Name: neo-islet formation in liver of diabetic mice by helper-dependent adenoviral vector-mediated gene transfer
Uploaded: 2012-10-10T13:00:00
Duration: 16 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por becas de los NIH R03: DK089061-01 (VKY); NIH: K08 DK068391 (VKY); Diabetes y Endocrinología del Centro de Investigación-(DERC - P30DK079638) en el Baylor College of Medicine, una subvención Pilot y viabilidad de el DERC (VKY), Juvenile Diabetes Research Foundation: Premio JDRF # 5-2006-134 (VKY).

<ol>
	<li>Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+helper-dependent+adenovirus+vector+system:+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal.">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).</li><li>Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+correction+of+genetic+deficiency+in+mice+with+a+single+injection+of+helper-dependent+adenoviral+vector.">Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).</li><li>Belalcazar, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+expression+of+human+apolipoprotein+A-I+mediated+by+helper-dependent+adenovirus+gene+transfer+inhibits+atherosclerosis+progression+and+remodels+atherosclerotic+plaques+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Circulation. 107, 2726-2732 (2003).</li><li>Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+correction+of+low-density+lipoprotein+receptor-deficient+mice+with+a+helper-dependent+adenoviral+vector+expressing+the+very+low-density+lipoprotein+receptor.">Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor.</a> Circulation. 103, 1274-1281 (2001).</li><li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+receptor+gene+therapy+using+helper-dependent+adenovirus+produces+long-term+protection+against+atherosclerosis+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).</li><li>Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-efficiency+Cre/loxP-based+system+for+construction+of+adenoviral+vectors.">A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).</li><li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production.">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).</li><li>Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-Dependent+Adenoviral+Vectors.">Helper-Dependent Adenoviral Vectors.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin3+is+sufficient+for+transdetermination+of+hepatic+progenitor+cells+into+neo-islets+in+vivo+but+not+transdifferentiation+of+hepatocytes.">Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes.</a> Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+with+Neurogenin+3+and+Betacellulin+Reverses+Major+Metabolic+Problems+in+Insulin-Deficient+Diabetic+Mice.">Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice.</a> Endocrinology. , (2009).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

HDAds se han desarrollado para superar la debilidad de Anuncios de primera generación y de aprovechar para la aplicación de la terapia génica. Sin embargo, los desafíos técnicos permanecen. Por ejemplo, HDAD requiere HV para el envasado HDAD y amplificación vector no es tan eficiente como anuncios de primera generación. HV es una oferta de primera generación y la contaminación de compromiso HV la eficacia de la Hdad. Por lo tanto, la transfección altamente eficiente y las condiciones óptimas para cada paso en serie son críticos. Otro parámetro crítico para la producción del vector es la que el paso (P1-P4) se debe utilizar para el posterior paso 5 que se utiliza directamente como inóculo para células en suspensión. En nuestra experiencia, los mejores resultados se obtienen usando el pasaje por el cual se dramáticamente proporción HDAD vector aumentado en el paso siguiente (P3 en la figura 2). El rendimiento de los vectores HDAD depende de casetes de transgén. Durante la producción de vectores, ambos transgenes se expresan debido a que ambos genes se encuentran bajopromotor ubicuo. Ngn3 es un factor de transcripción y BTC es un factor de crecimiento, lo que sugiere que el vector que expresa HDAD factor de transcripción que pueden influir en el linaje celular inhibe la amplificación de vector mientras que la hormona del crecimiento ayuda a expresar en la replicación del vector y envasado. Con la diabetes adquiriendo proporciones epidémicas, nuevos enfoques para restaurar b masa de células se necesitan. En este informe, se describen los métodos para aprovechar las ventajas de los vectores HDAD para efectuar la transferencia de genes de islote linaje de definición de factor de transcripción, Ngn3 junto con el factor de crecimiento de los islotes, betacelulina para inducir la neogénesis de islotes en regiones periportal del hígado. Para evaluar la eficacia de esto, es importante elegir ratones con hiperglucemia estable y los controles adecuados se incluyen siempre. Para estos experimentos de transferencia de genes, el vector vacío ratones diabéticos tratados siempre debe ser utilizado. Además, el uso Hdad-Ngn3 y Hdad BTC-diabética tratada individualmente millasce sirve para probar la contribución individual de estos dos genes en la neogénesis de islotes. Como nuestros datos demuestran que Ngn3 por sí solo es suficiente para inducir la neogénesis de islotes, pero la adición del factor de crecimiento, BTC, sirve para aumentar la respuesta que conduce a la inducción robusto de neogénesis de islotes. También es importante comprobar que el vector de expresión se había alcanzado de hecho en el tejido diana, el hígado y también para demostrar que la insulina se ensaya en el plasma de los ratones tratados no viene de islotes residuales en el páncreas, por lo que demuestra la ausencia de páncreas islotes en los ratones diabéticos. En resumen, la ventaja del sistema HDAD-vector para la transferencia de genes reside en su capacidad de clonaje elevada, transducción eficiente y la expresión a largo gen duradera en el hígado con la mínima toxicidad crónica, así como su naturaleza de no integración del genoma del vector en el huésped cromosoma. Las limitaciones principales son los pasos complejos que intervienen en su generación y suaplicación in vivo está limitada principalmente al hígado con el serotipo Ad más popular 5. Islet neogénesis puede ser inducido para restaurar completamente la insulina en plasma y la tolerancia a la glucosa en ratones diabéticos mediante la inducción de la neogénesis de islotes en el hígado por la transferencia de genes de factor de transcripción Islet linaje que define, junto con Ngn3 el factor de crecimiento de los islotes, betacelulina. En este informe, se muestra el protocolo óptimo para generar calidad-Hdad Ngn3 y Hdad BTC-, y demostrar las técnicas para inducir y evaluar la neogénesis islote en el hígado de ratones diabéticos a reducir la hiperglucemia. Nota: Los vectores virales y las líneas celulares descritas aquí están disponibles en el Laboratorio de Producción Vector Core, Diabetes Research Center, Baylor College of Medicine ( <a href="http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731" target="_blank">http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731</a> ). Algunos kits comerciales están también disponibles para la generación de virus HDAD (por ejemplo, Microbix biosystems Inc.).

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> ProFectionR kit de transfección de mamíferos </td><td> Promega </td><td> E1200 </td></tr><tr><td> Kit DNeasy Sangre y Tejidos (50) </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> Perfecta SYBR Green Supermix, ROX </td><td> Quanta Biosciences </td><td> 95055-500 </td></tr><tr><td> Desoxicolato de sodio </td><td> Sigma </td><td> D6750-25G </td></tr><tr><td> MEM polvo </td><td> Invitrogen </td><td> 61100087 </td></tr><tr><td> La penicilina estreptomicina </td><td> Sigma </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlanta Biológicos </td><td> S11150 </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Higromicina B </td><td> Sigma </td><td> H0654-1G </td></tr><tr&gt; <td> EAGLE MEM Joklik </td><td> Sigma </td><td> M0518-10L </td></tr><tr><td> Rnase </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> DNasa I, grado II </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Estreptozocina </td><td> Sigma </td><td> s0130 </td></tr><tr><td> Vidrio frascos spinner </td><td> Corning </td><td> 4500-3L </td></tr><tr><td> Vidrio frascos spinner </td><td> Corning </td><td> 4500-250 </td></tr><tr><td> Deslice Lyzer A-casset </td><td> PIERCE CH </td><td> PI66380 </td></tr><tr><td> Tube Optiseal poli allomer, 11,2 ml </td><td> Beckman Coulter </td><td> 362181 </td></tr><tr><td> 1 kg de cloruro de cesio </td><td> JT4042-2 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman LE-80K </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optimal LE-80K ultracentrífuga </td></tr><tr><td> Filtrar </td><td> VWR </td><td> 28143-338 </td></tr><tr><td> tubo de centrífuga de 500 ml </td><td> Corning </td><td> 431123 </td></tr><tr><td> tailveiner restrainer </td><td> Braintree Scientific, Inc </td><td> tv-150 </td></tr><tr><td> La insulina, Mouse ELISA </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td></tr><tr><td> microvette CB300 </td><td> Sarstedt </td><td> 16.443.100 </td></tr><tr><td> D-glucosa </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td></tr><tr><td> Ratón C-péptido ELISA Kit </td><td> Wako Pure Chemical Industries, Ltd </td><td> # 631-07231 </td></tr><tr><td> guinea pig anticuerpo anti-insulina </td><td> Abcam </td><td> ab7842 </td></tr><tr><td> de cabra anti-anticuerpo Pdx1 </td><td> regalo del doctor Christopher Wright </td><td></td></tr><tr><td> anticuerpo de ratón anti Ngn3 </td><td> Células Beta Consorcio de Biología, Univ. de Pennsylvania </td><td> AB2013 </td></tr><tr><td> anticuerpo de ratón anti Nkx6.1 </td><td> Células Beta Consorcio de Biología, Univ. de Pennsylvania </td><td> F64A6B4 </td></tr><tr><td> anticuerpo anti-betacelulina </td><td> Ciencias de la célula </td><td> PAAQ1 </td></tr><tr><td> ALT (SGPT) Color de reactivos. </td><td> Teco Diagnóstico </td><td> A526 - 120 </td></tr><tr><td> AST / (SGOT), punto final color de reactivos </td><td> Teco Diagnóstico </td><td> A561-120 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Reactivos y equipos específicos.

neo-islet formation in liver of diabetic mice by helper-dependent adenoviral vector-mediated gene transfer

La diabetes tipo 1 es causada por células T mediada por la destrucción autoinmune de las células productoras de insulina en el páncreas. Hasta ahora el reemplazo de insulina sigue siendo la terapia principal, porque el trasplante de islotes ha sido limitada por la disponibilidad de donantes y por la necesidad de inmunosupresión a largo plazo. Inducida neogénesis de islotes mediante la transferencia génica de Neuogenin3 (Ngn3), el islote de linaje definir factor de transcripción específico y betacelulina (BTC), un factor de crecimiento de islote tiene el potencial para curar la diabetes tipo 1. Los vectores adenovirales (Ads) son vectores de transferencia de genes altamente eficaz, sin embargo, los anuncios de los primeros generación tienen varias desventajas para uso in vivo. Dependientes de ayudante-Ads (HDAds) son los anuncios más avanzadas que se han desarrollado para mejorar el perfil de seguridad de la primera generación de anuncios y para prolongar la expresión del transgen 1. Carecen de toxicidad crónica por falta de codificación de secuencias virales 2-5 y conservar sólo el anuncio cisENTOS necesarias para la replicación del vector y envasado. Esto permite la clonación de genes hasta 36 kb. En este protocolo, se describe el método para generar HDAD-Ngn3 y Hdad BTC-y para entregar estos vectores en ratones diabéticos STZ inducido. Nuestros resultados muestran que la inyección conjunta de HDAD-Ngn3 y &#39;islotes Neo&#39; HDAD-BTC induce en el hígado y se invierte la hiperglucemia en ratones diabéticos.

Watch this Scientific Journal Video about Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer at JoVE.com

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Se describe hepática neo-islote formación en STZ (estreptozotocina)-ratones diabéticos inducidos por la transferencia de genes de Neurogenin3 (Ngn3) y betacelulina (BTC) usando ayudante dependiente de vector adenoviral (HDAD) y la inversión de la hiperglucemia. Nuestro método tiene ventajas de dependientes helper-vectores adenovirales con su alta eficiencia en la transducción in vivo y la expresión génica a largo duradera.

Neo-Islet Formación en el hígado de ratones diabéticos por Ayudante dependiente de transferencia adenoviral Gene mediada por vector

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Use of a Hanging-weight System for Liver Ischemia in Mice

El uso de un sistema de suspensión de peso para la isquemia del hígado en ratones

Acute liver injury due to ischemia can occur during several clinical procedures e.g. liver transplantation, hepatic tumor resection or trauma repair and ...

Investigación

Medicina

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Establecimiento y propagación de los tumores del retinoblastoma humanos en ratones con deficiencia inmune

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

Transferencia génica para la insuficiencia cardiaca isquémica en un modelo preclínico

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine ...

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Evaluación del vaciamiento gástrico en ratones diabéticos no obesos mediante un [<sup&gt; 13</sup&gt; C]-octanoico prueba del aliento ácido

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used ...

Vascular Gene Transfer from Metallic Stent Surfaces Using Adenoviral Vectors Tethered through Hydrolysable Cross-linkers

Transferencia génica vascular de Stent metálico superficies utilizando Adenoviral Vectores anclada a través hidrolizables reticulantes

In-stent restenosis presents a major complication of stent-based revascularization procedures widely used to re-establish blood flow through critically ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Ligadura del conducto biliar en los ratones: Inducción de la injuria hepática inflamatoria y fibrosis por colestasis obstructiva

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

Funcional hígado humano Conservación y Recuperación de Medios de Subnormothermic máquina de perfusión

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

En Vivo Transferencia génica en el endotelio de la arteria carótida común conejo

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice

Protocolo para crear heridas crónicas en ratones diabéticos

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ...

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Terapia del Gene mediada por vectores lentivirales de hepatocitos Ex Vivo para trasplante autólogo en cerdos

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...