Name: neo-islet formation in liver of diabetic mice by helper-dependent adenoviral vector-mediated gene transfer
Uploaded: 2012-10-10T13:00:00
Duration: 16 min 59 s
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Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti del NIH: DK089061 R03-01 (VKY); NIH: K08 DK068391 (VKY), il diabete e Endocrinologia Research Center-(DERC - P30DK079638) presso il Baylor College of Medicine, una borsa di studio di fattibilità da Pilot &amp; il DERC (VKY); Juvenile Diabetes Research Foundation: premio JDRF # 5-2006-134 (VKY).

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	<li>Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+helper-dependent+adenovirus+vector+system:+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal.">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).</li><li>Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+correction+of+genetic+deficiency+in+mice+with+a+single+injection+of+helper-dependent+adenoviral+vector.">Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).</li><li>Belalcazar, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+expression+of+human+apolipoprotein+A-I+mediated+by+helper-dependent+adenovirus+gene+transfer+inhibits+atherosclerosis+progression+and+remodels+atherosclerotic+plaques+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Circulation. 107, 2726-2732 (2003).</li><li>Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+correction+of+low-density+lipoprotein+receptor-deficient+mice+with+a+helper-dependent+adenoviral+vector+expressing+the+very+low-density+lipoprotein+receptor.">Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor.</a> Circulation. 103, 1274-1281 (2001).</li><li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+receptor+gene+therapy+using+helper-dependent+adenovirus+produces+long-term+protection+against+atherosclerosis+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).</li><li>Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-efficiency+Cre/loxP-based+system+for+construction+of+adenoviral+vectors.">A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).</li><li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production.">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).</li><li>Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-Dependent+Adenoviral+Vectors.">Helper-Dependent Adenoviral Vectors.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin3+is+sufficient+for+transdetermination+of+hepatic+progenitor+cells+into+neo-islets+in+vivo+but+not+transdifferentiation+of+hepatocytes.">Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes.</a> Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+with+Neurogenin+3+and+Betacellulin+Reverses+Major+Metabolic+Problems+in+Insulin-Deficient+Diabetic+Mice.">Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice.</a> Endocrinology. , (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

HDAds sono stati sviluppati per superare la debolezza di annunci prima generazione e di sfruttare per l&#39;applicazione di terapia genica. Tuttavia, le sfide tecniche rimangono. Ad esempio, è necessario HDAd HV per il confezionamento e l&#39;amplificazione HDAd vettore non è così efficace come annunci prima generazione. HV è un annuncio di prima generazione e la contaminazione di compromesso HV l&#39;efficacia della HDAd. Pertanto, transfezione altamente efficiente e condizioni ottimali per ogni passaggio seriale sono critici. Un altro parametro critico per la produzione di vettori è che il passaggio (P1-P4) deve essere utilizzato per il passaggio successivo 5 che è direttamente utilizzata come inoculo per cellule in sospensione. Per la nostra esperienza, i risultati migliori si ottengono utilizzando il passaggio attraverso il quale proporzione vettore HDAd è drammaticamente aumentata nel seguente passaggio (P3 in Figura 2). La resa di vettori HDAd dipende cassette transgene. Durante la produzione vettore, entrambi i transgeni sono espressi perché entrambi i geni sono in fase dipromotore onnipresente. Ngn3 è un fattore di trascrizione e BTC è un fattore di crescita, il che suggerisce che HDAd fattore di trascrizione vettore che esprime che possono influenzare la linea cellulare inibisce amplificazione mentre vettore che esprime ormone della crescita aiuta nella replicazione vettore e confezionamento. Con il diabete assumendo proporzioni epidemiche, nuovi approcci per il ripristino delle cellule B di massa sono necessari. In questa relazione, si descrivono i metodi per sfruttare i vantaggi di vettori HDAd per effettuare il trasferimento genico di isole lignaggio di definizione fattore di trascrizione, Ngn3 insieme al fattore di crescita isolotto, betacellulin per indurre neogenesi isolotto nelle regioni periportale del fegato. Per valutare l&#39;efficacia di questo, è importante scegliere topi con iperglicemia stabile e garantire che controlli appropriati sono sempre inclusi. Per gli esperimenti di trasferimento di questo gene, il vettore vuoto trattato topi diabetici devono sempre essere utilizzato. Inoltre, utilizzando HDAd-Ngn3 e HDAd-Btc e trattate una diabetica mice serve per testare il contributo individuale di questi due geni in isolotto neogenesi. Come i nostri dati dimostrano che Ngn3 solo è sufficiente per indurre isolotto neogenesi, ma l&#39;aggiunta del fattore di crescita, Btc, serve per aumentare la risposta conseguente induzione robusto isolotto neogenesi. È anche importante verificare che il vettore di espressione è infatti realizzato nel tessuto bersaglio, il fegato e anche per dimostrare che l&#39;insulina dosati nel plasma dei topi trattati non proviene da isole residue nel pancreas, dimostrando l&#39;assenza di pancreas isolotti nei topi diabetici. In sintesi, il vantaggio di HDAd-vettore di trasferimento genico risiede nella sua capacità di clonazione elevata, trasduzione efficiente e di lunga durata espressione genica nel fegato con minima tossicità cronica e la sua natura di non-integrazione del genoma vettoriale nell&#39;ospite cromosoma. Le limitazioni principali sono i passaggi complessi coinvolti nella sua generazione e la suain applicazione vivo è principalmente limitato al fegato con il sierotipo annunci più popolare 5. Islet neogenesi può essere indotto a ripristinare completamente insulina plasmatica e la tolleranza al glucosio nei topi diabetici inducendo neogenesi isolotto nel fegato attraverso il trasferimento genico di isole lignaggio definitorio fattore di trascrizione, Ngn3 insieme con il fattore di crescita isolotto, betacellulin. In questo rapporto, si mostra il protocollo ottimale per generare alta qualità HDAd-Ngn3 e HDAd-Btc, e dimostrare le tecniche per indurre e valutare neogenesi isolotto nel fegato di topi diabetici per invertire iperglicemia. Nota: I vettori virali e le linee cellulari qui descritti sono disponibili presso il Laboratorio Nucleo Vector Produzione, Diabetes Research Center, Baylor College of Medicine ( <a href="http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731" target="_blank">http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731</a> ). Alcuni kit commerciali sono disponibili anche per la generazione di virus (ad esempio HDAd Microbix biosystems Inc.).

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> ProFectionR kit Transfection mammiferi </td><td> Promega </td><td> E1200 </td></tr><tr><td> DNeasy Blood &amp; Tissue Kit (50) </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> Perfecta SYBR Green SuperMix, ROX </td><td> Quanta Biosciences </td><td> 95055-500 </td></tr><tr><td> Sodio desossicolato </td><td> Sigma </td><td> D6750-25G </td></tr><tr><td> MEM polvere </td><td> Invitrogen </td><td> 61100087 </td></tr><tr><td> Penicillina Streptomicina </td><td> Sigma </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Sigma </td><td> H0654-1G </td></tr><tr&gt; <td> MEM EAGLE JOKLIK </td><td> Sigma </td><td> M0518-10L </td></tr><tr><td> RNasi </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> DNasi I, II grado </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Streptozocina </td><td> Sigma </td><td> s0130 </td></tr><tr><td> Vetro filatore fiaschi </td><td> Corning </td><td> 4500-3L </td></tr><tr><td> Vetro filatore fiaschi </td><td> Corning </td><td> 4500-250 </td></tr><tr><td> Far scorrere A-lizzatore Casset </td><td> PIERCE CH </td><td> PI66380 </td></tr><tr><td> Tubo optiseal poli allomer, 11.2 ml </td><td> Beckman Coulter </td><td> 362181 </td></tr><tr><td> 1 kg di cloruro di cesio </td><td> JT4042-2 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman LE-80K </td><td> Beckman Coulter </td><td> Ottimale LE-80K ultracentrifuga </td></tr><tr><td> Filtro </td><td> VWR </td><td> 28143-338 </td></tr><tr><td> centrifuga tubo 500 ml </td><td> Corning </td><td> 431123 </td></tr><tr><td> tailveiner restrainer </td><td> Braintree scientifico, INC </td><td> tv-150 </td></tr><tr><td> L&#39;insulina, Mouse ELISA </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td></tr><tr><td> microvette CB300 </td><td> Sarstedt </td><td> 16.443.100 </td></tr><tr><td> D-glucosio </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td></tr><tr><td> Mouse C-peptide ELISA Kit </td><td> Wako Pure Chemical Industries, Ltd. </td><td> # 631-07231 </td></tr><tr><td> cavia anti-insulina anticorpo </td><td> Abcam </td><td> ab7842 </td></tr><tr><td> di capra anti-anticorpo Pdx1 </td><td> dono di Dr. Christopher Wright </td><td></td></tr><tr><td> topo anti Ngn3 anticorpo </td><td> Beta cellulare Consorzio Biologia, Univ. della Pennsylvania </td><td> AB2013 </td></tr><tr><td> topo anti Nkx6.1 anticorpo </td><td> Beta cellulare Consorzio Biologia, Univ. di Pennsylvania </td><td> F64A6B4 </td></tr><tr><td> anticorpo anti-betacellulin </td><td> Cella Scienze </td><td> PAAQ1 </td></tr><tr><td> ALT (SGPT) Colore set di reagenti. </td><td> Teco Diagnostica </td><td> A526 - 120 </td></tr><tr><td> AST / (SGOT), Endpoint Reagente Imposta colore </td><td> Teco Diagnostica </td><td> A561-120 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Reagenti e attrezzature specifiche.

neo-islet formation in liver of diabetic mice by helper-dependent adenoviral vector-mediated gene transfer

Diabete di tipo 1 è causato da cellule T-mediata distruzione autoimmune delle cellule che producono insulina nel pancreas. Finora sostituzione insulina è ancora la terapia importante, perché il trapianto di isole è stata limitata dalla disponibilità del donatore e dal bisogno di lungo termine immunosoppressione. Indotto isolotto neogenesi mediante trasferimento genico di Neuogenin3 (Ngn3), l&#39;isolotto lignaggio di definizione fattore di trascrizione specifico e Betacellulin (Btc), un fattore di crescita isolotto ha il potenziale per curare diabete di tipo 1. Vettori adenovirali (Ads) sono altamente efficiente vettore di trasferimento genico, tuttavia, annunci prima generazione hanno diversi svantaggi per uso in vivo. Helper-dipendenti Pubblicità (HDAds) sono gli annunci più avanzati che sono stati sviluppati per migliorare il profilo di sicurezza della prima generazione di annunci e di prolungare espressione del transgene 1. Mancano di tossicità cronica a causa della mancanza virali sequenze codificanti 2-5 e conservare solo Ad cis elENTI necessarie per la replicazione vettore e l&#39;imballaggio. Questo permette la clonazione di fino a 36 geni kb. In questo protocollo, si descrive il metodo per generare HDAd-Ngn3 e HDAd-Btc e per fornire questi vettori in STZ indotte topi diabetici. I nostri risultati mostrano che la co-iniezione di HDAd-Ngn3 e HDAd-Btc induce &#39;isolotti neo &quot;nel fegato e inverte iperglicemia nei topi diabetici.

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Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Descriviamo epatica neo-isolotto formazione STZ (streptozotocina)-indotta topi diabetici mediante trasferimento genico di Neurogenin3 (Ngn3) e Betacellulin (Btc) utilizzando helper-dipendente vettore adenovirale (HDAd) e l&#39;inversione di iperglicemia. Il nostro metodo sfrutta le vettori adenovirali dipendenti da helper con la loro alta efficienza nella trasduzione vivo e l&#39;espressione genica lunga durata.

Neo-Islet formazione nel fegato di topi diabetici da Helper-dipendente adenovirale Vector-Mediated Gene Transfer

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