Name: neo-islet formation in liver of diabetic mice by helper-dependent adenoviral vector-mediated gene transfer
Uploaded: 2012-10-10T13:00:00
Duration: 16 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer at JoVE.com

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة: ​​R03 DK089061-01 (VKY)؛ NIH: K08 DK068391 (VKY)؛ السكري والغدد الصماء ومركز أبحاث-(DERC - P30DK079638) في كلية بايلور للطب، منحة التجريبية والجدوى من وDERC (VKY)؛ مؤسسة أبحاث السكري الأحداث: JDRF جائزة # 5-2006-134 (VKY).

<ol>
	<li>Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+helper-dependent+adenovirus+vector+system:+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal.">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).</li><li>Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+correction+of+genetic+deficiency+in+mice+with+a+single+injection+of+helper-dependent+adenoviral+vector.">Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).</li><li>Belalcazar, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+expression+of+human+apolipoprotein+A-I+mediated+by+helper-dependent+adenovirus+gene+transfer+inhibits+atherosclerosis+progression+and+remodels+atherosclerotic+plaques+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Circulation. 107, 2726-2732 (2003).</li><li>Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+correction+of+low-density+lipoprotein+receptor-deficient+mice+with+a+helper-dependent+adenoviral+vector+expressing+the+very+low-density+lipoprotein+receptor.">Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor.</a> Circulation. 103, 1274-1281 (2001).</li><li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+receptor+gene+therapy+using+helper-dependent+adenovirus+produces+long-term+protection+against+atherosclerosis+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).</li><li>Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-efficiency+Cre/loxP-based+system+for+construction+of+adenoviral+vectors.">A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).</li><li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production.">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).</li><li>Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-Dependent+Adenoviral+Vectors.">Helper-Dependent Adenoviral Vectors.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin3+is+sufficient+for+transdetermination+of+hepatic+progenitor+cells+into+neo-islets+in+vivo+but+not+transdifferentiation+of+hepatocytes.">Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes.</a> Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+with+Neurogenin+3+and+Betacellulin+Reverses+Major+Metabolic+Problems+in+Insulin-Deficient+Diabetic+Mice.">Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice.</a> Endocrinology. , (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد وضعت HDAds للتغلب على ضعف الطلب في وقت مبكر جيل وتسخير لتطبيق العلاج الجيني. ومع ذلك، تظل التحديات التقنية. على سبيل المثال، يتطلب HDAd HV للتغليف HDAd والتضخيم ناقلات ليست فعالة مثل الإعلانات الجيل المبكر. HV هو الجيل الأول والإعلان أي تلوث التسوية HV فعالية HDAd. ولذلك، ترنسفكأيشن كفاءة عالية والظروف المثلى لمرور كل مسلسل حاسمة. مقياس آخر للإنتاج متجه الحرجة هو الذي مرور (P1-P4) يجب أن تستخدم لمرور اللاحقة (5) التي يتم استخدامها بشكل مباشر واللقاح لخلايا التعليق. لتجربتنا، ويتم الحصول على أفضل النتائج باستخدام مرور التي يتم من خلالها زيادة كبيرة HDAd نسبة ناقلات في المقطع التالي (P3 في الشكل 2). العائد من ناقلات HDAd يعتمد على أشرطة التحوير. أثناء الإنتاج الموجه، يتم التعبير عن الجينات المحورة سواء لأن كلا الجينات هي تحتفي كل مكان المروج. Ngn3 هو عامل النسخ وبى تى سى هو عامل النمو، مما يوحي بأن HDAd عامل النسخ ناقلات التعبير عن النسب التي قد تؤثر على الخلايا ناقلات يمنع التضخيم في حين أن هرمون النمو يساعد في النسخ المتماثل معربا عن النواقل والتعبئة والتغليف. مع افتراض مستويات وبائية مرض السكري، وهناك حاجة إلى نهج جديدة لاستعادة ب خلايا الشامل. في هذا التقرير، ونحن تصف طرق للاستفادة من مزايا ناقلات HDAd لإحداث نقل الجينات من جزيرة النسب، تعريف عامل النسخ، Ngn3 جنبا إلى جنب مع عامل النمو جزيرة، betacellulin للحث على جزيرة neogenesis في مناطق حول الأوعية البابية في الكبد. لتقييم فعالية هذا، من المهم أن تختار الفئران مع ارتفاع السكر في الدم مستقرة وضمان إدراج ضوابط ملائمة دائما. لهذا التجارب نقل الجينات، التعامل مع ناقلات الفارغة وينبغي دائما أن تستخدم الفئران من السكري. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام HDAd-Ngn3 وHDAd بى تى سى المعاملة بشكل فردي السكري ميلم يقدم لاختبار مساهمة فردية من هذه الجينات اثنين في جزيرة neogenesis. كما يدل على أن البيانات المتوفرة لدينا Ngn3 وحدها كافية لإحداث جزيرة neogenesis، ولكن إضافة عامل النمو، بى تى سى، ويعمل على زيادة استجابة مما يؤدي إلى تحريض قوية من neogenesis جزيرة. من المهم أيضا لاختبار أن يتحقق في الواقع تعبير ناقلات في النسيج المستهدف، والكبد وأيضا لإثبات أن يعاير الأنسولين في بلازما الفئران التي عولجت من لا يأتي من الجزر المتبقية في البنكرياس، من خلال إظهار عدم وجود البنكرياس الجزر في الفئران من السكري. وباختصار، فإن الاستفادة من نظام HDAd النواقل لنقل الجينات يكمن في قدرتها الاستنساخ عالية، تنبيغ كفاءة والتعبير الجيني طويلة دائم في الكبد مع الحد الأدنى للسمية المزمنة وكذلك طبيعتها التكامل عدم الجينوم المتجه إلى المضيف كروموسوم. القيود الرئيسية هي الخطوات المعقدة التي تنطوي عليها الجيل ولهافي الجسم الحي يقتصر تطبيق في المقام الأول إلى الكبد المصلي مع الإعلان الأكثر شعبية 5. يمكن أن يتسبب جزيرة neogenesis لاستعادة كامل الانسولين البلازما وتحمل الجلوكوز في الفئران من السكري عن طريق حفز جزيرة neogenesis في الكبد عن طريق نقل الجينات من عامل النسخ جزيرة النسب-تحديد وNgn3 جنبا إلى جنب مع عامل النمو جزيرة، betacellulin. في هذا التقرير، وتبين لنا البروتوكول الأمثل لتوليد عالية الجودة HDAd-Ngn3 وHDAd بى تى سى، وشرح تقنيات للحث وتقييم neogenesis جزيرة في كبد الفئران من السكري ارتفاع السكر في الدم لعكس. الحاشية: والنواقل الفيروسية وخطوط الخلايا الموصوفة هنا متاحة من كور مختبر النواقل وإنتاج مركز أبحاث السكري، كلية بايلور للطب ( <a href="http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731" target="_blank">http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm؟pmid=7731</a> ). بعض مجموعات تجارية وتتوفر أيضا لتوليد فيروسات HDAd (مثل Microbix biosystEMS وشركة).

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td></tr><tr><td> ProFectionR عدة ترنسفكأيشن الثدييات </td><td> Promega </td><td> E1200 </td></tr><tr><td> DNeasy الدم والأنسجة كيت (50) </td><td> QIAGEN </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> PerfeCTa SYBR الأخضر SuperMix، ROX </td><td> كوانتا العلوم البيولوجية </td><td> 95055-500 </td></tr><tr><td> الصوديوم deoxycholate </td><td> سيجما </td><td> D6750-25G </td></tr><tr><td> MEM مسحوق </td><td> إينفيتروجن </td><td> 61100087 </td></tr><tr><td> البنسلين الستربتوميسين </td><td> سيجما </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> أتلانتا الحيوية </td><td> S11150 </td></tr><tr><td> الجلوتامين L- </td><td> إينفيتروجن </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> هيغروميسين B </td><td> سيجما </td><td> H0654-1G </td></tr><tص&gt; <td> MEM EAGLE JOKLIK </td><td> سيجما </td><td> M0518-10L </td></tr><tr><td> ريبونوكلياز </td><td> روش </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> الدناز I، II الصف </td><td> روش </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Streptozocin </td><td> سيجما </td><td> s0130 </td></tr><tr><td> زجاج القوارير الدوار </td><td> كورنينج </td><td> 4500-3L </td></tr><tr><td> زجاج القوارير الدوار </td><td> كورنينج </td><td> 4500-250 </td></tr><tr><td> الشريحة A-lyzer casset </td><td> PIERCE CH </td><td> PI66380 </td></tr><tr><td> أنبوب بولي optiseal allomer، 11.2 مل </td><td> بيكمان كولتر </td><td> 362181 </td></tr><tr><td> السيزيوم كلوريد 1 كجم </td><td> JT4042-2 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> LE-80K بيكمان </td><td> بيكمان كولتر </td><td> LE-80K الأمثل نابذة فائقة السرعة </td></tr><tr><td> تصفية </td><td> VWR </td><td> 28143-338 </td></tr><tr><td> أجهزة الطرد المركزي أنبوب 500 مL </td><td> كورنينج </td><td> 431123 </td></tr><tr><td> tailveiner restrainer </td><td> برينتري العلمية، INC </td><td> تلفزيون-150 </td></tr><tr><td> الأنسولين، الفأر ELISA </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td></tr><tr><td> microvette CB300 </td><td> Sarstedt </td><td> 16.443.100 </td></tr><tr><td> D-غلوكوز </td><td> سيجما </td><td> G8270 </td></tr><tr><td> الماوس C-ELISA كيت الببتيد </td><td> واكو البحتة للصناعات الكيماوية المحدودة </td><td> # 631-07231 </td></tr><tr><td> خنزير غينيا المضادة للأنسولين الجسم المضاد </td><td> Abcam </td><td> ab7842 </td></tr><tr><td> الماعز المضادة للأجسام المضادة Pdx1 </td><td> هدية من الدكتور كريستوفر رايت </td><td></td></tr><tr><td> الماوس المضادة Ngn3 الأجسام المضادة </td><td> بيتا اتحاد خلية علم الأحياء، جامعة. من ولاية بنسلفانيا </td><td> AB2013 </td></tr><tr><td> الماوس المضادة Nkx6.1 الأجسام المضادة </td><td> بيتا اتحاد خلية علم الأحياء، جامعة. من Pennsylvania </td><td> F64A6B4 </td></tr><tr><td> الأجسام المضادة لمكافحة betacellulin </td><td> خلية العلوم </td><td> PAAQ1 </td></tr><tr><td> ALT الكاشف اللون (SGPT) SET. </td><td> تيكو تشخيص </td><td> A526 - 120 </td></tr><tr><td> AST / (SGOT)، مجموعة لون الكاشف نقطة النهاية </td><td> تيكو تشخيص </td><td> A561-120 </td></tr></tbody></table> الجدول 2. الكواشف والمعدات الخاصة.

neo-islet formation in liver of diabetic mice by helper-dependent adenoviral vector-mediated gene transfer

ويتسبب مرض السكري نوع 1 من تدمير الخلايا T بوساطة المناعة الذاتية من الخلايا المنتجة للانسولين في البنكرياس. حتى الآن استبدال الأنسولين لا تزال هي العلاج الرئيسي، لأنه قد تم زرع جزيرة محدودة بمدى توفر الجهات المانحة والحاجة إلى كبت المناعة على المدى الطويل. الناجم عن جزيرة neogenesis من نقل الجينات من Neuogenin3 (Ngn3)، وجزيرة النسب، تعريف عامل النسخ محددة وBetacellulin (BTC)، وهو عامل نمو جزيرة لديه القدرة على علاج مرض السكري نوع 1. ناقلات الغدانية (اعلانات) هي كفاءة عالية ناقلات نقل الجينات، ولكن في وقت مبكر إعلانات الجيل لها عيوب عديدة لاستخدام في الجسم الحي. التي تعتمد على الإعلانات المساعد (HDAds) هي الإعلانات الأكثر تقدما التي تم تطويرها لتحسين سلامة الملف الشخصي الجيل المبكر من الإعلانات والتحوير لإطالة التعبير 1. أنها تفتقر للسمية المزمنة الفيروسية لأنها تفتقر تسلسل الترميز 2-5 والاحتفاظ فقط الإعلان رابطة الدول المستقلة شاللازمة للنسخ المتماثل المتجه ements والتعبئة والتغليف. هذا يسمح الاستنساخ تصل إلى الجينات KB 36. في هذا البروتوكول، ونحن تصف طريقة لتوليد HDAd-Ngn3 وHDAd بى تى سى وعلى تقديم هذه النواقل في الفئران التي يسببها السكري STZ. نتائجنا تظهر أن شارك في حقن HDAd-Ngn3 و &quot;الجزر الجدد &#39;HDAd-بى تى سى يحفز في الكبد وارتفاع السكر في الدم في الفئران عكس السكري.

Watch this Scientific Journal Video about Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer at JoVE.com

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

وصفنا كبدي الجدد جزيرة تشكيل في STZ (بالستربتوزوتوسين)-يسببها الفئران من السكري عن طريق نقل الجينات من Neurogenin3 (Ngn3) وBetacellulin (BTC) باستخدام المساعد التي تعتمد على ناقلات الغدانية (HDAd) وعكس ارتفاع السكر في الدم. لدينا أسلوب يأخذ مزايا المساعد التي تعتمد على ناقلات الغدانية مع كفاءة عالية في الجسم الحي تنبيغ والتعبير الجيني طويلة الأمد.

الجدد في جزيرة تشكيل الكبد من الفئران من السكري من مساعد التي تعتمد على الغدانية نقل الجينات بوساطة ناقلات

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Use of a Hanging-weight System for Liver Ischemia in Mice

استخدام نظام اعدام الوزن لالإسكيمية الكبد في الفئران

Acute liver injury due to ischemia can occur during several clinical procedures e.g. liver transplantation, hepatic tumor resection or trauma repair and ...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

إنشاء والدعوة للأورام الشبكية الإنسان في الفئران أن نقص المناعة

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

نقل الجينات لقصور القلب الدماغية في نموذج ما قبل السريرية

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine ...

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

تقييم إفراغ المعدة في الفئران من السكري غير البدناء باستخدام [<sup&gt; 13</sup&gt; C]-الأوكتانويك اختبار التنفس حمض

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used ...

Vascular Gene Transfer from Metallic Stent Surfaces Using Adenoviral Vectors Tethered through Hydrolysable Cross-linkers

الأوعية الدموية نقل الجينات من الدعامات المعدنية السطوح عن طريق ناقلات الفيروسة الغدانية مربوط من خلال المتحللة عبر linkers

In-stent restenosis presents a major complication of stent-based revascularization procedures widely used to re-establish blood flow through critically ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

القناة الصفراوية ربط في الفئران: تحريض التهاب الكبد والتليف الإصابات التي كتبها الانسدادي ركود صفراوي

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

المحافظة على الكبد وظيفية الإنسان والاسترداد من قبل وسائل Subnormothermic آلة الإرواء

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

في فيفو نقل الجينات ببطانة الشريان السباتي المشترك الأرنب

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice

بروتوكول لخلق الجروح المزمنة في الفئران السكري

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ...

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

العلاج الجيني بوساطة ناقلات لينتيفيرال من خلايا الكبد فيفو السابقين للزرع الذاتي في الخنازير

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...