathology+of+fatal+malaria.+Evidence+for+widespread+endothelial+activation+and+a+potential+role+for+intercellular+adhesion+molecule-1+in+cerebral+sequestration.">An immunohistochemical study of the pathology of fatal malaria. Evidence for widespread endothelial activation and a potential role for intercellular adhesion molecule-1 in cerebral sequestration.</a> Am. J. Pathol. 145, 1057-1069 (1994).</li><li>Fried, M., Duffy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherence+of+Plasmodium+falciparum+to+chondroitin+sulfate+A+in+the+human+placenta.">Adherence of Plasmodium falciparum to chondroitin sulfate A in the human placenta.</a> Science. 272, 1502-1504 (1996).</li><li>Rowe, J. A., Moulds, J. M., Newbold, C. I., Miller, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P.+falciparum+rosetting+mediated+by+a+parasite-variant+erythrocyte+membrane+protein+and+complement-receptor+1.">P. falciparum rosetting mediated by a parasite-variant erythrocyte membrane protein and complement-receptor 1.</a> Nature. 388, 292-295 (1997).</li><li>Udomsangpetch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+-infected+erythrocytes+form+spontaneous+erythrocyte+rosettes.">Plasmodium falciparum -infected erythrocytes form spontaneous erythrocyte rosettes.</a> J. Exp. Med. 169, 1835-1840 (1989).</li><li>Rowe, J. A., Kyes, S. A., Rogerson, S. J., Babiker, H. A., Raza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+conserved+Plasmodium+falciparum+var+gene+implicated+in+malaria+in+pregnancy.">Identification of a conserved Plasmodium falciparum var gene implicated in malaria in pregnancy.</a> J. Infect. Dis. 185, 1207-1211 (2002).</li><li>Biswas, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+uses+gC1qR/HABP1/p32+as+a+receptor+to+bind+to+vascular+endothelium+and+for+platelet-mediated+clumping.">Plasmodium falciparum uses gC1qR/HABP1/p32 as a receptor to bind to vascular endothelium and for platelet-mediated clumping.</a> PLoS Pathog. 3, 1271-1280 (2007).</li><li>Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+accumulation+in+brain+microvessels+in+fatal+pediatric+cerebral+malaria.">Platelet accumulation in brain microvessels in fatal pediatric cerebral malaria.</a> J. Infect. Dis. 187, 461-466 (2003).</li><li>Wassmer, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-induced+clumping+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+from+Malawian+patients+with+cerebral+malaria-possible+modulation+in+vivo+by+thrombocytopenia.">Platelet-induced clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes from Malawian patients with cerebral malaria-possible modulation in vivo by thrombocytopenia.</a> J. Infect. Dis. 197, 72-78 (2008).</li><li>Mayor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+severe+malaria+outcomes+with+platelet-mediated+clumping+and+adhesion+to+a+novel+host+receptor.">Association of severe malaria outcomes with platelet-mediated clumping and adhesion to a novel host receptor.</a> PLoS One. 6, e19422 (2011).</li><li>Arman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Mediated+Clumping+of+Plasmodium+falciparum+Infected+Erythrocytes+Is+Associated+with+High+Parasitemia+but+Not+Severe+Clinical+Manifestations+of+Malaria+in+African+Children.">Platelet-Mediated Clumping of Plasmodium falciparum Infected Erythrocytes Is Associated with High Parasitemia but Not Severe Clinical Manifestations of Malaria in African Children.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 77, 943-946 (2007).</li><li>Arman, M., Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+conditions+affect+the+outcome+of+Plasmodium+falciparum+platelet-mediated+clumping+assays.">Experimental conditions affect the outcome of Plasmodium falciparum platelet-mediated clumping assays.</a> Malar. J. 7, 243 (2008).</li><li>Beale, P. J., Cormack, J. D., Oldrey, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombocytopenia+in+malaria+with+immunoglobulin+(IgM)+changes.">Thrombocytopenia in malaria with immunoglobulin (IgM) changes.</a> Br. Med. J. 1, 345-349 (1972).</li><li>Jy, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+aggregates+as+markers+of+platelet+activation:+characterization+of+flow+cytometric+method+suitable+for+clinical+applications.">Platelet aggregates as markers of platelet activation: characterization of flow cytometric method suitable for clinical applications.</a> Am. J. Hematol. 57, 33-42 (1998).</li><li>Wilson, J. J., Neame, P. B., Kelton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection-induced+thrombocytopenia.">Infection-induced thrombocytopenia.</a> Semin. Thromb. Hemost. 8, 217-233 (1982).</li><li>Wahlgren, M., Berzins, K., Perlmann, P., Persson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+humoral+immune+response+in+Plasmodium+falciparum+malaria.+II.+IgG+subclass+levels+of+anti-P.+falciparum+antibodies+in+different+sera.">Characterization of the humoral immune response in Plasmodium falciparum malaria. II. IgG subclass levels of anti-P. falciparum antibodies in different sera.</a> Clin. Exp. Immunol. 54, 135-142 (1983).</li><li>Uhlemann, A. C., Staalsoe, T., Klinkert, M. Q., Hviid, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells.">Analysis of Plasmodium falciparum-infected red blood cells.</a> MACS. 4, 7-8 (2000).</li><li>Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+mature-stage+Plasmodium+falciparum+by+gelatine+flotation.">Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation.</a> Ann. Trop. Med. Parasitol. 88, 209-211 (1994).</li><li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li><li>Chotivanich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-induced+autoagglutination+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells+and+disease+severity+in+Thailand.">Platelet-induced autoagglutination of Plasmodium falciparum-infected red blood cells and disease severity in Thailand.</a> J. Infect. Dis. 189, 1052-1055 (2004).</li><li>Pain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-mediated+clumping+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+is+a+common+adhesive+phenotype+and+is+associated+with+severe+malaria.">Platelet-mediated clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes is a common adhesive phenotype and is associated with severe malaria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 1805-1810 (2001).</li><li>Wallace, M. A., Agarwal, K. C., Garcia-Sainz, J. A., Fain, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-adrenergic+stimulation+of+phosphatidylinositol+synthesis+in+human+platelets+as+an+alpha-2+effect+secondary+to+platelet+aggregation.">Alpha-adrenergic stimulation of phosphatidylinositol synthesis in human platelets as an alpha-2 effect secondary to platelet aggregation.</a> J. Cell Biochem. 18, 213-220 (1982).</li><li>Zhou, L., Schmaier, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+aggregation+testing+in+platelet-rich+plasma:+description+of+procedures+with+the+aim+to+develop+standards+in+the+field.">Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field.</a> Am. J. Clin. Pathol. 123, 172-183 (2005).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz doğrudan alanında klinik izolatlarının pRBC incelemek için kullanılan bir Platelet dolayımlı topaklanma testi tanımlamışlardır. Platelet dolayımlı topaklanma, S., karakteristik bir davranış falciparum&#39;un klinik izolat, CD36 bağlayıcı izole 12,23-24 sık ayrı bir yapıştırıcı fenotipi olarak tespit edilmiştir. 1) P. in vitro topaklanma fenotip güçlü: Biz üç ana noktaları belirlemek için bu testte kullanmış falciparum hastalık şiddeti ve tanı 2) CD36, 3 ile birlikte trombositler üzerinde topaklanma yeni reseptör P-selektin mediaties) CM hastalarda mevcut trombositopeni derecesi ile ilişkilidir Malavili çocuk izole içinde pRBC kümeleri daha da oluşumunu sınırlamak için yeterlidir in vitro 12. Topak oluşumu trombositlerin katılımı bölüm 6&#39;da tarif edildiği gibi bir ıslak-preparat hazırlama incelenerek gösterilmiştir. Trombositler yüksek hızda santrifüj ile TZP izole edilebilirkan grubu antijenik reaksiyonları en aza indirmek amacıyla, bununla birlikte, aşırı kullanımdan kaynaklanan ve yüksek hızlı santrifüj ile erken trombosit aktivasyonu en aza indirmek amacıyla bütün PRP kullanılır. Trombosit aktivitesi zayıf trombosit agonistleri, epinefrin veya 26&#39;da belirtildiği gibi, adenosin difosfat (ADP) 25 kullanılarak platelet agregasyonu testi ile ölçülebilir. Daha önce zayıf bir şekilde karakterize edilmiştir, tahlilin çeşitli yönleri, PRP kaynakları ve deney sonucunu kan antijen gruplarının etkisi seçiminin önemini bunlardan biri bulunmaktadır. Biz kan grubu O olan bireylerden PRP hazırlanan + ve bazı ilaç trombosit davranışını etkileyebilir gibi kan çizilir önceki son 7-10 gün içinde herhangi bir ilaç almamıştı. Başarı topaklanma etkileyebilecek diğer faktörler pRBC hematokrit, parasitaemia düzeyleri ve topaklanma testinin süresini içerir. Yüksek hematokrit ve trombosit ortak kullanılmasıbu küme gerçekten bir yığın olan ya da yoğun 15 dolu olduğu için olmadığını çok fazla hücre sadece birlikte oturan olup olmadığını söylemek zor olacaktır unt. Topaklanma da genellikle uzun inkübasyon süreleri ile artar. Bu topaklanma çalışmalar tasarlarken dikkat edilmesi gereken tüm yararlı kurallar vardır. Farklı klinik gruplarından örnekler bunu yapmak mümkün olup olmadığını paralel aynı donörden TZP kullanarak analiz edilebilir, ancak bu alanda siteleri gibi sınırlı kaynak ayarları transfüzyonu havuzu genellikle sınırlı olduğunu bulmak. Bu tahliller standardize etmek için tek bir O + verici olması zordur. Bu nedenle mümkün olan her yerde kan grubu uyumluluğu sağlamak için çeşitli O + bağış tespit. Kan bağışı bu yükü sadece bir bireysel girmemektedir birden çok donör kullanılması da büyük örnekleri boyutlarda durumlarda yararlıdır. Tek bir pe ise 15-20 dk Örnekleme noktaları çok daha mümkün olanrson ıslak-slayt hazırlıkları için izin ve üst üste örnekleme süreleri olmaksızın tahlil kinetik performans, deneyleri yürütüyor. Mikroskobik verilerin çoğu görsel ve biraz amacı, bu nedenle, hücre sayımı bir fazla kişi tarafından doğrulanır önemlidir. Bu durumda, her seferinde bir numune işleme kişisel etkinliğine bağlı olarak 3-4 numune bir gün arasında tam bir analiz izin verebilir. Platelet dolayımlı topaklanma klinik ve laboratuar izolat her ikisini de kullanarak gerçekleştirilebilir. Laboratuvar hatları için, CD36 bağlama parazit topaklanma frekansları en üst düzeye çıkarmak için kullanılır önerilir. Tahlil, örneğin rozetleme veya pRBC bağlayıcı, bu fenotip bir anlaşılamamıştır ve incelenen yönü aracılık edebilir, trombositlerin reseptörlerinin çalışma sağlayacak inhibisyon deneyleri topaklanma olarak kullanılan diğer aglütinasyon deneyleri ile akuple edilebilir.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>21870-092</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acridine orange</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A3568</td>
 <td>10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gelofusine</td>
 <td>B Braun</td>
 <td>Gelofusine</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M HEPES</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15630</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gentamycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15750045</td>
 <td>50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumax</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>1102-037</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium citrate vacutainer</td>
 <td>BD</td>
 <td>362760</td>
 <td>4 ml capacity</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>MD16000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>EL6000</td>
 <td>Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a simple protocol for platelet-mediated clumping of plasmodium falciparum-infected erythrocytes in a resource poor setting

Plasmodium falciparum sıtma enfeksiyonu ciddi bir çoğunluğu neden olur. Serebral sıtma (CM) altında yatan patofizyolojik mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır ve çeşitli hipotezler P. tarafından mikrodamarlar mekanik tıkanıklığı da dahil olmak üzere, öne sürülmüştür falciparum-parazitlenmiş kırmızı kan hücreleri (pRBC). Gerçekten de, yaşam döngüsünün içi eritrositik aşamasında, S. falciparum RBC membran üzerine yapışkan özellikleri değişen yüzey antijenleri ihraç ederek enfekte eritrosit yüzeyine değiştirmek için eşsiz bir yeteneği vardır. Bu post-kapiller venüllerde 1 mikrovasküler astar endotel hücrelerine yapışma birden fazla doku ve organlarda pRBC ihtiyati haciz sağlar. Böyle yaparak, parazitin olgun formları deforme enfekte eritrositlerin dalak boşluğu önlemek 2 ve daha uygun bir düşük oksijen basıncı 3 çevreleri kısıtlamak. Bu SEQUEST bir sonucu olarakrasyon, sadece olgunlaşmamış aseksüel parazitleri ve periferik kan tespit edilebilir gametocytes olduğunu. Mikrovasküler yatak üzerinde ifade çok sayıda ev sahibi reseptörlerine olgun pRBC bir Cytoadherence ve haciz şiddetli ve komplike olmayan hastalık ortaya çıkar. Ancak, kanıt birkaç satır sadece belirli yapışkan fenotipleri sıtma ciddi patolojik sonuçlar ile ilişkili olması muhtemel olduğunu göstermektedir. Bu tür özel ana parazit etkileşimleri bir örneği, belirli bir yapışma özelliklerine sahip pRBC bağlayıcı desteklemek için hücreler arası yapışma molekülü-1 kabiliyeti 4,5 serebral malarya gelişimi ile bağlantılı olmuştur in vitro olarak gösterilmiştir. Plasenta da chondrotin sülfat ile, sıtma ile enfekte gebe kadınlarda tercihli pRBC birikimi bir site olarak kabul edilmiştir bir sinsityotrofoblastlarda üzerinde ifade bu hat ana reseptör 6 olarak plasental intervillöz alanı. PRBC t rozetlenmesitamamlayıcı reseptör 1 (CD35) 7,8 ile o bulaşmamış eritrosit de ağır hastalık 9 ile ilişkilendirilmiştir. En son anlatılan S. biri falciparum&#39;un cytoadherence fenotipleri in vitro trombosit aracılı topaklar oluşturmak için pRBC kabiliyetidir. Bu tür pRBC kümeleri oluşumu CD36, trombosit yüzeyinde ifade edilen bir glikoprotein gerektirir. Endotel hücreleri ve trombositler de dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde ifade başka bir insan reseptörü gC1qR/HABP1/p32, aynı zamanda kümeleri 10 oluşturmak için trombositler üzerinde pRBC yapışmasını kolaylaştırmak için gösterilmiştir. In vivo olarak oluşur topaklanma belirsizliğini koruyor, ancak CM 11 öldü Malavili çocukların beyin mikrovasküler açıklanan trombositlerin önemli birikimi için sorumlu olabilir olsun. Buna ek olarak, klinik yeteneği in vitro olarak gelme kültürleri izole doğrudan Malawi&#39;li 12 hastalığın şiddeti ile bağlantılıydı </sup&gt; Ve Mozambik hasta 13, (olmasa da Malili 14). Kötü karakterize pRBC topaklanma fenotip çeşitli yönleri ile, bu konuda mevcut çalışmalar standart bir prosedür takip değil. Bunun nedeni tahlil 15 doğasında bilinen yüksek değişkenliğin önemli bir konudur. Burada, P. in vitro trombosit aracılı clumping için bir yöntem sunar diğer gruplar için tutarlı bir yöntem için bir platform sağlamak ve gelecekteki çalışmalarda bu fenotip soruşturmada sınırlamalar konusunda bilinçlendirilmesi umuyor ile falciparum. Malavi merkezli olmak, biz yeni toplanmış klinik izolatları dondurulması için gerek kalmadan fenotip için incelenebilir avantajı ile, özellikle sınırlı bir kaynak ayarı için tasarlanmış bir protokol sağlar.

Yaklaşık% 70 P. olgun aşamaları kullanarak bir Platelet dolayımlı yığın testi için bir örnek plasmagel flotasyon ile zenginleştirmeden sonra falciparum, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. Bir yığın üç veya daha fazla enfekte eritrositlerin bir toplamıdır. Akridin turuncu veya etidyum bromür ile boyanarak floresan mikroskobu ile görüntülenmiştir olabilir. Etidyum bromür kırmızı 493 nm bir uyarma maksimum ve rodamin boyalar benzer 620 nm emisyon maksimum (, sahipken akridin turuncu, 502 nm dalga boyunda bir uyarım maksimum ve 525 nm (yeşil) bir emisyon maksimum, floresein için spektral benzer .) Bu noktalar gibi hücre yığınlar olarak ve floresan altında görünür ışık altında, normal olarak Kümelenmeye kolayca mikroskop altında tespit edilir, Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi (sırasıyla akridin turuncu ve etidyum bromid boyalarla boyanmış zaman yeşil ve kırmızı akridin oranj kullanılarak 30 dakika zaman noktasında .) Kümeleri büyük, daha büyük hücre agrega un görünürder normal ışık ve yeşil ya da kırmızı altındaki en noktalar büyük ilgili boyalar için floresan. Boyalar hedef DNA ve bu nedenle leke çekirdekleri, trombosit ve bulaşmamış RBC çekirdeklerin onların eksikliği nedeniyle floresan mikroskop altında tespit olmadığından. 4.7 küçük pRBC kümeleri Rastgele oluşumu ± 1.6 nakline / yığın 30 dakika sonra ortaya çıkar. Yığın boyutunu önemli ölçüde çok sayıda pRBC / görsel sayılır olamazdı yığın içeren bazı kümeleri ile 120 dakika inkübasyondan sonra&gt; 15 pRBC / kümeleri bir ortalama artırır. Enfekte hücre sayısı çift tahlillerinde sayılır yığıntı / 1,000 enfekte olmuş hücrelerde mevcut gibi topaklanma fenotip sıklığı hesaplanır. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1.jpg" /> Şekil 1. Deneme topaklanma için iş akışı. Trombosit rICH ve fakir plazma (A) ve S. falciparum ile enfekte eritrosit kültürü (B) topaklanma testi (C) hazırlanmış ve daha sonra birleştirilir. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2.jpg" /> Şekil 2. P. ile enfekte eritrositlerin topaklanma falciparum laboratuvar izole. 0 zamanında HB3 oluşturduğu kümeleri, 30 ve 120 trombosit açısından zengin plazma dakika (A) ve trombosit kötü plazma (B) kötü küme oluşumu. Testi Sınırlamalar Özellikle trombosit fonksiyonu ya da sonucu etkiler etkiler ve bunların çoğu zaten Arman ve Rowe 15 vurgulanmıştır sınırlamalar vardır. Burada differe de karşılaşılabilecek olası sorunları bazı sözTestin nt aşamaları: <ol><li> In vitro kültür klinik izolatlar adapte bazen uzun kültür süreleri topaklar oluşmasına izin vermek için yeteri kadar yüksek parasitaemia elde etmek için gerekli olan bir sorun olabilir. P. yüksek antijenik değişim oranları falciparum, kültür-adapte parazitin yapışkan fenotip kültüründe uzun zaman sonra orijinal bulaşmasını parazit nüfusun yansıtmıyor olabilir. </li><li> Kan grubu antijenleri bağlı olarak spesifik olmayan aglütinasyon önlemek için, trombosit vericisi aynı tahlilde kullanılan klinik izolatları veya evrensel verici kanı antijen grubu O-el ile kan grubu antijeni ile uyumlu olmalıdır. Ancak, kan grubu bireyler gibi Malavi gibi Afrika sitelerinde nadir O-ve bu nedenle yaygın olarak kullanılan trombosit kan grubu O + vericilerden elde edilen ve kan grubu için uyumlu olmak zorunda. </li><li> Islak bir slayt hazırlanması kümeleri sayma c olarak görüntü yakalama için hantal ve zorluarşın sürekli hareket halindeler. Genellikle, pRBC kapak kayma kenarlarında birikir ya da kolayca gerçek kümeleri ile karışabilir &quot;yanlış&quot; kümeleri oluşturan birbirine yapışma eğilimi gösterirler. Hücre hareketini azaltmak için, analizden önce oda sıcaklığında 15 dakika süreyle sedimente hücreleri sağlar. </li><li> Topaklanma testi zaman duyarlıdır ve bu nedenle sadece bir örnek en iyi doğruluk için her seferinde kişi başına analiz edilmesini sağlar. Iki farklı örnek için zaman örnekleme noktalarının kolayca aynı anda birden fazla numune taşıma eğer örnekleri arasında uyumsuz örnekleme zaman noktalarında çıkan, çakışabilir. Bu gibi durumlarda, sofistike yazılım kantitatif yığın boyutlarını hesaplamak olabilir ya da alternatif olarak hücre-spesifik antikorlar kümeleri bileşimini analiz etmek için kullanılabilir. Bu testte kullanılması muhtemel olduğu bu teknikleri büyük ölçüde kaynak kötü ortamlarda, verilerin önemini artırmak olsa da, bu tür teknikler ve ekipman hazır değildir. </li></ol>

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting at JoVE.com

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Bu yöntem, Platelet dolayımlı topaklanma fenotip inceler<em&gt; Plasmodium falciparum</emKlinik izolatlarında&gt; ile enfekte eritrositler (pRBC). Bu, trombosit açısından zengin plazma ve pRBC bir süspansiyonu izole edilmesi ve co-kuluçkaya yatırarak gerçekleştirilir.

Trombosit-aracılı kesekleşme için Basit Protokolü<em&gt; Plasmodium falciparum</emBir kaynak Poor Setting&gt; ile enfekte Eritrosit

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Kemirgen Sıtma Parazitler Genetik Haç üretimi için protokol

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Yellow Fever Sivrisinek Hemocytes Toplama ve Boyama için Protokol Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

DNA ekstraksiyonu için A Simple Chelex Protokolü<em&gt; Anofel</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Ayrılması<em&gt; Plasmodium falciparum</emManyetik Yoluyla&gt; Geç Evre-enfekte Eritrositler

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Hepatit C Virüsü Çoğaltma Analizi için Protokol

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Yüksek Kapasiteli saflaştırılması<em&gt; Plasmodium falciparum</emOpsonizing Antikor Analizlerde kullanım için&gt; merozoitler

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

İnfiltratif Lenfositlerinin Analiz Olmayan enzimatik ayırmak Taze İnsan Dokusuna Basit ve Hızlı Protokolü

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Yöntemler Küçük RNA&#39;ların ve Ribosomal doluluk Düzenleyici Rolü Araştırma<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...