Name: neo-islet formation in liver of diabetic mice by helper-dependent adenoviral vector-mediated gene transfer
Uploaded: 2012-10-10T13:00:00
Duration: 16 min 59 s
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Este trabalho foi suportado por concessões do NIH: R03 DK089061-01 (VKY); NIH: K08 DK068391 (VKY), o Diabetes e Endocrinologia Centro de Pesquisa (DERC - P30DK079638) no Baylor College of Medicine, uma bolsa de piloto e de viabilidade de do DERC (VKY); Juvenile Diabetes Research Foundation: JDRF Prêmio # 5-2006-134 (VKY).

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	<li>Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+helper-dependent+adenovirus+vector+system:+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal.">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).</li><li>Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+correction+of+genetic+deficiency+in+mice+with+a+single+injection+of+helper-dependent+adenoviral+vector.">Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).</li><li>Belalcazar, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+expression+of+human+apolipoprotein+A-I+mediated+by+helper-dependent+adenovirus+gene+transfer+inhibits+atherosclerosis+progression+and+remodels+atherosclerotic+plaques+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Circulation. 107, 2726-2732 (2003).</li><li>Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+correction+of+low-density+lipoprotein+receptor-deficient+mice+with+a+helper-dependent+adenoviral+vector+expressing+the+very+low-density+lipoprotein+receptor.">Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor.</a> Circulation. 103, 1274-1281 (2001).</li><li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+receptor+gene+therapy+using+helper-dependent+adenovirus+produces+long-term+protection+against+atherosclerosis+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).</li><li>Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-efficiency+Cre/loxP-based+system+for+construction+of+adenoviral+vectors.">A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).</li><li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production.">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).</li><li>Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-Dependent+Adenoviral+Vectors.">Helper-Dependent Adenoviral Vectors.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin3+is+sufficient+for+transdetermination+of+hepatic+progenitor+cells+into+neo-islets+in+vivo+but+not+transdifferentiation+of+hepatocytes.">Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes.</a> Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+with+Neurogenin+3+and+Betacellulin+Reverses+Major+Metabolic+Problems+in+Insulin-Deficient+Diabetic+Mice.">Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice.</a> Endocrinology. , (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

HDAds têm sido desenvolvidas para ultrapassar a fraqueza de anúncios geração inicial e para aproveitar para aplicação de terapia génica. No entanto, os desafios técnicos permanecem. Por exemplo, requer HDAD HV para embalagens HDAD e amplificação vector não é tão eficiente como os anúncios geração antecipada. HV é um anúncio de primeira geração e de qualquer contaminação de compromisso da eficácia da HV HDAD. Portanto, transfecção altamente eficiente e as condições ideais para cada passagem de série são críticos. Um outro parâmetro crítico para a produção de vector é que a passagem (P1-P4) deve ser utilizada para a passagem subsequente de 5, que é directamente utilizado como inoculo para as células em suspensão. Para a experiência, os melhores resultados são obtidos utilizando a passagem pela qual HDAD proporção vector é dramaticamente aumentada na seguinte passagem (P3 na Figura 2). O rendimento de vectores HDAD depende cassetes transgene. Durante a produção de vector, ambos os transgenes são expressos porque ambos os genes estão sobpromotor onipresente. Ngn3 é um factor de transcrição e BTC é um factor de crescimento, o que sugere que o factor de transcrição HDAD vector expressando o que pode influenciar a linhagem de células inibe a amplificação vector, enquanto que a hormona do crescimento expressando ajuda na replicação do vector e embalagem. Com diabetes assumindo proporções epidêmicas, novas abordagens para restaurar b célula de massa são necessários. Neste relatório, nós descrevemos métodos para aproveitar as vantagens de vetores HDAD para efetuar a transferência de genes de ilhota linhagem definir fator de transcrição, Ngn3 juntamente com o fator de crescimento ilhota, betacelulina para induzir neogênese ilhota em regiões periportal do fígado. Para avaliar a eficácia do presente, é importante escolher os ratos com hiperglicemia estável e assegurar que os controlos apropriados são sempre incluídas. Para estas experiências de transferência de genes, o vector vazio trataram ratos diabéticos deve sempre ser utilizado. Além disso, utilizando-HDAD Ngn3 e HDAD-Btc tratadas individualmente diabética mice serve para testar a contribuição desses dois genes em ilhota neogênese. Como os nossos dados demonstram que Ngn3 por si só é suficiente para induzir a ilhota neogénese, mas a adição do factor de crescimento, BTC, serve para aumentar a resposta levando à indução de ilhota neogénese robusto. Também é importante para testar se o vector de expressão é de facto conseguida no tecido alvo, o fígado e também para demonstrar que a insulina testados no plasma de ratinhos tratados não é proveniente de ilhotas residuais no pâncreas, demonstrando a ausência de pâncreas ilhotas nos ratos diabéticos. Em resumo, a vantagem de o sistema HDAD vector para a transferência de gene é a sua capacidade de clonagem elevada, a transdução eficiente e da expressão do gene de longa duração no fígado com toxicidade crónica mínimo, assim como a sua natureza de não integração do genoma do vector no hospedeiro cromossomo. As limitações principais são os passos complexos envolvidos na sua produção e do seuaplicação in vivo é essencialmente limitada ao fígado, sendo o mais popular Ad serotipo 5. Islet neogénese podem ser induzidas a restaurar completamente a insulina no plasma e de tolerância à glucose em ratos diabéticos através da indução de neogénese ilhota no fígado, por transferência de genes de factor de transcrição ilhota linhagem definidora, Ngn3 juntamente com o factor de crescimento das ilhotas, betacelulina. Neste relatório, nós apresentamos o protocolo ideal para gerar alta qualidade HDAD-Ngn3 e HDAD-BTC, e demonstrar técnicas para induzir e avaliar neogênese ilhota nos fígados dos camundongos diabéticos para reverter a hiperglicemia. Nota de rodapé: Os vectores virais e as linhas de células descritas aqui estão disponíveis a partir do núcleo Vector Laboratory Produção, Diabetes Research Center, Baylor College of Medicine ( <a href="http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731" target="_blank">http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731</a> ). Alguns kits comerciais também estão disponíveis para a geração de vírus (por exemplo, HDAD Microbix biosystems Inc.).

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> ProFectionR kit Transfecção mamíferos </td><td> Promega </td><td> E1200 </td></tr><tr><td> Kit Blood &amp; Tissue Dneasy (50) </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> Perfecta SYBR Green Supermix, ROX </td><td> Quanta Biociências </td><td> 95055-500 </td></tr><tr><td> Deoxicolato de sódio </td><td> Sigma </td><td> D6750-25G </td></tr><tr><td> MEM em pó </td><td> Invitrogen </td><td> 61100087 </td></tr><tr><td> Estreptomicina penicilina </td><td> Sigma </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Higromicina B </td><td> Sigma </td><td> H0654-1G </td></tr><tr&gt; <td> MEM ÁGUIA Joklik </td><td> Sigma </td><td> M0518-10L </td></tr><tr><td> Rnase </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> DNase I, grau II </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Estreptozocina </td><td> Sigma </td><td> s0130 </td></tr><tr><td> Vidro giratório frascos </td><td> Corning </td><td> 4500-3L </td></tr><tr><td> Vidro giratório frascos </td><td> Corning </td><td> 4500-250 </td></tr><tr><td> Deslize A-lyzer Casset </td><td> PIERCE CH </td><td> PI66380 </td></tr><tr><td> Tubo optiseal poli allomer, 11,2 ml </td><td> Beckman Coulter </td><td> 362181 </td></tr><tr><td> Cloreto de césio 1 kg </td><td> JT4042-2 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman LE-80K </td><td> Beckman Coulter </td><td> Ultracentrífuga LE-80K ideal </td></tr><tr><td> Filtrar </td><td> VWR </td><td> 28143-338 </td></tr><tr><td> centrifugar m tubo de 500l </td><td> Corning </td><td> 431123 </td></tr><tr><td> tailveiner limitador </td><td> Braintree científica, INC </td><td> tv-150 </td></tr><tr><td> A insulina, Rato ELISA </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td></tr><tr><td> microvette CB300 </td><td> Sarstedt </td><td> 16.443.100 </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td></tr><tr><td> Rato peptídeo C ELISA Kit </td><td> Wako Pure Chemical Industries, Ltd </td><td> # 631-07231 </td></tr><tr><td> cobaia anticorpo anti-insulina </td><td> Abcam </td><td> ab7842 </td></tr><tr><td> anticorpo de cabra anti-Pdx1 </td><td> presente do Dr. Christopher Wright </td><td></td></tr><tr><td> rato anti Ngn3 anticorpo </td><td> Consórcio de Biologia das células beta, Univ. da Pensilvânia </td><td> AB2013 </td></tr><tr><td> rato anti Nkx6.1 anticorpo </td><td> Consórcio de Biologia das células beta, Univ. de Pennsylvania </td><td> F64A6B4 </td></tr><tr><td> anticorpo anti-betacelulina </td><td> Cell Sciences </td><td> PAAQ1 </td></tr><tr><td> ALT (TGP) SET Reagente de Cor. </td><td> Teco Diagnóstico </td><td> A526 - 120 </td></tr><tr><td> AST / (TGO), Cor conjunto de reagentes Endpoint </td><td> Teco Diagnóstico </td><td> A561-120 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Reagentes e equipamentos específicos.

neo-islet formation in liver of diabetic mice by helper-dependent adenoviral vector-mediated gene transfer

A diabetes tipo 1 é causada pela destruição mediada por células T auto-imune das células produtoras de insulina no pâncreas. Até agora, a reposição de insulina é ainda a terapêutica maior, porque transplante de ilhotas foi limitada pela disponibilidade de dadores e pela necessidade de imunossupressão a longo prazo. Induzida por ilhota neogénese por transferência de genes de Neuogenin3 (Ngn3), a linhagem de ilhotas de definição factor de transcrição específico e betacelulina (BTC), um factor de crescimento de ilhotas tem o potencial de curar a diabetes do tipo 1. Vectores adenovirais (Ads) são vectores de transferência de genes altamente eficiente, no entanto, os anúncios geração iniciais têm várias desvantagens para a utilização in vivo. Ajudante de dependentes de Anúncios (HDAds) são os anúncios mais avançadas que foram desenvolvidos para melhorar o perfil de segurança da primeira geração de anúncios e para prolongar transgene expressão 1. Eles não têm a toxicidade crônica porque faltam seqüências virais codificação 2-5 e manter somente o anúncio cis elements necessárias para a replicação do vector e embalagem. Isto permite a clonagem de genes de até 36 kb. Neste protocolo, descrevemos o método para gerar HDAD-Ngn3 e HDAD-BTC e entregar esses vetores em ratos STZ-induzidos diabéticos. Os nossos resultados mostram que a co-injecção de HDAD-Ngn3 e &quot;ilhéus&quot; neo-HDAD Btc induz no fígado e inverte a hiperglicemia em ratos diabéticos.

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Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Nós descrevemos a formação de neo-hepática ilhota em STZ (estreptozotocina) induzida ratos diabéticos por transferência de genes de Neurogenin3 (Ngn3) e betacelulina (BTC), utilizando ajudante dependente do vector adenoviral (HDAD) e reversão da hiperglicemia. O nosso método tem vantagens do ajudante dependente de vectores adenovirais com a sua grande eficácia na transdução in vivo e a expressão do gene de longa duração.

Neo-Islet Formação em fígado de ratos diabéticos por Helper dependente de Transferência de Gene adenoviral Vector Mediada

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Use of a Hanging-weight System for Liver Ischemia in Mice

A utilização de uma suspensão do sistema de peso para isquemia hepática em ratos

Acute liver injury due to ischemia can occur during several clinical procedures e.g. liver transplantation, hepatic tumor resection or trauma repair and ...

Medicina

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Estabelecimento e propagação de Tumores Humanos em Retinoblastoma Imune camundongos deficientes

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

Transferência de genes para insuficiência cardíaca isquêmica em um modelo pré-clínica

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine ...

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Estudo do esvaziamento gástrico em ratos diabéticos não obesos utilizando a [<sup&gt; 13</sup&gt; C]-octanóico teste de respiração Ácido

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used ...

Vascular Gene Transfer from Metallic Stent Surfaces Using Adenoviral Vectors Tethered through Hydrolysable Cross-linkers

Vascular transferência de genes de Metallic Stent superfícies usando Adenoviral Vetores Tethered através hidrolisável reticulantes

In-stent restenosis presents a major complication of stent-based revascularization procedures widely used to re-establish blood flow through critically ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Ligadura do ducto biliar em ratos: Indução de Inflammatory Lesão hepática e fibrose por colestase obstrutiva

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

Fígado Preservação Human Funcional e cobrança através de Subnormothermic Máquina de Perfusão

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

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Na Vivo Transferência de genes para o endotélio da artéria carótida comum de coelho

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice

Protocolo para criar feridas crônicas em camundongos diabéticos

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ...

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

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Particulas de Lentivirus terapia gênica mediada por vetor de hepatócitos Ex Vivo para transplante autólogo em suínos

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...