Name: neo-islet formation in liver of diabetic mice by helper-dependent adenoviral vector-mediated gene transfer
Uploaded: 2012-10-10T13:00:00
Duration: 16 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות: R03 DK089061-01 (VKY); NIH: K08 DK068391 (VKY); הסוכרת ואנדוקרינולוגיה במרכז המחקר-(DERC - P30DK079638) ביילור לרפואה, מענק פיילוט והיתכנות מ DERC (VKY); לסוכרת נעורי קרן מחקר: פרס JDRF # 5-2006-134 (VKY).

<ol>
	<li>Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+helper-dependent+adenovirus+vector+system:+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal.">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).</li><li>Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+correction+of+genetic+deficiency+in+mice+with+a+single+injection+of+helper-dependent+adenoviral+vector.">Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).</li><li>Belalcazar, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+expression+of+human+apolipoprotein+A-I+mediated+by+helper-dependent+adenovirus+gene+transfer+inhibits+atherosclerosis+progression+and+remodels+atherosclerotic+plaques+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Circulation. 107, 2726-2732 (2003).</li><li>Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+correction+of+low-density+lipoprotein+receptor-deficient+mice+with+a+helper-dependent+adenoviral+vector+expressing+the+very+low-density+lipoprotein+receptor.">Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor.</a> Circulation. 103, 1274-1281 (2001).</li><li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+receptor+gene+therapy+using+helper-dependent+adenovirus+produces+long-term+protection+against+atherosclerosis+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).</li><li>Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-efficiency+Cre/loxP-based+system+for+construction+of+adenoviral+vectors.">A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).</li><li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production.">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).</li><li>Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-Dependent+Adenoviral+Vectors.">Helper-Dependent Adenoviral Vectors.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin3+is+sufficient+for+transdetermination+of+hepatic+progenitor+cells+into+neo-islets+in+vivo+but+not+transdifferentiation+of+hepatocytes.">Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes.</a> Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+with+Neurogenin+3+and+Betacellulin+Reverses+Major+Metabolic+Problems+in+Insulin-Deficient+Diabetic+Mice.">Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice.</a> Endocrinology. , (2009).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

HDAds פותח כדי להתגבר על החולשה של המודעות של הדור הראשונה ולרתום ליישום ריפוי גנטי. עם זאת, אתגרים טכניים יישארו. לדוגמה, HDAd דורש HV לאריזה של HDAd והגברת וקטור הוא לא יעיל כמו מודעות של הדור הראשונה. HV הוא מודעת הדור ראשונה וכל זיהום של פשרת HV היעילות של HDAd. לכן, transfection היעיל ביותר ותנאים אופטימליים לכל קטע סידורי הם קריטיים. פרמטר קריטי נוסף לייצור וקטור הוא שמעבר (P1-P4) אמור לשמש למעבר 5 לאחר שמשמש באופן ישיר כבידוד לתאי השעיה. הניסיון שלנו, את התוצאות הטובות ביותר מתקבלות על ידי שימוש במעבר שבו שיעור הווקטור HDAd הוא גדל באופן דרמטי בקטע הבא (P3 באיור 2). התשואה של וקטורי HDAd תלויה בקלטות transgene. במהלך ייצור וקטור, שני transgenes לידי ביטוי מפני ששני הגנים נמצאים תחתאמרגן בכל מקום. Ngn3 הוא גורם שעתוק וBTC הוא גורם גדילה, אשר טוען כי גורם HDAd וקטור מבטא שעתוק אשר עשוי להשפיע על משפחה של תאים מעכבת הגברת וקטור בעוד שהורמון הגדילה מסייע בשכפול להביע וקטור ואריזה. עם סוכרת בהנחה לממדים של מגיפה, גישות חדשות לשחזור המוני ב-תא יש צורך. בדו&quot;ח זה, אנו מתארים שיטות כדי לרתום את היתרונות של וקטורי HDAd לחולל העברת גנים מאיון גורם שושלת-הגדרת שעתוק, Ngn3 יחד עם גורם גדילת האיון, betacellulin לגרום neogenesis איון באזורי periportal של הכבד. כדי להעריך את היעילות של זה, חשוב לבחור עכברים עם היפרגליקמיה יציבה ולהבטיח שבקרות מתאימות תמיד כלולות. על הניסויים של העברת הגן הזה, הווקטור הריק טופל עכברים סוכרתיים תמיד צריכים להיות מנוצלים. בנוסף, באמצעות HDAd-Ngn3 וHDAd-BTC טופל בנפרד סוכרתי מיילce משמש כדי לבדוק את התרומה האישית של שני הגנים האלה באיון neogenesis. היות שהנתונים שלנו מראים שNgn3 בלבד מספיק כדי לגרום לאיון neogenesis, אבל התוספת של גורם הגדילה, BTC, משמשת כדי להגדיל את התגובה שמובילה לאינדוקציה חזקה של האיון neogenesis. כמו כן, חשוב לבדוק שביטוי וקטור מושגת אכן ברקמת המטרה, הכבד וגם להוכיח שהאינסולין המאושר בפלזמה של עכברים שטופלו לא בא מאיונים שיורית בלבלב, על ידי הוכחת העדר הלבלב איונים בעכברים הסוכרתיים. לסיכום, היתרון של מערכת HDAd-הווקטור להעברת גנים טמון ביכולתה הגבוהה השיבוט, תמרה יעילה וביטוי גנים לאורך זמן בכבד ברעילות כרונית מינימום, כמו גם טבעה של אינטגרציה של הגנום שאינו וקטור למארח כרומוזום. המגבלות העיקריות הן הצעדים המורכבים כרוכים בדור ושלהביישום vivo מוגבל בעיקר בכבד בסרוטיפ המודעות הפופולריים ביותר 5. איילט neogenesis יכול להיגרם לשחזר אינסולין פלזמה וסבילות לגלוקוז בעכברים סוכרתיים באופן מלא על ידי גרימת neogenesis איון בכבד על ידי העברת גנים של גורם איון שושלת המגדיר שעתוק, Ngn3 יחד עם גורם גדילת האיון, betacellulin. בדו&quot;ח זה, אנו מציגים פרוטוקול האופטימלי כדי לייצר באיכות גבוהה HDAd-Ngn3 וHDAd-BTC, ולהדגים טכניקות כדי לגרום ולהעריך neogenesis איון בכבדים של עכברים סוכרתיים להפוך היפרגליקמיה. הערה: הווקטורים הנגיפיים ושורות התאים שתוארו כאן הם זמינים ממעבדת וקטור ייצור הליבה, סוכרת מרכז מחקר, ביילור לרפואה <a href="http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731" target="_blank">(http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731).</a> כמה ערכות מסחריות זמינות גם ליצירת וירוסי HDAd (למשל Microbix biosystEMS Inc).

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> ערכת Transfection יונקי ProFectionR </td><td> Promega </td><td> E1200 </td></tr><tr><td> קיט דם ורקמות DNeasy (50) </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> Perfecta SYBR הירוק SuperMix, rox </td><td> Quanta Biosciences </td><td> 95055-500 </td></tr><tr><td> deoxycholate נתרן </td><td> סיגמא </td><td> D6750-25G </td></tr><tr><td> MEM אבקה </td><td> Invitrogen </td><td> 61100087 </td></tr><tr><td> סטרפטומיצין פניצילין </td><td> סיגמא </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> אטלנטה ביולוגית </td><td> S11150 </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> סיגמא </td><td> H0654-1G </td></tr><tr&gt; <td> MEM EAGLE JOKLIK </td><td> סיגמא </td><td> M0518-10L </td></tr><tr><td> RNase </td><td> רוש </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> DNase, כיתה השנייה </td><td> רוש </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Streptozocin </td><td> סיגמא </td><td> s0130 </td></tr><tr><td> זכוכית טווה צלוחיות </td><td> קורנינג </td><td> 4500-3L </td></tr><tr><td> זכוכית טווה צלוחיות </td><td> קורנינג </td><td> 4500-250 </td></tr><tr><td> הסט-lyzer casset </td><td> פירס CH </td><td> PI66380 </td></tr><tr><td> צינור optiseal פולי allomer, 11.2 מ&quot;ל </td><td> Beckman Coulter </td><td> 362181 </td></tr><tr><td> קילו צסיום כלוריד 1 </td><td> JT4042-2 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman LE-80k </td><td> Beckman Coulter </td><td> ultracentrifuge האופטימלי LE-80k </td></tr><tr><td> לסנן </td><td> VWR </td><td> 28143-338 </td></tr><tr><td> חובצת 500 מ &#39;צינוראני </td><td> קורנינג </td><td> 431123 </td></tr><tr><td> tailveiner עוצר </td><td> בריינטרי המדעי, INC </td><td> tv-150 </td></tr><tr><td> אינסולין, העכבר ELISA </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td></tr><tr><td> microvette CB300 </td><td> Sarstedt </td><td> 16.443.100 </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> סיגמא </td><td> G8270 </td></tr><tr><td> עכבר C-פפטיד ELISA Kit </td><td> Wako טהור תעשיות כימיות בע&quot;מ </td><td> # 631-07231 </td></tr><tr><td> נוגדן רקן אנטי אינסולין </td><td> Abcam </td><td> ab7842 </td></tr><tr><td> נוגדן עז נגד Pdx1 </td><td> מתנת ד&quot;ר כריסטופר רייט </td><td></td></tr><tr><td> עכבר אנטי Ngn3 נוגדן </td><td> מאגד ביולוגיה של תא בטא, אונ. פנסילבניה </td><td> AB2013 </td></tr><tr><td> עכבר אנטי Nkx6.1 נוגדן </td><td> מאגד ביולוגיה של תא בטא, אונ. בפנסילבניהlvania </td><td> F64A6B4 </td></tr><tr><td> נוגדן אנטי betacellulin </td><td> מדעי התא </td><td> PAAQ1 </td></tr><tr><td> (SGPT) SET המגיב הצבע ALT. </td><td> אבחון Teco </td><td> A526 - 120 </td></tr><tr><td> AST / (SGOT), סט מגיב Endpoint צבע </td><td> אבחון Teco </td><td> A561-120 </td></tr></tbody></table> טבלת 2. ריאגנטים וציוד ספציפיים.

neo-islet formation in liver of diabetic mice by helper-dependent adenoviral vector-mediated gene transfer

סוכרת מהסוג 1 נגרמת על ידי הרס התא T בתיווך אוטואימונית של תאים המייצרים אינסולין, בלבלב. עד עכשיו החלפת אינסולין היא עדיין הטיפול העיקרי, משום איון ההשתלה הוגבלה על ידי זמינות תורם ועל ידי הצורך בדיכוי חיסוני לטווח ארוך. המושרה האיון neogenesis על ידי העברת גנים מNeuogenin3 (Ngn3), גורם שעתוק איון שושלת הגדרה הספציפית וBetacellulin (BTC), גורם גדילת איון יש הפוטנציאל לרפא סוכרת מסוג 1. וקטורי adenoviral (מודעות) הם וקטור העברת גנים יעיל ביותר, עם זאת, המודעות של הדור הראשונה יש כמה חסרונות לשימוש בגוף חי. מודעות עוזרים תלויות (HDAds) הן מודעות המתקדמות ביותר שפותחו כדי לשפר את פרופיל הבטיחות של הדור הראשון של מודעות ולהאריך ביטוי transgene 1. הם חסרים רעילות כרונית כי הם חסרי רצפי קידוד נגיפי 2-5 וישמרו רק המודעות cis אלements דרוש לשכפול וקטור ואריזה. זה מאפשר שיבוט של עד 36 גני KB. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את השיטה להפקת HDAd-Ngn3 וHDAd-BTC ולספק הווקטורים האלה לעכברים חולים סוכרת STZ מושרים. התוצאות שלנו מראות כי הזרקה משותפת של HDAd-Ngn3 ו&#39;האיים &#39;ניאו HDAd-BTC גורם בכבד והופכת היפרגליקמיה בעכברים סוכרתיים.

Watch this Scientific Journal Video about Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer at JoVE.com

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

אנו מתארים היווצרות כבדה הניא איון בSTZ (streptozotocin)-מושרה עכברים סוכרתיים על ידי העברת גנים מNeurogenin3 (Ngn3) וBetacellulin (BTC) באמצעות וקטור עוזר תלוי adenoviral (HDAd) והיפוך של היפרגליקמיה. השיטה שלנו לוקחת את היתרונות של וקטורי adenoviral עוזר תלויים עימם היעיל ביותר בתמרת vivo וביטוי הגנים לאורך זמן.

כינון ניאו איילט בכבד של עכברים סוכרתיים על ידי העברת גני Helper תלוי adenoviral וקטור בתיווך

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Use of a Hanging-weight System for Liver Ischemia in Mice

השימוש במערכת תלייה משקל של איסכמיה כבד בעכברים

Acute liver injury due to ischemia can occur during several clinical procedures e.g. liver transplantation, hepatic tumor resection or trauma repair and ...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

הקמה התפשטות של גידולים רטינובלסטומה האדם עכברים החיסון לקויה

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

Gene Transfer לאי ספיקת לב איסכמי במודל פרה

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine ...

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

הערכה של ריקון קיבה בעכברים סוכרתיים ללא שימוש בשמנים [<sup&gt; 13</sup&gt; C]-octanoic בדיקת נשימת חומצה

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used ...

Vascular Gene Transfer from Metallic Stent Surfaces Using Adenoviral Vectors Tethered through Hydrolysable Cross-linkers

העברת כלי דם ג&#39;ין ממתכת סטנט משטחים באמצעות adenoviral וקטורי Tethered דרך Hydrolysable חוצה linkers

In-stent restenosis presents a major complication of stent-based revascularization procedures widely used to re-establish blood flow through critically ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

מרה Duct קשירת בעכברים: אינדוקציה של דלקת כבד פגיעה ופיברוזיס ידי חסימתית cholestasis

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

אדם תפקודי כבד שימור ושחזור על ידי אמצעי Subnormothermic מכונת זלוף

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

אין ויוו העברה גנטית כדי אנדותל העורק נפוצות הארנב

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice

פרוטוקול יצירת פצעים כרוניים עכברים סוכרתית

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ...

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral בתיווך וקטור ריפוי גנטי של Hepatocytes לשעבר Vivo עבור השתלת עצמיים של החזירים

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...