Name: neo-islet formation in liver of diabetic mice by helper-dependent adenoviral vector-mediated gene transfer
Uploaded: 2012-10-10T13:00:00
Duration: 16 min 59 s
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この作品は、NIHからの補助金によって支えられて：R03 DK089061-01（VKY）; NIH：K08 DK068391（VKY）、糖尿病·内分泌研究センター - （DERC - P30DK079638）ベイラー医科大学からパイロット＆フィージビリティ助成DERC（VKY）、若年性糖尿病研究財団：JDRF賞＃5-2006-134（VKY）。

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	<li>Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+helper-dependent+adenovirus+vector+system:+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal.">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).</li><li>Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+correction+of+genetic+deficiency+in+mice+with+a+single+injection+of+helper-dependent+adenoviral+vector.">Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).</li><li>Belalcazar, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+expression+of+human+apolipoprotein+A-I+mediated+by+helper-dependent+adenovirus+gene+transfer+inhibits+atherosclerosis+progression+and+remodels+atherosclerotic+plaques+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Circulation. 107, 2726-2732 (2003).</li><li>Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+correction+of+low-density+lipoprotein+receptor-deficient+mice+with+a+helper-dependent+adenoviral+vector+expressing+the+very+low-density+lipoprotein+receptor.">Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor.</a> Circulation. 103, 1274-1281 (2001).</li><li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+receptor+gene+therapy+using+helper-dependent+adenovirus+produces+long-term+protection+against+atherosclerosis+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).</li><li>Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-efficiency+Cre/loxP-based+system+for+construction+of+adenoviral+vectors.">A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).</li><li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production.">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).</li><li>Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-Dependent+Adenoviral+Vectors.">Helper-Dependent Adenoviral Vectors.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin3+is+sufficient+for+transdetermination+of+hepatic+progenitor+cells+into+neo-islets+in+vivo+but+not+transdifferentiation+of+hepatocytes.">Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes.</a> Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+with+Neurogenin+3+and+Betacellulin+Reverses+Major+Metabolic+Problems+in+Insulin-Deficient+Diabetic+Mice.">Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice.</a> Endocrinology. , (2009).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

HDAdsは、初期世代の広告の弱点を克服するために、遺伝子治療アプリケーション用に活用するために開発されている。しかし、技術的な課題が残っている。たとえば、HDAdはHDAdの包装とベクトルを増幅するためのHVは初期世代の広告ほど効率的ではありませんが必要です。 HVは、第一世代の広告とHV妥協HDAdの有効性の汚染である。したがって、各継代のために非常に効率的なトランスフェクションし、最適な条件が重要である。ベクトルの生産のためのもう一つの重要なパラメータは、直接浮遊細胞用種菌として使用され、その後の通路5に使用されるべきである通路（P1〜P4）です。我々の経験に、最良の結果がHDAdベクトル割合が劇的に次の一節（ 図2のP3）に増加していることで通路を使用することによって得られる。 HDAdベクターの収量は、導入遺伝子カセットに依存します。両方の遺伝子が下にあるので、ベクトル生産時には、両方の導入遺伝子が発現されるユビキタスプロモーター。 Ngn3は、転写因子とBTCは、そのことを表現成長ホルモンは、ベクトルの複製とパッケージングするのに役立ちますしながら細胞系統に影響を与える可能性の転写因子を発現HDAdベクターはベクター増幅を阻害を示唆している成長因子である。 糖尿病が大流行と想定すると、B細胞塊を復元するための新たなアプローチが必要とされている。本報告書では、膵島成長因子と共に膵島系譜定義する転写因子、Ngn3の遺伝子導入を行うためにHDAdベクトルの利点を活用する方法を記述し、ベータセルリンは、肝臓の門脈周囲の地域で膵島新生を誘導した。これの有効性を評価するためには、安定した高血糖を持つマウスを選択し、適切なコントロールが常に含まれていることを確認することが重要です。この遺伝子導入実験では、空のベクター治療糖尿病マウスは常に利用されるべきである。また、糖尿病のマイルは個別に扱わHDAd-Ngn3とHDAd-BTCを使用してceは膵島新生におけるこれら二つの遺伝子の個々の貢献をテストするために提供しています。我々のデータは、単独でNgn3、膵島新生を誘導するのに十分であることを示しているが、成長因子、BTCの添加は膵島新生の強力な誘導につながる応答を増大するのに役立つ。としてこれは、ベクトル表現が実際に標的組織、肝臓で達成され、また、処置されたマウスの血漿中でアッセイインスリンは膵臓の不在を証明することによって、膵臓の残留膵島から来ていないことを実証することをテストすることも重要である糖尿病マウスの膵島。 要約すると、遺伝子導入のためのHDAd - ベクター系の利点は、その高いクローニング能力、効率的な伝達と最小慢性毒性ならびに宿主へのベクターのゲノムの非統合のその性質を持つ肝臓で長期的な遺伝子発現にある染色体。主要な制限は、その世代とに関与する複雑な手順です。生体内のアプリケーションで主に最も人気のある広告の血清型5と肝臓に限られています。膵島新生は完全膵島成長因子、ベータセルリンと共に膵島系譜定義する転写因子、Ngn3の遺伝子導入することにより、肝臓での膵島新生を誘導することによって、糖尿病マウスにおける血漿インスリンと耐糖能を復元するように誘導することができる。本報告では、我々は高品質HDAd-Ngn3とHDAd-BTCを生成するために最適なプロトコルを示しており、高血糖症を逆に糖尿病マウスの肝臓において膵島新生を誘導し、評価するためのテクニックを紹介します。 脚注：ウイルスベクターおよびここで説明された細胞株は、ベクトルの生産コア研究所糖尿病研究センターは、ベイラー医科大学（から入手可能である<a href="http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731" target="_blank">http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731</a> ）。いくつかの市販のキットには、HDAdウイルス（ 例えば Microbix biosyst生成するためにも利用できますEMS社）。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> ProFectionR哺乳類トランスフェクションキット</td><td>プロメガ</td><td> E1200 </td></tr><tr><td> DNeasyブラッド＆ティッシュキット（50） </td><td>キアゲン</td><td> 69504 </td></tr><tr><td>パーフェクSYBR Green Supermixを、ROX </td><td>クアンタサイエンス</td><td> 95055-500 </td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> D6750-25G </td></tr><tr><td> MEM粉末</td><td>インビトロジェン</td><td> 61100087 </td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシン</td><td>シグマ</td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> FBS </td><td>アトランタバイオ</td><td> S11150 </td></tr><tr><td> L-グルタミン酸</td><td>インビトロジェン</td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td>ハイグロマイシンB </td><td>シグマ</td><td> H0654-1G </td></tr><tR&gt; <td> MEM EAGLE JOKLIK </td><td>シグマ</td><td> M0518-10L </td></tr><tr><td> RNアーゼ</td><td>ロッシュ</td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> DNase Iを、グレードII </td><td>ロッシュ</td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td>ストレプトゾシン</td><td>シグマ</td><td> s0130 </td></tr><tr><td>ガラススピナーフラスコ</td><td>コー​​ニング</td><td> 4500-3L </td></tr><tr><td>ガラススピナーフラスコ</td><td>コー​​ニング</td><td> 4500-250 </td></tr><tr><td> -アナライザcassetをスライドさせて</td><td>ピアスCH </td><td> PI66380 </td></tr><tr><td>チューブoptisealポリallomer、11.2ミリリットル</td><td>ベックマン·コールター</td><td> 362181 </td></tr><tr><td>塩化セシウム1キロ</td><td> JT4042-2 </td><td> VWR </td></tr><tr><td>ベックマンLE-80K </td><td>ベックマン·コールター</td><td>最適なLE-80K超遠心</td></tr><tr><td>フィルター</td><td> VWR </td><td> 28143-338 </td></tr><tr><td>管500メートルを遠心リットル</td><td>コー​​ニング</td><td> 431123 </td></tr><tr><td> tailveiner制止</td><td>ブレーントリーの科学的、INC </td><td> TV-150 </td></tr><tr><td>インスリン、マウスELISA </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td></tr><tr><td> microvette CB300 </td><td>ザルスタット</td><td> 16.443.100 </td></tr><tr><td> D-グルコース</td><td>シグマ</td><td> G8270 </td></tr><tr><td>マウスC-ペプチドELISAキット</td><td>和光純薬工業株式会社</td><td> ＃631から07231 </td></tr><tr><td>モルモット抗インスリン抗体</td><td>アブカム</td><td> ab7842 </td></tr><tr><td>ヤギ抗PDX1抗体</td><td>博士クリストファー·ライトからの贈り物</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗Ngn3抗体</td><td>ベータ細胞生物学コンソーシアム、 東大。ペンシルベニア州の</td><td> AB2013 </td></tr><tr><td>マウス抗Nkx6.1抗体</td><td>ベータ細胞生物学コンソーシアム、 東大。 Pennsyのlvania </td><td> F64A6B4 </td></tr><tr><td>抗ベータセルリン抗体</td><td>セルサイエンス</td><td> PAAQ1 </td></tr><tr><td> ALT（SGPT）色試薬セット。 </td><td>テコ診断</td><td> A526 - 120 </td></tr><tr><td> AST /（SGOT）、カラーエンド試薬セット</td><td>テコ診断</td><td> A561-120 </td></tr></tbody></table> 表2に特異的な試薬および器具。

neo-islet formation in liver of diabetic mice by helper-dependent adenoviral vector-mediated gene transfer

1型糖尿病は、膵臓のインスリン産生細胞のT細胞媒介性自己免疫破壊によって引き起こされます。膵島移植は、ドナーの可用性ごとおよび長期免疫抑制の必要性により制限されているので、今までインスリン補充は、依然として主要な治療法です。 Neuogenin3の遺伝子導入（Ngn3）によって誘導される膵島新生、膵島系譜定義する特定の転写因子とは、ベータセルリン（BTC）、膵島の成長因子は、1型糖尿病を治すために可能性を秘めています。 アデノウイルスベクター（広告）は、高効率遺伝子導入ベクターであるが、初期世代の広告は 、in vivoで使用中のため、いくつかの欠点を持っています。ヘルパー依存型広告（HDAds）は、広告の初期世代の安全性プロファイルを向上させ、導入遺伝子の発現1を延長するために開発された最も先進的な広告です。彼らはウイルスコード配列2-5を欠いているとだけ広告シス elを保持するので、彼らは慢性毒性を欠いているベクター複製とパッケージングに必要なements。これは、36キロバイトの遺伝子までのクローニングを可能にします。 このプロトコルでは、HDAd-Ngn3とHDAd-BTC生成するとSTZ誘発糖尿病マウスにこれらのベクターを提供する方法について説明します。我々の結果は、それがHDAd-Ngn3の同時注射と肝臓でHDAd-BTC誘発 &#39;ネオ小島&#39;示し、糖尿病マウスの高血糖を反転させます。

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Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

我々は、ヘルパー依存性アデノウイルスベクター（HDAd）と高血糖の反転を用いた遺伝子Neurogenin3の転送（Ngn3）とベータセルリン（BTC）によりSTZにおける肝ネオ膵島形成（ストレプトゾトシン）誘発糖尿病マウスを記述します。我々の方法は、生体内伝達および長続きが遺伝子発現におけるそれらの高効率を持つヘルパー依存型アデノウイルスベクターの機能を活用できます。

ヘルパー依存型アデノウイルスベクターによる遺伝子導入による糖尿病マウスの肝臓におけるネオ·膵島形成

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Use of a Hanging-weight System for Liver Ischemia in Mice

マウスの肝臓虚血のためにハンギング軽量システムの利用

Acute liver injury due to ischemia can occur during several clinical procedures e.g. liver transplantation, hepatic tumor resection or trauma repair and ...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

免疫不全マウスにおけるヒト網膜芽細胞腫の腫瘍の確立と伝播

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

前臨床モデルにおける虚血性心不全のための遺伝子導入

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine ...

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

[を使用した非肥満糖尿病マウスにおける胃排出能の評価<sup&gt; 13</sup&gt; C] - オクタン酸呼気テスト

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used ...

Vascular Gene Transfer from Metallic Stent Surfaces Using Adenoviral Vectors Tethered through Hydrolysable Cross-linkers

加水分解性架橋剤を介してアデノウイルスベクターテザーを使用した金属ステント表面からの血管の遺伝子導入

In-stent restenosis presents a major complication of stent-based revascularization procedures widely used to re-establish blood flow through critically ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

マウスにおける胆管結紮：閉塞性胆汁うっ滞による炎症性肝障害と線維症の誘発

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

Subnormothermicマシン灌流によって機能的なヒト肝臓保全と回復

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

生体内でウサギの一般的な頚動脈内皮細胞への遺伝子導入

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice

糖尿病マウスの慢性創傷を作成するためのプロトコル

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ...

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

豚に自家移植用肝細胞Ex Vivoのレンチ ウイルス媒介性遺伝子治療

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...