Name: neo-islet formation in liver of diabetic mice by helper-dependent adenoviral vector-mediated gene transfer
Uploaded: 2012-10-10T13:00:00
Duration: 16 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH: R03 DK089061-01 (VKY); NIH: K08 DK068391 (VKY), de Diabetes en Endocrinologie Research Center-(DERC - P30DK079638) van het Baylor College of Medicine, een Pilot &amp; Haalbaarheid subsidie ​​van de DERC (VKY); Juvenile Diabetes Research Foundation: JDRF Award # 5-2006-134 (VKY).

<ol>
	<li>Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+helper-dependent+adenovirus+vector+system:+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal.">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).</li><li>Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+correction+of+genetic+deficiency+in+mice+with+a+single+injection+of+helper-dependent+adenoviral+vector.">Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).</li><li>Belalcazar, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+expression+of+human+apolipoprotein+A-I+mediated+by+helper-dependent+adenovirus+gene+transfer+inhibits+atherosclerosis+progression+and+remodels+atherosclerotic+plaques+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Circulation. 107, 2726-2732 (2003).</li><li>Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+correction+of+low-density+lipoprotein+receptor-deficient+mice+with+a+helper-dependent+adenoviral+vector+expressing+the+very+low-density+lipoprotein+receptor.">Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor.</a> Circulation. 103, 1274-1281 (2001).</li><li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+receptor+gene+therapy+using+helper-dependent+adenovirus+produces+long-term+protection+against+atherosclerosis+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).</li><li>Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-efficiency+Cre/loxP-based+system+for+construction+of+adenoviral+vectors.">A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).</li><li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production.">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).</li><li>Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-Dependent+Adenoviral+Vectors.">Helper-Dependent Adenoviral Vectors.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin3+is+sufficient+for+transdetermination+of+hepatic+progenitor+cells+into+neo-islets+in+vivo+but+not+transdifferentiation+of+hepatocytes.">Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes.</a> Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+with+Neurogenin+3+and+Betacellulin+Reverses+Major+Metabolic+Problems+in+Insulin-Deficient+Diabetic+Mice.">Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice.</a> Endocrinology. , (2009).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

HDAds zijn ontwikkeld om de zwakke eerste generatie Ad overwinnen en benutten voor gentherapie toepassing. De technische uitdagingen. Bijvoorbeeld HDAd heeft HV voor verpakking HDAd en vector amplificatie is niet zo efficiënt als eerste generatie Ad. HV is een eerste generatie Ad en verontreiniging van HV compromis de effectiviteit van HDAd. Daarom zeer efficiënte transfectie en optimale condities voor elke seriële passage kritisch. Een kritische parameter voor productie vector welke doorgang (P1-P4) worden gebruikt voor daaropvolgende passage 5, die rechtstreeks wordt gebruikt als inoculum voor suspensiecellen. Onze ervaring, worden de beste resultaten verkregen met de passage waarmee HDAd vector deel dramatisch toeneemt in de volgende passage (P3 in figuur 2). De opbrengst van HDAd vectoren afhankelijk transgene cassettes. Tijdens vectorproductie zijn beide transgenen tot expressie omdat beide genen onderalomtegenwoordige promotor. Ngn3 is een transcriptiefactor en Btc is een groeifactor, die deze HDAd vector die transcriptiefactor die van invloed kunnen cellijn remt vector amplificatie terwijl die expressie groeihormoon helpt in vector replicatie en verpakking suggereert. Met diabetes epidemische vormen aangenomen, zijn nieuwe benaderingen van b-celmassa te herstellen dat nodig is. In dit verslag we methoden om de voordelen van HDAd vectoren benutten om genoverdracht van afstammings-eilandje definiëren transcriptiefactor, Ngn3 met het eilandje groeifactor effect te beschrijven, betacelluline op eilandje neogenese induceren in periportale gebieden van de lever. Beoordelen van de effectiviteit van deze, is het belangrijk om muizen met stabiele hyperglycemie kiezen en dat passende controles altijd voorhanden zijn. Dit gen transfer experimenten, de lege vector behandelde diabetische muizen altijd worden gebruikt. Bovendien, met behulp van HDAd-Ngn3 en HDAd-Btc individueel behandeld diabetische mice dient het testen van de individuele bijdrage van deze twee genen in eilandje neogenese. Omdat onze gegevens blijkt dat Ngn3 volstaat om eilandje neogenese induceren, maar de toevoeging van de groeifactor BTC, dient voor het versterken van de leidend tot sterke inductie van eilandje neogenese. Het is ook belangrijk om te testen of de vector expressie inderdaad bereikt in het doelweefsel, de lever en ook aangetoond dat de insuline getest in het plasma van behandelde muizen niet afkomstig is van residuele eilandjes in de pancreas, van waaruit blijkt dat het pancreas eilandjes in de diabetische muizen. Samenvattend, het voordeel van de HDAd-vector voor genoverdracht ligt in de hoge kloneringscapaciteit, efficiënte transductie en langdurige genexpressie in de lever minimum chronische toxiciteit en de aard van de niet-integratie van vector genoom in de gastheer chromosoom. De primaire beperkingen zijn de complexe stappen betrokken bij de generatie en dein vivo toepassing is grotendeels beperkt tot de lever met de meest populaire Ad serotype 5. Eilandje neogenese kan worden geïnduceerd plasma insuline en glucose tolerantie in diabetische muizen volledig te herstellen door het induceren eilandje neogenese in de lever door genoverdracht van islet afstammings-definiërende transcriptiefactor, Ngn3 met het eilandje groeifactor, betacelluline. In dit rapport geven we de optimale protocol van hoge kwaliteit HDAd-Ngn3 en HDAd-Btc genereren en demonstreren technieken om te induceren en eilandje neogenese beoordelen in de levers van diabetische muizen om hyperglycemie te keren. Voetnoot: De virale vectoren en de cellijnen hier beschreven zijn verkrijgbaar bij de Vector Production Core Laboratory, Diabetes Research Center, Baylor College of Medicine ( <a href="http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731" target="_blank">http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731</a> ). Sommige commerciële kits zijn ook beschikbaar voor het genereren van HDAd virussen (bijv. Microbix biosystems Inc.)

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> ProFectionR Mammalian Transfectie kit </td><td> Promega </td><td> E1200 </td></tr><tr><td> DNeasy Blood &amp; Tissue Kit (50) </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> Perfecta SYBR Green SuperMix, ROX </td><td> Quanta Biosciences </td><td> 95055-500 </td></tr><tr><td> Natriumdeoxycholaat </td><td> Sigma </td><td> D6750-25G </td></tr><tr><td> MEM poeder </td><td> Invitrogen </td><td> 61100087 </td></tr><tr><td> Penicilline streptomycine </td><td> Sigma </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Hygromycine B </td><td> Sigma </td><td> H0654-1G </td></tr><tr&gt; <td> MEM EAGLE Joklik </td><td> Sigma </td><td> M0518-10L </td></tr><tr><td> Rnase </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> DNase I, graad II </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Streptozocine </td><td> Sigma </td><td> s0130 </td></tr><tr><td> Glas spinner kolven </td><td> Corning </td><td> 4500-3L </td></tr><tr><td> Glas spinner kolven </td><td> Corning </td><td> 4500-250 </td></tr><tr><td> Schuif A-Lyzer Casset </td><td> PIERCE CH </td><td> PI66380 </td></tr><tr><td> Tube optiseal poly allomer, 11,2 ml </td><td> Beckman Coulter </td><td> 362181 </td></tr><tr><td> Cesiumchloride 1 kg </td><td> JT4042-2 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman LE-80K </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optimale LE-80K ultracentrifuge </td></tr><tr><td> Filter </td><td> VWR </td><td> 28143-338 </td></tr><tr><td> centrifugebuis 500 ml </td><td> Corning </td><td> 431123 </td></tr><tr><td> tailveiner weerhouder </td><td> Braintree wetenschappelijke, INC </td><td> tv-150 </td></tr><tr><td> Insuline, muis ELISA </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td></tr><tr><td> microvette CB300 </td><td> Sarstedt </td><td> 16.443.100 </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td></tr><tr><td> Mouse C-peptide ELISA Kit </td><td> Wako Pure Chemical Industries, Ltd </td><td> # 631-07.231 </td></tr><tr><td> cavia anti-insuline antilichaam </td><td> Abcam </td><td> ab7842 </td></tr><tr><td> geit-anti-Pdx1 antilichaam </td><td> gift van Dr Christopher Wright </td><td></td></tr><tr><td> muis anti Ngn3 antilichaam </td><td> Beta Cell Biology Consortium, Univ. van Pennsylvania </td><td> AB2013 </td></tr><tr><td> muis anti Nkx6.1 antilichaam </td><td> Beta Cell Biology Consortium, Univ. van Pennsylvania </td><td> F64A6B4 </td></tr><tr><td> anti-betacelluline antilichaam </td><td> Cell Sciences </td><td> PAAQ1 </td></tr><tr><td> ALT (SGPT) Kleur Reagens SET. </td><td> Teco Diagnostics </td><td> A526 - 120 </td></tr><tr><td> AST / (SGOT), Kleur Endpoint Reagent Set </td><td> Teco Diagnostics </td><td> A561-120 </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Specifieke Reagentia en apparatuur.

neo-islet formation in liver of diabetic mice by helper-dependent adenoviral vector-mediated gene transfer

Type 1 diabetes wordt veroorzaakt door T-cel gemedieerde auto-immune vernietiging van de insuline producerende cellen in de pancreas. Tot nu insuline vervanging nog steeds de belangrijkste therapie, omdat eilandjestransplantatie beperkt door donor beschikbaarheid en de noodzaak van langdurige immunosuppressie. Induced eilandje neogenese door genoverdracht van Neuogenin3 (Ngn3), het eilandje lineage definiërende specifieke transcriptiefactor en betacelluline (BTC), een eilandje groeifactor heeft de potentie om type 1 diabetes te genezen. Adenovirale vectoren (Ads) zijn zeer efficiënte genoverdracht vector, maar eerste generatie Ad hebben verschillende nadelen voor in vivo gebruik. Helper-afhankelijke advertenties (HDAds) zijn de meest geavanceerde Advertenties die zijn ontwikkeld om het veiligheidsprofiel van de vroege generatie van advertenties te verbeteren en om transgene expressie 1 te verlengen. Het ontbreekt hen aan chronische toxiciteit omdat ze geen virale coderende sequenties 2-5 en behouden slechts Ad cis elements nodig vector replicatie en verpakking. Dit maakt het klonen van 36 kb genen. In dit protocol beschrijven we de methode HDAd-Ngn3 en HDAd-Btc genereren en deze vectoren leveren in STZ-geïnduceerde diabetische muizen. Onze resultaten tonen aan dat co-injectie van HDAd-Ngn3 en &#39;neo eilandjes&#39; HDAd-Btc induceert in de lever en hyperglycemie keert bij diabetische muizen.

Watch this Scientific Journal Video about Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer at JoVE.com

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

We beschrijven de lever neo-eilandje formatie in STZ (streptozotocine)-geïnduceerde diabetische muizen door genoverdracht van Neurogenin3 (Ngn3) en betacelluline (BTC) met behulp van helper-afhankelijke adenovirale vector (HDAd) en de omkering van hyperglycemie. Onze methode wordt voordelen van helper-afhankelijke adenovirale vectoren met hun zeer efficiënt in vivo transductie en langdurige genexpressie.

Neo-Islet Vorming in de lever van muizen met diabetes door Helper-afhankelijke adenovirale vector-gemedieerde genoverdracht

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Use of a Hanging-weight System for Liver Ischemia in Mice

Gebruik van een hangende gewicht System voor lever ischemie in Muizen

Acute liver injury due to ischemia can occur during several clinical procedures e.g. liver transplantation, hepatic tumor resection or trauma repair and ...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Oprichting en Voortplanting van Human Retinoblastoom Tumoren in het immuunsysteem van deficiënte muizen

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

Gene Transfer voor ischemisch hartfalen in een preklinisch model

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine ...

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Beoordeling van de maaglediging in niet-obese diabetische muizen met behulp van een [<sup&gt; 13</sup&gt; C]-octaanzuur ademtest

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used ...

Vascular Gene Transfer from Metallic Stent Surfaces Using Adenoviral Vectors Tethered through Hydrolysable Cross-linkers

Vasculaire Gene Transfer van Metallic stentoppervlakken met adenovirale vectoren Tethered via Hydrolyseerbare Cross-linkers

In-stent restenosis presents a major complication of stent-based revascularization procedures widely used to re-establish blood flow through critically ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Bile-duct Ligatie in Muizen: Inductie van Inflammatoire leverschade en Fibrosis door Obstructive Cholestase

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

Functionele menselijke lever behoud en herstel door middel van Subnormothermic Machine perfusie

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

In Vivo Genoverdracht op het konijn gemeenschappelijke halsslagader endotheel

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice

Protocol voor het maken van chronische wonden bij diabetische muizen

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ...

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentivirale Vector-gemedieerde gentherapie van hepatocyten Ex Vivo voor autologe transplantatie in varkens

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...