Name: neo-islet formation in liver of diabetic mice by helper-dependent adenoviral vector-mediated gene transfer
Uploaded: 2012-10-10T13:00:00
Duration: 16 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra NIH: R03 DK089061-01 (VKY), NIH: K08 DK068391 (VKY), den Diabetes og Endokrinologi Research Center-(DERC - P30DK079638) ved Baylor College of Medicine, en pilot og Feasibility stipend fra den DERC (VKY); Juvenile Diabetes Research Foundation: JDRF Award # 5-2006-134 (VKY).

<ol>
	<li>Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+helper-dependent+adenovirus+vector+system:+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal.">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).</li><li>Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+correction+of+genetic+deficiency+in+mice+with+a+single+injection+of+helper-dependent+adenoviral+vector.">Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).</li><li>Belalcazar, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+expression+of+human+apolipoprotein+A-I+mediated+by+helper-dependent+adenovirus+gene+transfer+inhibits+atherosclerosis+progression+and+remodels+atherosclerotic+plaques+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Circulation. 107, 2726-2732 (2003).</li><li>Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+correction+of+low-density+lipoprotein+receptor-deficient+mice+with+a+helper-dependent+adenoviral+vector+expressing+the+very+low-density+lipoprotein+receptor.">Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor.</a> Circulation. 103, 1274-1281 (2001).</li><li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+receptor+gene+therapy+using+helper-dependent+adenovirus+produces+long-term+protection+against+atherosclerosis+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).</li><li>Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-efficiency+Cre/loxP-based+system+for+construction+of+adenoviral+vectors.">A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).</li><li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production.">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).</li><li>Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-Dependent+Adenoviral+Vectors.">Helper-Dependent Adenoviral Vectors.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin3+is+sufficient+for+transdetermination+of+hepatic+progenitor+cells+into+neo-islets+in+vivo+but+not+transdifferentiation+of+hepatocytes.">Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes.</a> Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+with+Neurogenin+3+and+Betacellulin+Reverses+Major+Metabolic+Problems+in+Insulin-Deficient+Diabetic+Mice.">Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice.</a> Endocrinology. , (2009).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

HDAds har blitt utviklet for å overvinne svakhetene ved tidlig generasjon annonser og å utnytte for genterapi søknad. Men tekniske utfordringer gjenstår. For eksempel krever HDAd HV for HDAd emballasje og vektor forsterkning er ikke så effektiv som tidlig generasjon annonser. HV er en første generasjons Ad og eventuell forurensning av HV kompromiss effektiviteten av HDAd. Derfor, svært effektiv transfeksjon og optimale betingelser for hver seriell passasje er kritiske. En annen kritisk parameter for vektor produksjon er hvilken passasje (P1-P4) skal brukes til etterfølgende passasje 5 som er direkte brukt som inokulum for suspensjon celler. Vår erfaring er de beste resultatene oppnås ved å bruke passasjen der HDAd vektor andelen øker dramatisk i følgende passasje (P3 i figur 2). Utbyttet av HDAd vektorer avhenger transgene kassetter. Under vektor produksjon, er begge transgener uttrykkes fordi både gener er underallestedsnærværende promoter. Ngn3 er en transkripsjonsfaktor og BTC er en vekstfaktor som tyder på at HDAd vektor uttrykker transkripsjonsfaktor som kan påvirke celle avstamning hemmer vektor forsterkning mens det uttrykker veksthormon hjelper i vektor replikering og emballasje. Med diabetes forutsatt epidemiske proporsjoner, nye tilnærminger for å gjenopprette b-cellemasse nødvendig. I denne rapporten beskriver vi metoder for å utnytte fordelene ved HDAd vektorer å foreta genoverføring av holme avstamning-definerende transkripsjonsfaktor, Ngn3 sammen med holmen vekstfaktor, til betacellulin indusere holme neogenesis i periportal regioner av leveren. Å vurdere effekten av dette, er det viktig å velge mus med stabil hyperglykemi og sørge for at nødvendige kontroller er alltid inkludert. For dette genoverføring eksperimenter, behandlet den tomme vektoren diabetiske mus bør alltid benyttes. I tillegg bruker HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC individuelt behandlet diabetiker mice tjener til å teste den enkeltes bidrag i disse to genene i holme neogenesis. Som våre data demonstrerer at Ngn3 alene er tilstrekkelig til å indusere holme neogenesis, men tillegg av vekstfaktor, BTC, tjener til å forsterke responsen fører til robuste induksjon av holme neogenesis. Det er også viktig å teste at vektoren uttrykket faktisk oppnådd i målvevet, leveren og også å vise at insulin analysert i plasma av behandlede mus ikke kommer fra gjenværende holmer i bukspyttkjertelen, ved å demonstrere fravær av bukspyttkjertelen holmer i diabetiske mus. Oppsummert ligger fordelen av HDAd-vektor system for genoverføring i sitt høye kloning kapasitet, effektiv transduksjon og langvarig genekspresjon i leveren med minimum kronisk toksisitet samt sin natur ikke-integrasjon av vektor genom i verten kromosom. Den primære begrensningene er de kompliserte trinn involvert i sin generasjon og densin vivo søknaden primært begrenset til leveren med de mest populære Ad serotype 5. Holme neogenesis kan bli overtalt til fullt gjenopprette plasma insulin og glukose toleranse i diabetiske mus ved å fremkalle holme neogenesis i leveren ved genoverføring av holme avstamning-definerende transkripsjonsfaktor, Ngn3 sammen med holmen vekstfaktor, betacellulin. I denne rapporten viser vi den optimale protokollen til å generere høy kvalitet HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC, og demonstrere teknikker for å indusere og vurdere holme neogenesis i leveren hos diabetikere mus å reversere hyperglykemi. Fotnote: De virale vektorer og cellelinjer som er beskrevet her, er tilgjengelige fra Vector Produksjon Kjerne Laboratory, Diabetes Research Center, Baylor College of Medicine ( <a href="http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731" target="_blank">http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731</a> ). Noen kommersielle kits er også tilgjengelig for å generere HDAd virus (f.eks Microbix biosystems Inc.).

<table border="1"><tbody><tr><td> Navnet på reagensen </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> ProFectionR Mammalian Transfeksjon kit </td><td> Promega </td><td> E1200 </td></tr><tr><td> DNeasy Blood &amp; Tissue Kit (50) </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> Perfecta SYBR Grønn SuperMix, ROX </td><td> Quanta Biosciences </td><td> 95055-500 </td></tr><tr><td> Natriumdeoksykolat </td><td> Sigma </td><td> D6750-25G </td></tr><tr><td> MEM pulver </td><td> Invitrogen </td><td> 61100087 </td></tr><tr><td> Penicillin Streptomycin </td><td> Sigma </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Sigma </td><td> H0654-1G </td></tr><tr&gt; <td> MEM EAGLE JOKLIK </td><td> Sigma </td><td> M0518-10L </td></tr><tr><td> RNase </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> DNase I, klasse II </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Streptozocin </td><td> Sigma </td><td> s0130 </td></tr><tr><td> Glass spinner kolber </td><td> Corning </td><td> 4500-3L </td></tr><tr><td> Glass spinner kolber </td><td> Corning </td><td> 4500-250 </td></tr><tr><td> Skyv A-lyzer Casset </td><td> PIERCE CH </td><td> PI66380 </td></tr><tr><td> Tube optiseal poly allomer, 11,2 ml </td><td> Beckman Coulter </td><td> 362181 </td></tr><tr><td> Cesiumklorid 1 kg </td><td> JT4042-2 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman LE-80K </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optimal LE-80K Ultrasentrifuger </td></tr><tr><td> Filtrere </td><td> VWR </td><td> 28143-338 </td></tr><tr><td> sentrifugerør 500 ml </td><td> Corning </td><td> 431123 </td></tr><tr><td> tailveiner restrainer </td><td> Braintree vitenskapelig, INC </td><td> tv-150 </td></tr><tr><td> Insulin, mus ELISA </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td></tr><tr><td> microvette CB300 </td><td> Sarstedt </td><td> 16.443.100 </td></tr><tr><td> D-glukose </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td></tr><tr><td> Mus C-peptid ELISA Kit </td><td> Wako Pure Chemical Industries, Ltd </td><td> # 631-07231 </td></tr><tr><td> marsvin anti-insulin antistoff </td><td> Abcam </td><td> ab7842 </td></tr><tr><td> geit-anti-Pdx1 antistoff </td><td> gave fra Dr. Christopher Wright </td><td></td></tr><tr><td> mus anti Ngn3 antistoff </td><td> Beta Cell Biology Consortium, Univ. of Pennsylvania </td><td> AB2013 </td></tr><tr><td> mus anti Nkx6.1 antistoff </td><td> Beta Cell Biology Consortium, Univ. av Pennsylvania </td><td> F64A6B4 </td></tr><tr><td> anti-betacellulin antistoff </td><td> Cell Sciences </td><td> PAAQ1 </td></tr><tr><td> ALT (SGPT) Color Reagent SET. </td><td> Teco Diagnostics </td><td> A526 - 120 </td></tr><tr><td> AST / (SGOT), Color Endpoint Reagent Set </td><td> Teco Diagnostics </td><td> A561-120 </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Spesifikke reagenser og utstyr.

neo-islet formation in liver of diabetic mice by helper-dependent adenoviral vector-mediated gene transfer

Type 1 diabetes er forårsaket av T-celle-mediert autoimmun ødeleggelse av insulin-produserende celler i bukspyttkjertelen. Inntil nå insulin erstatning er fortsatt den store terapi, fordi holme transplantasjon har vært begrenset av donor tilgjengelighet og av behovet for langsiktig immunsuppresjon. Indusert holme neogenesis ved genoverføring av Neuogenin3 (Ngn3), holmen avstamning-definerende spesifikk transkripsjonsfaktor og Betacellulin (BTC), har en holme vekstfaktor potensial til å kurere type 1 diabetes. Adenovirale vektorer (ADS) er svært effektiv genoverføring vektor, men tidlig generasjon Ads har flere ulemper for in vivo bruk. Helper-avhengige Annonser (HDAds) er de mest avanserte Annonser som ble utviklet for å forbedre sikkerheten profilen tidlig generasjon av annonser og å forlenge transgene uttrykk en. De mangler kronisk toksisitet fordi de mangler viral kodende sekvenser 2-5 og beholde bare Ad cis elements nødvendige for vektor replikering og emballasje. Dette tillater kloning av opptil 36 kb gener. I denne protokollen beskriver vi metoden for å generere HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC og å levere disse vektorer i STZ-induserte diabetiske mus. Våre resultater viser at co-injeksjon av HDAd-Ngn3 og HDAd-BTC induserer &#39;neo holmer &quot;i leveren og reverserer hyperglykemi hos diabetikere mus.

Watch this Scientific Journal Video about Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer at JoVE.com

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Vi beskriver nedsatt neo-holme formasjonen i STZ (streptozotocin)-indusert diabetiske mus ved genoverføring av Neurogenin3 (Ngn3) og Betacellulin (BTC) med helper-avhengig adenovirusvektor (HDAd) og reversering av hyperglykemi. Vår metode tar fordeler av helper-avhengige adenovirale vektorer med sin svært effektiv in vivo transduksjon og langvarig genuttrykk.

Neo-Islet Dannelse i leverskader av diabetiske mus med Helper-avhengig adenovirusvektor-mediert genoverføring

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Use of a Hanging-weight System for Liver Ischemia in Mice

Bruk av en hengende vekt System for Liver ischemia i Mus

Acute liver injury due to ischemia can occur during several clinical procedures e.g. liver transplantation, hepatic tumor resection or trauma repair and ...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine ...

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Vurderingen av magetømmingen i ikke-overvektige diabetikere mus Bruke en [<sup&gt; 13</sup&gt; C]-oktansyre Breath Test

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used ...

Vascular Gene Transfer from Metallic Stent Surfaces Using Adenoviral Vectors Tethered through Hydrolysable Cross-linkers

Vaskulær genoverføring fra Metallic Stent overflater Bruke adenovirus Vectors Tethered gjennom hydrolyseprossess Kryssbindings

In-stent restenosis presents a major complication of stent-based revascularization procedures widely used to re-establish blood flow through critically ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Gallegang Ligation i Mus: Induksjon av inflammatorisk Leverskade og fibrose av obstruktiv Kolestase

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

Funksjonell Menneskelig Liver Bevaring og gjenoppretting ved hjelp av Subnormothermic Machine Perfusjons

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

I Vivo Genoverføring til kaninen felles arteria carotis endotelet

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice

Protokoll for å skape kroniske sår i diabetiker mus

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ...

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral Vector-mediert genterapi av hepatocytter Ex Vivo for autolog transplantasjon i svin

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...