Name: neo-islet formation in liver of diabetic mice by helper-dependent adenoviral vector-mediated gene transfer
Uploaded: 2012-10-10T13:00:00
Duration: 16 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH: R03 DK089061-01 (VKY), NIH: K08 DK068391 (VKY), Diabetes og endokrinologi Research Center-(DERC - P30DK079638) ved Baylor College of Medicine, en Pilot &amp; Feasibility tilskud fra Den DERC (VKY) Juvenile Diabetes Research Foundation: JDRF Award # 5-2006-134 (VKY).

<ol>
	<li>Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+helper-dependent+adenovirus+vector+system:+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal.">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).</li><li>Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+correction+of+genetic+deficiency+in+mice+with+a+single+injection+of+helper-dependent+adenoviral+vector.">Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).</li><li>Belalcazar, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+expression+of+human+apolipoprotein+A-I+mediated+by+helper-dependent+adenovirus+gene+transfer+inhibits+atherosclerosis+progression+and+remodels+atherosclerotic+plaques+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Circulation. 107, 2726-2732 (2003).</li><li>Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+correction+of+low-density+lipoprotein+receptor-deficient+mice+with+a+helper-dependent+adenoviral+vector+expressing+the+very+low-density+lipoprotein+receptor.">Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor.</a> Circulation. 103, 1274-1281 (2001).</li><li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+receptor+gene+therapy+using+helper-dependent+adenovirus+produces+long-term+protection+against+atherosclerosis+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).</li><li>Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-efficiency+Cre/loxP-based+system+for+construction+of+adenoviral+vectors.">A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).</li><li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production.">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).</li><li>Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-Dependent+Adenoviral+Vectors.">Helper-Dependent Adenoviral Vectors.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin3+is+sufficient+for+transdetermination+of+hepatic+progenitor+cells+into+neo-islets+in+vivo+but+not+transdifferentiation+of+hepatocytes.">Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes.</a> Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+with+Neurogenin+3+and+Betacellulin+Reverses+Major+Metabolic+Problems+in+Insulin-Deficient+Diabetic+Mice.">Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice.</a> Endocrinology. , (2009).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

HDAds er blevet udviklet for at overvinde svagheden ved tidlig generation annoncer og udnytte til genterapi applikation. De tekniske udfordringer. For eksempel kræver HDAd HV for HDAd emballage og vektor forstærkning er ikke så effektiv som tidlige generation annoncer. HV er en første generation Ad og enhver forurening af HV kompromis effektiviteten af ​​HDAd. Derfor meget effektiv transfektion og optimale betingelser for hver seriel passage er kritiske. En anden kritisk parameter for vektor produktionen hvilken passage (P1-P4) bør anvendes til efterfølgende passage 5, der anvendes direkte som inokulum til suspensionsceller. Til vores erfaring, opnås de bedste resultater opnås ved anvendelse af passagen, hvorved HDAd vektor andel forøges dramatisk i den følgende passage (P3 i figur 2). Udbyttet af HDAd vektorer afhænger af transgene kassetter. Under vektorproduktion er begge transgener udtrykt fordi begge gener er underallestedsnærværende promoter. Ngn3 er en transkriptionsfaktor og BTC er en vækstfaktor, hvilket antyder, at HDAd vektor der udtrykker transkriptionsfaktor som kan påvirke cellelinie inhiberer vektoramplifikation, mens der udtrykker væksthormon hjælper i vektor replikation og pakning. Med diabetes antager epidemiske proportioner, er nye tilgange til at genoprette b-cellemasse nødvendig. I denne rapport, beskriver vi fremgangsmåder til at udnytte fordelene ved HDAd vektorer for at bevirke genoverføring af ø-slægt-definerende transskriptionsfaktor, Ngn3 sammen med ø-vækstfaktor, til betacellulin inducere ø Neogenesis i periportale områder af leveren. At vurdere effektiviteten af ​​dette, er det vigtigt at vælge mus med stabil hyperglykæmi og sikre, at passende kontrol altid er indbefattet. Til dette gentransferstoffer eksperimenter behandledes den tomme vektor diabetiske mus bør altid anvendes. Hertil kommer, individuelt med HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC behandlet diabetisk mice tjener til at teste individuelle bidrag af disse to gener i ø Neogenesis. Da vore data viser, at Ngn3 alene er tilstrækkeligt til at inducere ø Neogenesis, men tilsætning af vækstfaktoren, BTC, tjener til at forøge svar fører til robust induktion af ø-Neogenesis. Det er også vigtigt at teste, at vektoren ekspression rent faktisk opnås i målvævet, leveren og også at vise, at insulin analyseret i plasmaet hos behandlede mus ikke kommer fra resterende øer i bugspytkirtlen, ved at demonstrere fravær af pancreas øer i diabetiske mus. Sammenfattende ligger fordelen ved HDAd-vektor-system til genoverførsel i sin høje kloning kapacitet, effektiv transduktion og langvarig genekspression i leveren med et minimum af kroniske toksicitet såvel som dens karakter ikke integration af vektor genomet i værten kromosom. De primære begrænsninger er de komplekse trin, der er involveret i dets dannelse ogin vivo applikation er primært begrænset til leveren med de mest populære Ad serotype 5. Islet Neogenesis kan induceres til at genskabe plasmainsulin og glucosetolerance hos diabetiske mus ved at inducere ø Neogenesis i leveren ved genoverførsel af ø-slægt-definerende transskriptionsfaktor, Ngn3 sammen med ø-vækstfaktor, betacellulin. I denne rapport, viser vi den optimale protokol til at generere høj kvalitet HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC, og demonstrere teknikker til at fremkalde og vurdere ø Neogenesis i lever fra diabetiske mus for at vende hyperglykæmi. Fodnote: De virale vektorer og cellelinier beskrevet her er tilgængelige fra Vector Production Core Laboratory, Diabetes Research Center, Baylor College of Medicine ( <a href="http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731" target="_blank">http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731</a> ). Nogle kommercielle kits er også tilgængelige til at generere HDAd vira (f.eks Microbix biosystems Inc.).

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> ProFectionR Mammalian Transfection kit </td><td> Promega </td><td> E1200 </td></tr><tr><td> DNeasy Blood &amp; Tissue Kit (50) </td><td> Qiagen </td><td> 69.504 </td></tr><tr><td> Perfecta SYBR Green Supermix, ROX </td><td> Quanta Biosciences </td><td> 95055-500 </td></tr><tr><td> Natriumdeoxycholat </td><td> Sigma </td><td> D6750-25G </td></tr><tr><td> MEM pulver </td><td> Invitrogen </td><td> 61100087 </td></tr><tr><td> Penicillin Streptomycin </td><td> Sigma </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Sigma </td><td> H0654-1G </td></tr><tr&gt; <td> MEM EAGLE Joklik </td><td> Sigma </td><td> M0518-10L </td></tr><tr><td> Rnase </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> DNase I, klasse II </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Streptozocin </td><td> Sigma </td><td> s0130 </td></tr><tr><td> Glas spinnerkolber </td><td> Corning </td><td> 4500-3L </td></tr><tr><td> Glas spinnerkolber </td><td> Corning </td><td> 4500-250 </td></tr><tr><td> Skub A-lyzer Casset </td><td> PIERCE CH </td><td> PI66380 </td></tr><tr><td> Tube optiseal poly allomer, 11,2 ml </td><td> Beckman Coulter </td><td> 362.181 </td></tr><tr><td> Cæsiumchlorid 1 kg </td><td> JT4042-2 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman LE-80K </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optimal LE-80K ultracentrifuge </td></tr><tr><td> Filter </td><td> VWR </td><td> 28143-338 </td></tr><tr><td> centrifugerør 500 ml </td><td> Corning </td><td> 431.123 </td></tr><tr><td> tailveiner harpiksstopperen </td><td> Braintree videnskabelige, INC </td><td> tv-150 </td></tr><tr><td> Insulin, Mus ELISA </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td></tr><tr><td> microvette CB300 </td><td> Sarstedt </td><td> 16.443.100 </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td></tr><tr><td> Muse-C-peptid-ELISA Kit </td><td> Wako Pure Chemical Industries, Ltd </td><td> # 631-07.231 </td></tr><tr><td> marsvine-anti-insulin-antistof </td><td> Abcam </td><td> ab7842 </td></tr><tr><td> gede-anti-Pdx1-antistoffet </td><td> gave fra Dr. Christopher Wright </td><td></td></tr><tr><td> mouse anti Ngn3-antistof </td><td> Beta Cell Biology Consortium, Univ.. of Pennsylvania </td><td> AB2013 </td></tr><tr><td> mouse anti Nkx6.1-antistof </td><td> Beta Cell Biology Consortium, Univ.. af Pennsylvania </td><td> F64A6B4 </td></tr><tr><td> anti-betacellulin antistof </td><td> Cell Sciences </td><td> PAAQ1 </td></tr><tr><td> ALT (SGPT) Color Reagent SET. </td><td> Teco Diagnostics </td><td> A526 - 120 </td></tr><tr><td> AST / (SGOT), Color Endpoint reagenssæt </td><td> Teco Diagnostics </td><td> A561-120 </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Specifikke Reagenser og udstyr.

neo-islet formation in liver of diabetic mice by helper-dependent adenoviral vector-mediated gene transfer

Type 1 diabetes er forårsaget af T-cellemedieret autoimmun ødelæggelse af insulinproducerende celler i bugspytkirtlen. Indtil nu insulinerstatning er stadig den vigtigste terapi, fordi ø-transplantation er blevet begrænset af donor tilgængelighed og af behovet for langvarig immunsuppression. Induceret islet Neogenesis ved genoverførsel af Neuogenin3 (Ngn3), ø-slægt-definerende specifik transkriptionsfaktor og betacellulin (BTC), en ø-vækstfaktor har potentialet til at kurere type 1 diabetes. Adenovirusvektorer (Ads) er meget effektive genoverførselsvektor, men tidlig generation Ads har flere ulemper til anvendelse in vivo. Hjælper-afhængige annoncer (HDAds) er de mest avancerede annoncer, der blev udviklet for at forbedre sikkerheden profilen af tidlig generation af annoncer og forlænge transgenekspression 1. De mangler kronisk toksicitet, fordi de mangler virale kodningssekvenser 2-5 og bevarer kun Ad cis elements nødvendige for vektor replikation og pakning. Dette tillader kloning af op til 36 kb gener. I denne protokol, beskriver vi den metode til at generere HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC og at levere disse vektorer i STZ-inducerede diabetiske mus. Vore resultater viser, at co-injektion af HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC inducerer &#39;neo øer &quot;i leveren og vender hyperglykæmi i diabetiske mus.

Watch this Scientific Journal Video about Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer at JoVE.com

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Vi beskriver hepatisk neo-ø-dannelse i STZ (streptozotocin)-inducerede diabetiske mus ved genoverførsel af Neurogenin3 (Ngn3) og betacellulin (BTC) under anvendelse af hjælper-afhængige adenovirusvektor (HDAd) og tilbageførsel af hyperglykæmi. Vores metode tager fordele hjælper-afhængige adenovirusvektorer med deres meget effektiv in vivo transduktion og den langvarige genekspression.

Neo-Islet formationen i leveren af ​​diabetiske mus med Hjælper-afhængig adenovirusvektor-medieret genoverførsel

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Use of a Hanging-weight System for Liver Ischemia in Mice

Anvendelse af en hængende vægt System til Lever iskæmi i mus

Acute liver injury due to ischemia can occur during several clinical procedures e.g. liver transplantation, hepatic tumor resection or trauma repair and ...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine ...

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Vurdering af gastrisk tømning hos ikke-overvægtige diabetiske mus ved anvendelse af en [<sup&gt; 13</sup&gt; C]-octansyre Breath Test

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used ...

Vascular Gene Transfer from Metallic Stent Surfaces Using Adenoviral Vectors Tethered through Hydrolysable Cross-linkers

Vaskulær genoverførsel fra Metallic Stent overflader ved hjælp adenovirusvektorerne tøjret gennem hydrolyserbare Tværbindere

In-stent restenosis presents a major complication of stent-based revascularization procedures widely used to re-establish blood flow through critically ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Bile Duct Ligering i mus: Induktion af inflammatorisk leverskade, og fibrose ved Obstruktiv Kolestase

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

Funktionel Human Liver Beskyttelse og inddrivelse af beløb ved Subnormothermic Machine Perfusion

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

In Vivo Genoverførsel til kanin fælles halspulsåren endotelet

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice

Protokol til at skabe kroniske sår i diabetiske mus

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ...

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral vektor-medieret genterapi af hepatocytter Ex Vivo til autolog Transplantation hos svin

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

Neo-Islet formationen i leveren af ​​diabetiske mus med Hjælper-afhængig adenovirusvektor-medieret genoverførsel

Neo-Islet formationen i leveren af diabetiske mus med Hjælper-afhængig adenovirusvektor-medieret genoverførsel